基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實驗醋酸纖維薄膜電泳聚丙烯酰胺等電聚焦電泳分離Hb和cytC

綜合性設(shè)計性實驗-3蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點預(yù)測醋酸纖維薄膜電泳聚丙烯酰胺等電聚焦電泳分離血紅蛋白和細(xì)胞色素C目標(biāo)蛋白的2D電泳分離分析及其生物質(zhì)譜鑒定當(dāng)前第1頁\共有34頁\編于星期五\7點此實驗共包括如下三個部分第一部分，蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點預(yù)測第二部分，醋酸纖維薄膜電泳和等電聚焦電泳第三部分，目標(biāo)蛋白的2D電泳分離分析及其生物質(zhì)譜鑒定當(dāng)前第2頁\共有34頁\編于星期五\7點第一部分，蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點預(yù)測泛素化對于細(xì)胞分化與凋亡、DNA修復(fù)、免疫應(yīng)答和應(yīng)激反應(yīng)等生理過程起著重要作用；磷酸化涉及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化等生理病理過程；糖基化在許多生物過程中如免疫保護(hù)、病毒的復(fù)制、細(xì)胞生長、炎癥的產(chǎn)生等起著重要的作用；脂基化對于生物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程起著非常關(guān)鍵的作用；組蛋白上的甲基化和乙酰化與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用。它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細(xì)，作用更為專一。常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙?；取．?dāng)前第3頁\共有34頁\編于星期五\7點Ezrin蛋白是食管癌細(xì)胞侵襲移動的重要蛋白；活性與非活性狀態(tài)的Ezrin蛋白與F-actin的結(jié)合能力不一樣，對細(xì)胞形態(tài)有重要影響當(dāng)前第4頁\共有34頁\編于星期五\7點甘露糖化修飾預(yù)測：當(dāng)前第5頁\共有34頁\編于星期五\7點當(dāng)前第6頁\共有34頁\編于星期五\7點O位糖基化修飾預(yù)測：當(dāng)前第7頁\共有34頁\編于星期五\7點豆蔻?；稽c預(yù)測：當(dāng)前第8頁\共有34頁\編于星期五\7點乙?；稽c預(yù)測：當(dāng)前第9頁\共有34頁\編于星期五\7點磷酸化位點預(yù)測：

當(dāng)前第10頁\共有34頁\編于星期五\7點以NGAL蛋白為例的磷酸化修飾位點預(yù)測結(jié)果當(dāng)前第11頁\共有34頁\編于星期五\7點電泳的含義

帶電的膠?；虼蠓肿釉谕饧与妶鲋校驇喾措姾傻碾姌O作定向移動的現(xiàn)象稱為電泳。

電泳的應(yīng)用

1.分離各種有機(jī)物：如蛋白質(zhì)、酶、核酸等

2.分析某種物質(zhì)的純度及分子量第二部分，醋酸纖維薄膜電泳和等電聚焦電泳當(dāng)前第12頁\共有34頁\編于星期五\7點電泳的基本原理在電場中，推動帶電質(zhì)點運動的力（F）等于質(zhì)點所帶凈電荷量（Q）與電場強(qiáng)度（E）的乘積。F＝QE質(zhì)點的前移同樣要受到阻力（F）的影響，對于一個球形質(zhì)點，服從Stoke定律，即：F′＝6πrην（r為質(zhì)點半徑，η為介質(zhì)粘度，ν為質(zhì)點移動速度）當(dāng)質(zhì)點在電場中作穩(wěn)定運動時：F＝F′即：QE＝6πrην在同一電泳條件下，不同的物質(zhì)因其分子大?。╮）和帶電量（Q）的差異而具有不同的泳動速度，因此，電泳一定的時間（t）就可互相分離。

EqfqEghnπ6==當(dāng)前第13頁\共有34頁\編于星期五\7點待分離大分子的性質(zhì)：所帶的電荷、分子大小和形狀。分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。電場強(qiáng)度：過高，產(chǎn)熱，蛋白變性導(dǎo)致不能分離；緩沖液水分蒸發(fā)過多，離子強(qiáng)度增加；虹吸現(xiàn)象等。過低，電泳時間增加，擴(kuò)散。當(dāng)需要增大電場強(qiáng)度以縮短電泳時間時，需附有冷卻裝置。電滲：在電場中液體對固體支持物的相對移動；當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時，會加快顆粒泳動速度，反之，當(dāng)兩者方向相反時，會減慢顆粒泳動速度。支持介質(zhì)的篩孔：篩孔越小，則顆粒在移動的過程中所受到的阻力也就越大。緩沖液pH和離子強(qiáng)度：pH值距離其等電點愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大；但是pH過高或過低引起蛋白變性，緩沖液通常要保持一定的離子強(qiáng)度；強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，不易維持PH恒定，離子強(qiáng)度過高，在待分離分子周圍形成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳速度減慢。一般所用離子強(qiáng)度為0.02～0.2之間。電泳的影響因素當(dāng)前第14頁\共有34頁\編于星期五\7點血清蛋白醋酸纖維膜電泳實驗?zāi)康?/p>

