辣椒種質資源抗青枯病的鑒定與評價

黨峰峰;雷玉芬;官德義;王再興;何水林【摘要】Resistantlevelsofresistantpeppercultivar(76a)andsusceptiblepeppercultivar(TW-1)plantswereevaluatedafterinfectionwithRalstoniasolanacearumFJC100301underdifferenttemperatures,concentrationsandmethodsofinoculation.Theresultsshowedresistantidentificationofpepperplantsgrowninagrowthroomat28°Candinfectedwith3x108cfu?mL-1R.solanacearumsuspensionthroughroot-soakingat20min.Resistantwasidentifiedandevaluatedinpepperplantsgrowninthefieldafterinoculationwith3x108cfu?mL-1R.solanacearumsuspensionthroughroot-soakingat20mininearlyMay.Atotalof106peppercultivarsweretestedinthefieldafterinfectionwithR.solanacearumFJC100301.Diseaseindexeswerescoredevery10day.Meanwhile,standardsofresistantlevelsweredividedinpepper.Theresultsshowedhighresistancein14peppercultivars,resistancein8peppercultivars,moderateresistancein23peppercultivars,moderatesusceptibilityin23peppercultivars,susceptibilityin20peppercultivars,andhighsusceptibilityin18peppercultivars.ThesameresultswereobtainedinseveralhighresistanceandhighsusceptibilitypepperinbredcultivarsthroughleafinoculationwithRalstoniasolanacearuminvitro.%采用青枯菌FJC100301菌株對田間辣椒(Capsicumannuum)抗病品種76a和感病品種TW-1分別作了不同溫度、不同接種量和不同接種方法的接種試驗.結果表明，辣椒青枯病抗性的室內鑒定以接種溫度28匚浸根20min和3x108cfu/mL接種濃度為宜;辣椒種質田間抗青枯病接種鑒定宜選擇5月上旬進行，浸根20min,接種濃度為3x108cfu/mL.采用田間抗性接種鑒定的方法，用青枯菌FJC100301菌株對106份辣椒材料進行了抗性鑒定.田間接種后每隔10d統(tǒng)計病情指數(shù)，劃分辣椒抗青枯病鑒定分級標準，獲得了高抗材料14份、抗病材料8份、中抗材料23份、中感材料23份、感病材料20份、高感材料18份;采用離體葉片接種法對田間篩選得到的高抗和高感純度較高品種進行抗性分析，結果與田間鑒定一致.【期刊名稱】《植物科學學報》【年(卷)，期】2013(031)004【總頁數(shù)】7頁(P378-384)【關鍵詞】辣椒;青枯菌;種質資源;鑒定;評價【作者】黨峰峰;雷玉芬;官德義;王再興;何水林【作者單位】福建農林大學生命科學學院，福州350002;福建農林大學作物遺傳改良和綜合利用教育部重點實驗室福州350002;福建農林大學生命科學學院福州350002;福建農林大學作物科學學院福州350002;福建省惠安縣農業(yè)科學研究所,福建惠安362100;福建農林大學生命科學學院，福州350002;福建農林大學作物遺傳改良和綜合利用教育部重點實驗室，福州350002【正文語種】中文【中圖分類】S641.303.3辣椒是一種重要蔬菜，典型的茄科忌連作植物。我國南方辣椒生產常因青枯菌等土傳病害而減產甚至絕收［1,2］。青枯菌(Ralstoniasolanacearum，青枯雷爾菌），是一種世界范圍內的重要土傳性病害，可浸染300多種植物，甚至在許多非寄主植物的根部也有發(fā)現(xiàn)［3］。據發(fā)現(xiàn)至今150多年間，沒有一種農藥可有效控制青枯病的發(fā)生，所以稱其為〃植物里的癌癥”［4］。