高效液相色譜法綜述

PAGE4高效液相色譜法前言：高效液相色譜法適用的范圍很廣，是非常重要的分析方法之一，它在醫(yī)藥學(xué)及生命科學(xué)中成為一種主要的分離檢測手段。與分離方法的迅速發(fā)展的同時(shí)，檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步也是高效液相色譜技術(shù)得到廣泛應(yīng)用的原因之一。近年來高效液相色譜檢測技術(shù)從最常用的紫外可見分光光度檢測器和差示折光檢測器開始，已經(jīng)發(fā)展了諸如能夠?qū)崟r(shí)定性和定量的二極管陣列紫外可見分光光度檢測器，能夠快速掃描和光譜分辨率更高的色散型紫外可見分光光度檢測器以及適用于生物化學(xué)的電化學(xué)檢測器等。各種聯(lián)用檢測手段如與質(zhì)譜聯(lián)用的熱噴霧和粒子束接口等已日趨成熟，與傅里葉變換紅外光譜和拉曼光譜的聯(lián)用技術(shù)亦在發(fā)展中。各種檢測器的靈敏度、線性范圍、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性等主要指標(biāo)日益提高。許多新的檢測手段已為科技工作者所熟悉和使用。目前比較引人注目和發(fā)展較快的為手性化合物的直接檢測和通用型質(zhì)量檢測技術(shù)。分離原理在互不相溶的兩相——流動相和固定相的體系中，當(dāng)兩相作相對運(yùn)動時(shí)，第三組分（即溶質(zhì)或吸附質(zhì)）連續(xù)不斷地在兩相之間進(jìn)行分配，這種分配過程即為色譜過程。由于流動相、固定相以及溶質(zhì)混合物性質(zhì)的不同，在色譜過程中溶質(zhì)混合物中的各組分表現(xiàn)出不同的色譜行為，從而使各組分彼此相互分離，這就是色譜分析法的實(shí)質(zhì)。也就是說，當(dāng)一種不與被分析物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的被稱為載氣的永久性氣體（例如H2、N2、He、Ar、CO2等）攜帶樣品中各組分通過裝有固定相的色譜柱時(shí)，由于試樣分子與固定相分子間發(fā)生吸附、溶解、結(jié)合或離子交換，使試樣分子隨載氣在兩相之間反復(fù)多次分配，使那些分配系數(shù)只有微小差別的組分發(fā)生很大的分離效果，從而使不同組分得到完全分離，例如一個試樣中含A、B二個組分，已知B組分在固定相中的分配系數(shù)大于A，即KB>KA，如圖1-1所示。

當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱時(shí)，組分A、B以一條混合譜帶出現(xiàn)，由于組分B在固定相中的溶解能力比A大，因此組分A的移動速度大于B，經(jīng)過多次反復(fù)分配后，分配系數(shù)較小的組分A首先被帶出色譜柱，而分配系數(shù)較大的組分B則遲被帶出色譜柱，于是樣品中各組分達(dá)到分離的目的。設(shè)法將流出色譜柱某組分的濃度變化用電壓、電流信號記錄下來，便可逐一進(jìn)行定性和定量分析。一,高效液相色譜法的特點(diǎn)目前經(jīng)典LC主要用于制備,若用于分析則采用脫機(jī)或非連續(xù)檢測。經(jīng)典LC填料缺陷,通常是填料粒度大、范圍寬、不規(guī)則、不易填充均勻、擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力大,譜帶展寬加大。它存在致命弱點(diǎn):速度慢、效率低和靈敏度低。HPLC填料(高效固定相)顆粒細(xì),直徑范圍窄,能承受高壓。達(dá)到傳質(zhì)阻力小,分離效率高。早期HPLC的固定相用涂漬的方法制備,液膜厚度df大,這和GC一樣,會大大降低色譜柱的柱效。現(xiàn)代HPLC填料大多采用鍵合固定相,其固定相膜很薄,因而大大提高了柱效。高效固定相會帶來什么新問題呢？使用高效填料帶來兩個新問題:一是柱流動阻力大大增大,因此需要采用高壓泵輸液；二是表面能很大,要采用專業(yè)的裝柱技術(shù)。高效液相色譜法是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的?