掌握醋酸纖維膜電泳的基本原理及其臨床意義熟悉電泳儀器的使用和操作

當(dāng)前第15頁\共有34頁\編于星期五\7點各種電泳技術(shù)在臨床檢測分析方面有重要的作用當(dāng)前第16頁\共有34頁\編于星期五\7點+白蛋白(A)α1α2βγ血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥緩沖液中以負(fù)離子形式存在，并且蛋白質(zhì)的分子量、立體構(gòu)象、等電點以及形狀也有差異，在電場中遷移速度不同，可以在醋酸纖維薄膜上分離成A、α1、α2、β和γ五條區(qū)帶。蛋白名稱等電點分子量白蛋白4.8869000α5.06α1：20000α2：30000β5.1290000-150000γ6.85-7.50156000-300000當(dāng)前第17頁\共有34頁\編于星期五\7點醋酸纖維素（二乙酸纖維素）薄膜具有勻一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，滲透性強(qiáng)，對分子移動無阻力，用它作區(qū)帶電泳的支持物，具有用樣量少，分離清晰，無吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面。醋酸纖維素薄膜經(jīng)1,4－二氧六環(huán)、透明液或液體石蠟處理即透明，因而可得背景為無色的電泳圖譜。醋酸纖維素薄膜的特性當(dāng)前第18頁\共有34頁\編于星期五\7點實驗操作及注意事項膜的預(yù)處理：將薄膜切成2.5×8cm，無光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖液面上，膜條自然浸濕下沉。取充分浸透的膜條，濾紙吸取多余的緩沖液，不要弄太干。加樣：光面用鉛筆標(biāo)注，無光澤面距一端1.5cm處用點樣器蘸取新鮮血清點樣（不能看見有液滴形成），待血清進(jìn)入膜內(nèi)，移開點樣器。電泳：放置于電泳槽架時，無光澤面向下，點樣端置于負(fù)極，膜與電極緊密接觸，不能留有氣泡，平衡5分鐘，通電1h。當(dāng)前第19頁\共有34頁\編于星期五\7點染色：通電完畢，鑷子取出，浸于氨基黑的染色液中5分鐘，立即放入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直至背景漂凈，濾紙吸干，不要太干。定量：取6支試管，編號，分別用吸管吸取0.4NNaOH4ml；剪下膜上各蛋白質(zhì)帶及另一空白部位剪一平均大小的薄膜條（空白帶的寬度以最窄的條帶為準(zhǔn)）。將各條分別浸于上述試管內(nèi)（注意管與蛋白帶的順序），用力搖動，使藍(lán)色洗出，約半小時；用分光光度計進(jìn)行比色，波長650nm，以空白薄膜條洗出液為空白對照，讀取A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。當(dāng)前第20頁\共有34頁\編于星期五\7點6.計算：光密度總和T＝A+α1+α2+β+γ白蛋白％＝A/T×100%α1球蛋白％＝α1/T×100%α2球蛋白％＝α2/T×100%β球蛋白％＝β/T×100%γ球蛋白％＝γ/T×100%當(dāng)前第21頁\共有34頁\編于星期五\7點臨床意義正常值：白蛋白：57～72%α1球蛋白：2～5%α2球蛋白：4～9%β球蛋白：6.5～12%γ球蛋白：12～20%急性肝炎：發(fā)病早期蛋白質(zhì)電泳無變化，發(fā)病兩周后白蛋白、α2及β球蛋白減少，γ球蛋白增高。慢性肝炎：γ球蛋白升高，白蛋白下降較急性肝炎顯著。肝硬化：白蛋白、α1、α2球蛋白均明顯下降，γ球蛋白極度升高，甚至A/G比值倒置。腎病綜合征時，白蛋白降低，α2、β球蛋白升高。當(dāng)前第22頁\共有34頁\編于星期五\7點聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)等電聚焦電泳分離血清蛋白的原理學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺作為電泳介質(zhì)的優(yōu)點及用途了解等電聚焦電泳和普通聚丙烯酰胺電泳的異同當(dāng)前第23頁\共有34頁\編于星期五\7點以聚丙烯酰胺作為支持物，兩性載體電解質(zhì)在支持物內(nèi)形成穩(wěn)定的pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在電場力的作用下，便會在支持物中運動到相當(dāng)與自身pI的位置中聚合成一狹窄的區(qū)帶而停留下來。實驗原理當(dāng)前第24頁\共有34頁\編于星期五\7點聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰（Acrylamide,Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylamide,Bis）在催化劑作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠的特點：機(jī)械彈度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高及無電滲等。聚丙烯酰胺凝膠兼有電泳和分子篩的雙重作用，分辨率高。當(dāng)前第25頁\共有34頁\編于星期五\7點等電聚焦電泳蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。在電場存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負(fù)極移動而帶負(fù)電的蛋白分子將向正極移動，在某一pH時，蛋白分子在電場中不再移動，此時的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點。