我國有關辣椒抗青枯病室內活體或離體、田間鑒定和分級標準的報道較少，大部分集中在辣椒疫?。?,6］。因此，確定辣椒品種抗青枯病的實驗室與田間抗性接種方法和發(fā)病分級標準，對于加快辣椒與青枯菌互作的分子機制研究、抗病品種的選育與推廣具有重要意義。1材料與方法1.1試驗材料1.1.1植物材料辣椒（Capsicumannuum）品種76a、TW-1、寧優(yōu)6-2-4、65-5-B、31-2-a、52-5-2純、桂-1-3純、126-1、68-4、55-2-5、6-1-1單、22-1-3、83B-2x18-1、26-4x42-4、87-2-1、HN大紅-2-3、140-2、154-2、136-3-1等107份材料，均為福建農林大學蔬菜生物技術與遺傳改良課題組提供。1.1.2菌株青枯菌（Ralstoniasolanacearum）菌株FJC100301，于2010年從福建省福清市的辣椒青枯病典型病株中分離獲得。菌種保存在無菌水中，分別存放于20OC和常溫下。使用時移到PSA（馬鈴薯200g,蔗糖20g,牛肉浸膏3g，蛋白腺5g,瓊脂粉12g,雙蒸水1L）斜面上，28C培養(yǎng)24h,加1mL無菌水懸浮，無菌條件下倒入150mLPSA液體培養(yǎng)基中，28C震蕩培養(yǎng)36h,備用［7］。1.2試驗方法1.2.1接種溫度試驗試驗于2010年4-5月在福建農林大學現(xiàn)代設施農業(yè)3號樓溫室進行，參試辣椒材料為76a和TW-1。供試辣椒材料均按常規(guī)方法栽培，當植株生長至10葉期，設置25°C、28°C、35°C、室溫（30C維持6h,其他時間24°C~32°C）和玻璃房（37°C維持6h，其它時間28^~38。0等5個不同處理溫度進行接種。接種采用針注法，菌液濃度為3x108cfu/mL（cfu,colonyformingunits，菌落形成單位）。試驗設置3個重復，每個重復每個辣椒材料15株苗。1.2.2接種方法試驗參試材料為76a和TW-1，當辣椒生長進入10葉期，分別采取灌根、浸根、刺莖、剪葉和針注等方法進行接種方法試驗。灌根:將打孔器（直徑1.4cm）靠近植株基部插入土中，隨后每株澆灌菌液10mL;浸根:將10葉期的辣椒植株連根拔起，洗凈后浸入菌液20min，取出移栽;刺莖（針刺）:在植株頂芽下第5或6片葉的葉腋間滴1滴菌液，用細針穿過菌液垂直方向刺入莖部;剪葉:用沾過菌液的剪刀從辣椒植株頂芽下第5或6片葉的葉尖橫切剪去1/5;針注:于植株頂芽下第5或6片葉背的葉脈，用微量注射器（10"）將菌液注射到葉片細胞間隙，所用菌液濃度均為3x108cfu/mL（OD600=0.8）。每個品種做3個重復，每個重復含15株辣椒苗[8]。1.2.3接種濃度試驗參試材料為76a和TW-1，當辣椒生長進入10葉期，采用浸根法，菌液濃度設置為3x107、3x108、5x109cfu/mL3個濃度進行接種。試驗設置3個重復，每個重復每個辣椒材料15株苗。1.2.4田間抗性接種鑒定試驗于2010年5月10日-7月4日在福建省惠安縣農業(yè)科學研究所試驗田內進行，參試材料為76a、寧優(yōu)6-2-4、65-5-B和31-2-a等106份（除TW-1，下同）辣椒材料，接種采用浸根法（取苗前半小時，先用水澆濕育苗畦）。試驗設3個重復，各小區(qū)按隨機排列，每個小區(qū)6棵辣椒苗。1.2.5病情調查根據不同試驗要求，從發(fā)病初始起每隔5d調查1次。實驗室發(fā)病始期為接種后7d，田間為接種后10d。辣椒品種實驗室病情分級標準，以煙草種質資源抗青枯病分級標準為基本依據［8］；田間病情分級標準，以參試辣椒材料（106份）接種后10d青枯病抗性水平為依據，結合其它作物（如煙草［8］等）種質資源抗青枯菌鑒定篩選病情分級標準，劃分辣椒種質資源抗青枯病分級標準和抗性評價標準。病情分級標準為，0級:辣椒植株正常，無病;1級:辣椒植株輕微枯萎，基部1~2片葉子枯萎，頂端正常;2級:辣椒植株葉片除頂端部位外，1/2的葉片枯萎，頂端正常（注:抗病鑒定過程中，辣椒植株基部正常，上部分葉片1~2片枯萎，也規(guī)為2級）;3級:辣椒植株葉片除頂端部位外，2/3的葉片枯萎，頂端正常;4級:辣椒植株葉片大部分發(fā)生枯萎，頂端葉片開始發(fā)生枯萎;5級:辣椒植株整株頂端大部分發(fā)生枯萎，或者植株死亡（詳見圖1）。