，F(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率和實(shí)現(xiàn)了自動化操作。高效液相色譜的原理與經(jīng)典液相色譜相同,但是它采用了高效色譜柱,高壓輸液泵和高靈敏度檢測器。因此，高效液相色譜的分離效率,分析速度和靈敏度大大提高。定量準(zhǔn)確,達(dá)到可與GC相媲美的分離分析性能。特別是結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù),HPLC已成為高度自動化和智能化的現(xiàn)代分析儀器。經(jīng)典的液相色譜法,流動相在常壓下輸送,所用的固定相柱效低,分析周期長,例如柱長170㎝,柱內(nèi)徑0.9㎝,流動相速度30㎝3/h,約需20多小時(shí)才能分離出20種氨氨基酸；而用高效液相色譜法,只需1小時(shí)之內(nèi)就完成。而現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論,流動相改為高壓輸送,色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料(幾微米至幾十微米)填充而成,均勻規(guī)則的固定相、傳質(zhì)阻力小、分離效率高。柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或100幾十萬)，同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器,使分析靈敏度比經(jīng)典色譜有較大提高。例如用紫外檢測器最小檢測限可達(dá)到10-9g，而熒光檢測器則可達(dá)到10-11g。雖然氣相色譜法是一種很好的分離、分析方法，它具有分析速度快,分離效能好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。但是氣相色譜僅能分析在操作溫度下能汽化而不分解的物質(zhì)。據(jù)估計(jì),在已知化合2在線脫氣裝置流動相在使用前必須進(jìn)行脫氣，以除去其中溶解的氣體，防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡的存在會增加基線噪音，嚴(yán)重時(shí)會造成分析靈敏度下降，而無法進(jìn)行分析。在線脫氣裝置把真空脫氣裝置串接到貯液系統(tǒng)中，并結(jié)合膜過濾器，實(shí)現(xiàn)了流動相在進(jìn)入輸液泵前的連續(xù)真空脫氣。3高壓輸液泵對高壓輸液泵的要求是：1.泵體材料能耐化學(xué)腐蝕；2.能在連續(xù)高壓下操作；3輸出流量范圍寬、輸出流量穩(wěn)定、重復(fù)性高。高壓輸液泵可分為恒流泵和恒壓泵；目前在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的也是最重要的輸液泵是往復(fù)泵，往復(fù)泵屬于恒流泵。往復(fù)泵的優(yōu)點(diǎn)是:1．可在高壓下連續(xù)以恒定的流量輸液；2.此泵的液缸容積很小只有幾十至幾百μl，其柱塞尺寸小易于密閉。柱塞、單向閥和閥座造價(jià)低廉，更換溶劑方便，特別適用梯度洗脫。4進(jìn)樣裝置進(jìn)樣分為手動進(jìn)樣和自動進(jìn)樣兩種。手動進(jìn)樣使用的最多的是6通閥進(jìn)樣裝置。先將進(jìn)樣閥置于“取樣“位置，用特制的平頭注射器將樣品注入定量環(huán)中，再將進(jìn)樣閥至于“進(jìn)樣“位置，流動相將樣品攜帶進(jìn)入色譜柱。此種進(jìn)樣重現(xiàn)性好，能耐20Mpa的高壓。自動進(jìn)樣器是由計(jì)算機(jī)自動控制定量閥，按照預(yù)先編制注射樣品的操作程序工作。取樣、進(jìn)樣、復(fù)位、樣品管路清洗和樣品盤的轉(zhuǎn)動，全部按照預(yù)定程序自動進(jìn)行，一次可以進(jìn)行幾十個甚至上百個樣品的分析。自動進(jìn)樣器的樣品量可連續(xù)調(diào)節(jié)，進(jìn)樣重復(fù)性高，適合做大量樣品分析，節(jié)省人力，可實(shí)現(xiàn)自動化操作。