等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。兩性電解質(zhì)－Ampholine(由瑞典LKB公司生產(chǎn))它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體和同系物組成的,pH范圍，4-6.5，5-8，。當(dāng)前第26頁\共有34頁\編于星期五\7點在沒有電場時,載體兩性電解質(zhì)溶液的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值(如pH3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液，其pH約為6.5左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷，只是在溶液中的正電荷和負(fù)電荷數(shù)目相等，凈電荷為零。引入電場時，載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽極移動，最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移，在凝膠內(nèi)制造一個pH梯度。每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI相一致的pH處。等電聚焦電泳進(jìn)行過程中等電聚焦電泳結(jié)束后（＋）（＋）（－）（－）低pH高pH載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點位置時，其靜電荷數(shù)為零，在電場中不再移動，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。當(dāng)前第27頁\共有34頁\編于星期五\7點實驗操作及注意事項1.凝膠配制：取10×0.5cm內(nèi)徑的玻璃管，選擇底部較齊平的一端用橡皮片封底（用兩條橡皮圈扎緊），從一端量出7cm作好標(biāo)記，垂直放置。按下表配制聚丙烯酰胺凝膠，見下頁注意事項：a.按表中的順序加入試劑，并搖勻。b.TEMED最后加，注意混勻。TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。c.將長滴管及時清洗當(dāng)前第28頁\共有34頁\編于星期五\7點試劑數(shù)量（ml）蒸餾水7.0AcrBis240%Ampholine0.2樣品：人Hb和CytC混合物（1mg/ml）4滴10％過硫酸銨0.15TEMED5μl總量9.35按下表配制聚丙烯酰胺凝膠用長滴管汲取配置好的凝膠液，沿玻璃管傾斜緩慢注入到7ml標(biāo)記平面，避免產(chǎn)生氣泡。立即用5ml注射器針頭沿玻璃壁內(nèi)側(cè)面緩慢加入0.5cm高度的蒸餾水，加時貼近凝膠，盡量減少膠面與水相混和。加蒸餾水的目的除了隔離空氣中的氧外，還能消除液柱表面的彎月面，使凝膠液面平坦。然后垂直靜置待其聚合。當(dāng)前第29頁\共有34頁\編于星期五\7點2.電泳將已聚合的凝膠去除水層，凝膠端加2％氫氧化鈉消除凹面，垂直插入電泳槽中的橡皮管中；在電泳槽中的上槽注入0.2％硫酸或5％磷酸，下槽注入0.4％乙醇胺或2％氫氧化鈉。加完電極液后，要仔細(xì)檢查凝膠管上下口內(nèi)有無氣泡，如有必需排除，否則影響導(dǎo)電；上槽接正極，下槽接負(fù)極，電壓50V，預(yù)電泳30分鐘，然后將電壓維持在200-300V，1-2小時；電泳結(jié)束后，取下玻璃管；當(dāng)前第30頁\共有34頁\編于星期五\7點剝膠用帶有針頭的注射器吸入蒸餾水，將針頭插入凝膠與玻璃管壁之間，邊旋轉(zhuǎn)邊注水，使針頭慢慢旋轉(zhuǎn)前進(jìn)?？克鲏毫蜐櫥饔脤⒉ＡЧ軆?nèi)壁與凝膠分開，最后可用洗耳球在玻璃管的一端輕輕加壓，就可將凝膠從玻璃管內(nèi)壓出，凝膠盛于培養(yǎng)皿中。測定樣品pI方法一：直接用PH試紙插入所需測定的蛋白區(qū)帶中，此法雖然十分方便，但較為粗略。方法二：將所需測定的蛋白區(qū)帶用刀片切下，置于5ml蒸餾水的小燒杯中，經(jīng)常攪拌，4小時后用PH計測其pI。當(dāng)前第31頁\共有34頁\編于星期五\7點第三部分，目標(biāo)蛋白的2D電泳分離分析及其生物質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式為研究對象。人類基因組計劃已基本完成，隨著后基因組時代的到來，蛋白質(zhì)組學(xué)得到了空前的發(fā)展，蛋白質(zhì)組研究旨在揭示基因表達(dá)的真正執(zhí)行生命活動的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)規(guī)律和生物功能。2D電泳可用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾研究、蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用、細(xì)胞分化凋亡研究、致病機(jī)制及耐藥機(jī)制的研究、療效監(jiān)測、新藥開發(fā)、癌癥研究、蛋白純度檢查、小量蛋白純化、新替代疫苗的研制等許多方面。蛋白質(zhì)組學(xué)已成為當(dāng)今生物領(lǐng)域中極其活躍的學(xué)科。其中雙向電泳(TwoDimensionalElectrophoresis，2DE)