抗性評價標準為，高抗（highresistance,HR）:0.0~15.0（病情指數(shù)，下同）;抗（resist-ance,R）:15.1~30.0;中抗（moderateresistance,MR）:30.1~50.0;中感（moderatesusceptibility,MS）:50.1~70.0;感（susceptibility,S）:70.1~85.0;高感（highsusceptibility,HS）:85.1~100.0。1.2.6離體鑒定方法根據田間調查結果，選用高抗（76a和寧優(yōu)6-2-4）和高感（65-5-C,68-4和桂-1-3純）辣椒品種進行離體鑒定。待植株生長至10葉期時，取頂芽下第5或6片葉，進行離體抗病性鑒定。采集離體葉片，用無菌水清洗2次，75%酒精消毒2min,再用無菌水清洗2次，之后浸沒于濃度為3x108cfu/mL青枯菌菌液中2min,取出放置于0.5%瓊脂平板上，于28°C±2°C下培養(yǎng)，光照強度為60~70pmol-m-2-s-1,光暗周期為16h/8h［9］o圖1辣椒種質資源抗青枯病抗源篩選病情分級標準Fig.1DiseasestandardsofresistancelevelsinselectionofresistantresourcesofRalstoniasolanacearuminpepper2結果與分析2.1辣椒青枯病抗性鑒定的因素2.1.1溫度參試的辣椒76a和TW-1的10葉期植株在不同溫度（25°C、28°C、35°C、室溫和玻璃房）下進行青枯菌接種測定。結果表明（圖2）,在接種后第8、13、18d,28C下的辣椒76a和TW-1品種病情指數(shù)都達到最高，同時辣椒76a與TW-1品種間病情指數(shù)存在顯著性差異，可看出76a較抗青枯病，TW-1易感青枯病，與辣椒76a和TW-1材料在田間自然病圃中的發(fā)病情況相吻合，即76a較抗青枯病，TW-1感病。2.1.2接種方法采用浸根、剪葉、針刺、針注和灌根等5種接種方法，在28C下分別進行辣椒抗青枯病接種試驗，結果表明（圖3）,使用針刺、針注和灌根接種，在接種后第8、13、18d，辣椒76a和TW-1發(fā)病病情指數(shù)均存在顯著性差異。采用針注法接種時TW-1品種表現(xiàn)出較高的病情指數(shù)。采用不同的接種方法時，76a和TW-1在接種后13d和18d發(fā)病病情指數(shù)均表現(xiàn)出顯著性差異，其中TW-1品種浸根接種病情指數(shù)高于灌根接種，而低于針刺和針注接種。2.1.3接種濃度圖2不同溫度對辣椒76a和TW-1品種（10葉期苗）青枯菌接種測定的影響Fig.2EffectsofdifferenttemperaturesweretestedafterinoculationwithRalstoniasolanacearuminresistantlevelsof76aandTW-1peppercultivars橫坐標上的1、2、3、4、5分別表示各種溫度:25°C、28°C、35°C、室溫和玻璃房。數(shù)值來源于3組，每組5株。誤差線代表標準誤，Student-Newman-Keuls檢驗，星號表示顯著性差異（*p<0.05;**pv0.01）。下同。Thenumber1,2,3,4and5ofabscissarepresentsthedifferenttemperatures25°C,28°C,35°C,roomtemperatureandglasshouseinfigure,respectively.Valuesbasedon3groups,eachgroupwith5plants.Errorbarsindicatestandarderror;AsterisksindicatesignificantdifferencesasdeterminedbyStudent-Newman-KeulsTest(*p<0.05;**p<0.01).Thesamebelow.圖3不同接種方法對辣椒76a和TW-1品種青枯菌接種測定的影響Fig.3EffectsofdifferentinoculationmethodstestedafterinoculationwithRalstoniasolanacearuminresistantlevelsof76aandTW-1peppervarieties橫坐標上的1、2、3、4、5分別表示不同接種方法:浸根、剪葉、針刺、針注和灌根。Thenumber1,2,3,4and5ofabscissarepresentsthedifferentinoculationmethodsroot-soaking,leaf-cutting,needling,syringeinjectionandroot-irrigationinfigure,respectively.