5色譜柱高效液相色譜的核心之一是色譜柱，把經(jīng)典液相色譜改造成現(xiàn)代高效液相色譜的重要內(nèi)容之一就是色譜柱的“現(xiàn)代化”，而色譜柱“現(xiàn)代化”的關(guān)鍵內(nèi)容就是制備出高效的填料。近年來的高效填料是使用了小顆粒的無機(jī)氧化物，如硅膠，三氧化二鋁和有機(jī)多孔共聚微球作基質(zhì)。在這些基質(zhì)上鍵合各種化學(xué)基團(tuán)或涂漬各種聚合物，形成各種具有選擇性的高效固定相。這些填料裝成的色譜柱既要有好的選擇性，又要有高的柱效。要提高柱效是現(xiàn)代高效液相色譜的又一重要問題。高效液相色譜柱大致分為3類：內(nèi)徑小于2mm的細(xì)管徑柱；內(nèi)徑在2一5mm范圍的常規(guī)高效色譜柱；內(nèi)徑大于5mm的稱半制備或制備柱。6檢測器評價(jià)檢測器時(shí)，應(yīng)強(qiáng)調(diào)以下幾點(diǎn)：1．噪聲噪聲的存在會降低檢測靈敏度，嚴(yán)重時(shí)使其無法工作。2．基線漂移漂移在較長時(shí)間內(nèi)可觀察到，可以掩蔽噪聲和小峰，影響分析的精度和準(zhǔn)度。3．靈敏度(最小檢出濃度或最小檢出量)靈敏度即指信號與噪聲的比值等于2時(shí)，在單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測器的溶質(zhì)的濃度和質(zhì)量。線性范圍在進(jìn)行定量分析時(shí)，希望檢測器有寬的線性范圍，以便在一次分析中可同時(shí)對主要組分和痕量組分同時(shí)進(jìn)行檢測。4．檢測器的池體積它應(yīng)小于最早流出的死時(shí)間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會產(chǎn)生嚴(yán)重的柱外譜代擴(kuò)展。紫外吸收檢測器是使用最廣泛的一種檢測器，分為固定波長，可變波長和二極管陣列檢測器。實(shí)驗(yàn)中采用的是光電二極管陣列檢測器。光電二極管陣列檢測器是80年代發(fā)展起來的一種新型紫外吸收檢測器，與普通紫外檢測器的區(qū)別在于進(jìn)入流通池的不再是單色光，獲得的信號不是在單一波長上的，而是在全部紫外光波長上的色譜信號。光電二極管陣列檢測器可繪制出隨時(shí)間t的變化進(jìn)入檢測器液流的光譜吸收曲線一一吸光度(A)隨波長入變化的曲線，因而可由獲得的A，入，t信息繪制出具有三維空間的立體色譜圖。7記錄儀和數(shù)據(jù)處理裝置隨著科技的發(fā)展，現(xiàn)在所使用的數(shù)據(jù)記錄和處理的都為色譜工作站，主要功能有：1．自行診斷功能可對色譜儀的工作狀態(tài)進(jìn)行自行診斷，并能用模擬圖形顯示診斷結(jié)果，可幫助色譜工作者及時(shí)判斷儀器故障并予以排除。2.全部操作參數(shù)控制功能色譜儀的操作參數(shù)，如柱溫、流動相流速、流動相比例、最大吸收波長、進(jìn)樣量、運(yùn)行時(shí)間等等都可以預(yù)先設(shè)定，并實(shí)現(xiàn)自動控制。3.智能化數(shù)據(jù)處理和譜圖處理功能可由色譜分析獲得色譜圖，打印出各個峰的保留時(shí)間、峰面積、峰高、半峰寬等等。并可按歸一化法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法等進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。應(yīng)用高效液相色譜法經(jīng)過30年的發(fā)展，在色譜理論研究、儀器研制析實(shí)踐應(yīng)用等方面，已取得長足的進(jìn)步?，F(xiàn)在高效液相色譜法已在和生物工程研究中、制藥工業(yè)研究和生產(chǎn)中、食品工業(yè)分析中、環(huán)石油化工產(chǎn)品分析中獲得了廣泛的應(yīng)用。1生物化學(xué)和生物工程中的應(yīng)用當(dāng)前隨著生命科學(xué)和生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，人們對氨基酸、蛋白質(zhì)等生物分子的研究興趣日益增加。這些生物活性分子是人類過程所必需攝取的成分，因此涉及它們的分離、分析問題也日益重要。高效液相色譜法中的反相色譜法、體積排阻色譜法、親和色譜色譜法都可用于上述多種生物分子的分離和分析。摩爾(Moore)等人提出了用離子交換法分離氨基酸，并發(fā)展成動分析儀。此法利用經(jīng)硫化的陽離子交換柱，可分離20多種氨經(jīng)柱后與茹三酮反應(yīng)，在可見光范圍(57n0m)測定吸光度，從而完定量測定。此法使用的樹脂粒度已由40細(xì)減小至6細(xì)，分析時(shí)間由幾約為h1，此技術(shù)已經(jīng)日趨完善。采用高效液相色譜進(jìn)行氨基酸的分析也已經(jīng)行大量的研究工作，少量氨基酸，如：酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、組氨酸具有紫質(zhì)，可用紫外吸收檢測器吸收外，其他氨基酸皆需在柱前或柱后衍生外吸收或熒光檢測器進(jìn)行測定。在多肽分離中，當(dāng)固定相確定后，常使用具有一定PH值的緩沖液磷酸鹽、甲酸鹽作流動相，且向緩沖溶液中加入鹽(如氯化鈉)的鹽濃度可以減小峰形擴(kuò)散，改善分離度。向流動相中加入改性劑，色譜分離的選擇性。由于肽鍵在紫外光200一220nm具有光吸收特性，因此對大多數(shù)肽都可使用UVD在此波長范圍內(nèi)進(jìn)行測定。若多肽的肽鏈中含有可吸的酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸時(shí)，可直接用254nm檢測，當(dāng)檢測靈敏先進(jìn)行柱前衍生，然后用熒光檢測器檢測。作為生物大分子的蛋白質(zhì)，不僅分子量大，而且它們在溶散系數(shù)比較小、粘度大，易受外界溫度、酸度、有機(jī)溶劑的影響而并引起結(jié)構(gòu)變化。蛋白質(zhì)的上述特性使它們的色譜分離行為遠(yuǎn)離理對實(shí)現(xiàn)它們的HPLC分離帶來了實(shí)際困難。對一般蛋白質(zhì)分子，其分子內(nèi)由疏水側(cè)鏈組成的疏水核心，在面上分布許多親水基團(tuán)，形成表面親水區(qū)，這就是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時(shí)，可使用體積排阻色譜法、離子交換色譜法、反色譜法和親和色譜法。當(dāng)使用反相鍵合相色譜法時(shí)應(yīng)考慮蛋白質(zhì)變蛋白質(zhì)分子接觸到有機(jī)溶劑或吸附在反相固定相時(shí)，會引起變性。若使用中等極性反相鍵合柱，以磷酸鹽的異丙醇一水體系為保持P=H3一7范圍，許多蛋白質(zhì)經(jīng)反相HPLC分離后，仍能保持生物活性。2在醫(yī)藥研究中的應(yīng)用高效液相色譜法由于具有高選擇性和高靈敏度等特點(diǎn)，已成為的有力工具。人工合成藥物的純化及成份的定性、產(chǎn)量測定，中草分的分離、制備及純度測定、臨床醫(yī)藥研究中人體血液和體液中藥藥物代謝物的測定、新型高效手性藥物中手性對映體的測定等等，都需要用到高效液相色譜法來解決。解熱鎮(zhèn)痛藥中主要含有阿司匹林、非那西丁和咖啡因。使用反柱為一BonddapakC18(10μm，3.2mm*150mm)，流動相為38%的已睛的碳酸胺溶液，流量為lml/min，使用紫外吸收檢測器(254nm)，在9分鐘內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)樣品中相關(guān)組分的分離。鎮(zhèn)靜藥中以巴比妥類藥物應(yīng)用最多。巴比妥類是丙二酞脈的衍有鎮(zhèn)靜、催眠、止痛作用。巴比妥類可用反相離子對色譜法分離。為色譜柱為涂布T睛的LIChrOSorbRP一2柱(10μm，3.2mm*150mm相為0.01mol/L四丁基胺，PH=7.7，流量為0.8mL/min，檢測器為紫測器(254nm)。安定藥物是一類中樞神經(jīng)抑制劑，使用最廣泛的是三環(huán)體系安環(huán)體系安定藥可用吸附色譜分離。