于28C下，采用3種菌液接種濃度(3x107、3x108、5x109cfu/mL)對參試的辣椒76a和TW-1苗期植株進行青枯菌接種測定。結果表明(圖4),在接種后第8、13、18d，隨著青枯菌接種量的增加，辣椒76a和TW-1品種發(fā)病變得嚴重，并且品種之間存在顯著性差異。根據田間自然病圃發(fā)病分析，辣椒栽培品種76a和TW-1，分別為青枯菌抗病和感病品種。通過在不同接種溫度、不同接種方法和不同接種濃度下進行辣椒76a和TW-1品種青枯菌接種測定，結果顯示進行辣椒種質資源青枯菌抗病性鑒定，較優(yōu)的接種方式為:浸根20min，菌液濃度3x108cfu/mL，于28C培養(yǎng)。鑒于此，在田間進行辣椒種質資源抗青枯病抗性篩選中，可采用辣椒10葉期幼苗、浸根20min、菌液濃度3x108cfu/mL進行鑒定。2.2辣椒種質資源抗青枯病抗源篩選通過分析從2010年5月2日-6月9日共5次辣椒品種抗青枯病接種鑒定統(tǒng)計數(shù)據，以2010年5月30日調查結果為基準，結合其余4次調查結果，初步選擇出抗感材料，按抗性水平劃分為高抗、抗、中抗、中感、感、高感幾種材料(表1)。2.3田間抗病鑒定與室內抗病鑒定的結果比較圖4不同接種濃度對辣椒76a和TW-1品種青枯菌接種測定影響Fig.4EffectsofdifferentconcentrationstestedafterinoculationwithRalstoniasolanacearuminresistantlevelsof76aandTW-1peppervarieties橫坐標上的1、2、3分別表示不同接種濃度:3x107、3x108、5x109cfu/mL。Thenumber1,2and3ofabscissarepresentsthedifferentconcentrations3x107,3x108and5x109cfu/mLinfigure,respectively.表1106份辣椒種植資源青枯病抗性分析Table1Analysisofresistancelevelsofbacterialwiltin106peppercultivars抗性水平Resistancelevels數(shù)量Count品種名稱Cultivarsname高抗(HR)14寧優(yōu)6-2-4,31-2-a,79-5x18-1,SE,79-5x18-1,52-5-2純，39-2-a-1,136-3,65-5-B,76a，寧優(yōu)6-1x18-1,64-5純牛，83B-2x18-1,55-2-2-2抗(R)851-5-1,52-3-1,186-4,552-2-8-2泡椒，79-5x62-2-1,87-2-1,52x61,39-1-a單中抗(MR)2312-12,65-5-B純，78-1-1單純，66-2-1,76B-2-a,79-5x62-2-1,140-2,622-2純，寧優(yōu)6-1x62-2-1,140-1，寧優(yōu)6-2純，136-3-1,154-1-1,83B-2x62-2-1,5-1-2,55-2-7,96-3-1,4x76,55-2-2-1,133-2-3，寧優(yōu)6-3-2,金B(yǎng)-1，寧優(yōu)6-2-1中感(MS)23187-1,68-3-5單，26-4x18-1,187-3,2-3純，26-4x42-4,HN大紅-2-3,63-3-1純，83B-2x68-2,52d純，HN大紅-1x90-1,HN大紅-1x62-2-1,HN大紅-1x90-1,AVR，寧優(yōu)6-1x90-1,154-4,83B-2x90-1,26-4x90-1,42-3-1單，188-1混，26-4x68-2,83-2,65-5-E感(S)2071-b-1高感(HS)1830-1-2,79-5,83B-2x42-4,HN大紅-1x68-2,126-1,76B-2-C-1,154-2,HN大紅-1x42-4,188-1-1混，154-2,55-2-5,68-4,174（雜）-4單，65-5-c,174-10-1-1,桂-1-3純，168-3,64-2,1-1單，HN大紅-3-2,HN大紅-1-1,4-2純，79-5x42-4,42-4-2單，寧優(yōu)6-1x42-4,96-2-1,79-7-c,18-2-3，寧優(yōu)6-1盆栽單株單果，12-4,7a-a,79-5x90-1，寧優(yōu)6-1x63-2,79-6-2,65-B-1純，126-1單，68-3-1對田間抗病鑒定中分別表現(xiàn)為對FJC100301高抗（76a和寧優(yōu)6-2-4）和高感（65-5-C、68-4和桂-1-3純）的材料進一步進行室內接種離體抗青枯病接種鑒定。