色譜條件為:色譜柱為Rdaail一(10μm，5mm*100mm)，流動相為含0.01mol/L丁胺的90%甲醇水溶為3.0mL/min，使用紫外檢測器(254nm)。心血管藥有多種類型，其中普魯卡因酞胺為抗心律不齊藥，可用反相色譜分析。色譜條件為：色譜柱為Pxs一1025ODS(10μm，4.6mm*250mm)流動相為40%甲醇一磷酸鹽緩沖溶液，流量為1.0mL/min，使用紫外檢測器(280nm)。3在食品分析中的應(yīng)用近年來高效液相色譜分析法在食品分析中的應(yīng)用日益增多，它析法操作簡便、快速、并能提供更多的有用信息。食品中糖含量是產(chǎn)品質(zhì)量控制的一個指標(biāo)。糖類可分為單糖、糖，它們可使用離子交換色譜或胺基鍵合相柱進(jìn)行分離。色譜條件柱為胺丙基硅膠柱(5μm，4.6mm*250mm)，流動相為75%乙睛水溶液2.moL/min，使用紫外檢測器(188nm)。使用反相鍵合相色譜柱及檢測器也可實(shí)現(xiàn)對淀粉水解產(chǎn)物的單糖和麥芽多糖的分離。4在環(huán)境污染分析中的應(yīng)用高效液相色譜方法適用于對環(huán)境中存在的高沸點(diǎn)有機(jī)污染物的大氣、水、土壤、和食品中存在的多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、有機(jī)氯農(nóng)磷農(nóng)藥，含氮除草劑等等。多環(huán)芳烴是可引起癌癥的有毒物質(zhì)，是環(huán)境監(jiān)測中的重要監(jiān)測環(huán)芳烴可用反相鍵合相色譜柱進(jìn)行分離。色譜條件為：色譜柱為vydacC18(5μm4.6mm*250mm)，流動相為乙睛和水溶液(體積比為40:60)，流量為1.5mL/min，使用可變波長紫外吸收二極管陣列檢測器。當(dāng)樣品中多環(huán)芳烴濃度可以考慮使用熒光檢測器進(jìn)行檢測。5在精細(xì)化工分析中的應(yīng)用在精細(xì)化工生產(chǎn)中所使用的具有較高分子量和較高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物如高碳數(shù)脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，表面活性劑、農(nóng)藥、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品，都可使用高效液相色譜進(jìn)行鄰苯二甲酸醋可用反相鍵合相色譜分離。色譜條件為：MieroPak一CH(10μm，，2.2mm*250mm)，柱溫50℃，流動相為甲醇和水溶比為40:60)。梯度洗脫程序0一10min，以5%/min梯度，增加至90%液，并保持12min。使用紫外檢測器(254nm)。高碳酸脂肪酸也可用反相鍵合相色譜分離。色譜條件為:LiehrosorbRP一8(10μm，4.6mm*250mm)，流動相為含0.1%乙酸的四乙睛+水(體積比為3:67:30)。使用示差折光檢測器。結(jié)論早期色譜法只是一種分離方法，類似于萃取、蒸餾等分離技術(shù)，不同的是分離效率高得多。許多不能或很難用萃取或蒸餾等方法分離的混合物及性質(zhì)極為相近的化合物，都能用色譜法分離。隨著色譜檢測技術(shù)的發(fā)展，色譜法已不僅是一種分離技術(shù)，也是一種分析方法。在色譜流程中，利用物質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)，例如光學(xué)性質(zhì)，電學(xué)性質(zhì)，化學(xué)顯色反應(yīng)或微量自動酸堿滴定等，設(shè)計(jì)各種檢測裝備，對分離組分進(jìn)行連續(xù)檢測。當(dāng)今的色譜法，包括分離和檢測兩個部分，同時(shí)實(shí)現(xiàn)分離和分析，因而通常稱為色譜分析。近30年來，各種色譜方法，如氣相色譜、高效液相色譜、薄層色譜等在化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)及相鄰學(xué)科領(lǐng)域得到