結果表明（圖5）,在接種后15d，高感材料65-5-C、68-4和桂-1-3純出現(xiàn)了很明顯的青枯病發(fā)病癥狀，而高抗材料76a和寧優(yōu)6-2-4僅表現(xiàn)出較輕微的青枯病發(fā)病癥狀，這一結果與田間抗性接種鑒定結果高度一致。3討論辣椒青枯病在高溫高濕下發(fā)病嚴重，是我國廣大辣椒產區(qū)，特別是南方辣椒產區(qū)發(fā)生較為嚴重的病害之一。篩選獲得辣椒抗病育種材料是有效開展辣椒抗青枯病遺傳改良的重要前提，而辣椒抗青枯病鑒定方法的建立則是篩選獲得辣椒抗青枯病遺傳資源的重要基礎。辣椒青枯?。╬epperbacterialwilt）主要從辣椒根部傷口侵入，發(fā)病初期頂端葉片中午萎焉，早晚恢復，隨后下中部葉片凋萎，數(shù)天后整株急劇萎焉，但葉片仍為綠色，呈現(xiàn)青枯癥狀，同時病株基部及根部維管束出現(xiàn)變褐等癥狀。辣椒抗青枯病室內鑒定，中華人民共和國農業(yè)部公布的辣椒抗青枯病鑒定技術規(guī)程（標準號:NY/T2060.2-2011），采用傷根灌根接種法進行室內鑒定。此方法對于辣椒品種審定、抗感材料確定和少量資源篩選，具有較強的操作性和較高精確性。但在大量辣椒資源抗性篩選中，如采用灌根室內鑒定，條件要求較高，操作性較差。如采用灌根田間鑒定，勢必大量增加鑒定田圃夕卜來青枯菌含量，破壞農田。對于辣椒與青枯菌互作分子機制研究，在病毒誘導基因沉默和瞬間超表達基礎上，進行特定葉片離體鑒定，灌根接種法也不適用。因此，我們在相關研究基礎上，采用浸根方法進行辣椒種質資源田間抗源篩選，降低了對田圃的損壞，結合離體葉片鑒定進一步確認高抗和高感材料。離體葉片抗病性鑒定，在確認篩選抗源基礎上，對辣椒與青枯菌互作分子機制研究，提供了可行的方法。同時，可以更加直觀觀察到辣椒生長期過程中田間青枯病的發(fā)病情況，掌握更多相關抗源材料信息，對尋找合適時間點進行青枯病防治提供了信息。浸根法不足之處是，對田圃選擇要求較高，適合于我國南方青枯病多發(fā)地區(qū)。北方地區(qū)則存在較高難度。同時，需要結合當?shù)乩苯纷匀簧L期，模擬辣椒田間發(fā)病時間段，選擇高溫高濕環(huán)境進行鑒定。圖5接種后15d，部分田間篩選的辣椒品種抗源抗性確定Fig.515daysafterinoculation，resistancelevelswereconfirmedinpartofresistancesourcesofpepperA:高感材料65-5-C出現(xiàn)嚴重的青枯病病癥;B:高感材料68-4出現(xiàn)嚴重的青枯病病癥;C:高感材料桂-1-3純出現(xiàn)嚴重的青枯病病癥;D:高抗材料76a出現(xiàn)輕微的青枯病病癥;E:高抗材料寧優(yōu)6-2-4出現(xiàn)輕微的青枯病病癥。A:HScultivar65-5-Cshowsserioussymptomsofbacterialwilt;B:HScultivar68-4showsserioussymptomsofbacterialwilt;C:HScultivarGui-1-3chunshowsserioussymptomsofbacterialwilt;D:HRcultivar76ashowsminorsymptomsofbacterialwilt;E:HRcultivarNingyou6-2-4showsminorsymptomsofbacterialwilt.結合相關研究及本研究結果，我們認為在辣椒抗青枯病鑒定中，凡涉及辣椒品種審定、抗感材料確定和少量資源篩選，可選擇傷根灌根接種和離體葉片鑒定相結合的方式;凡涉及大量辣椒抗源篩選，可選擇浸根方式進行田間抗源篩選;而有關辣椒與青枯菌互作分子機制研究，則以針注和離體葉片鑒定相結合的方式為好。在我國南方辣椒產區(qū)，可選擇高溫高濕天氣青枯病頻發(fā)的5月份進行田間接種鑒定，選擇時間過早，辣椒青枯病不易發(fā)病，過遲，辣椒則不易移栽成活。同時在辣椒植株生長期要嚴防辣椒疫病發(fā)生。從本研究結果來看，田間發(fā)病統(tǒng)計結果顯示，接種后10d開始統(tǒng)計，每隔5d統(tǒng)計1次，在接種后20d，辣椒整體發(fā)病趨于穩(wěn)定。辣椒青枯病感染部位主要是根莖，受害部位主要是葉片。病情分級以葉片受害程度為主，可結合考察黑色條斑在辣椒莖部的擴展情況。在品種抗性評價標準上，應縮小高抗高感范圍。我們在對辣椒種質資源青枯病抗性鑒定中，確定了抗性鑒定方法、病情分級標準和品種抗性評價標準。對實驗室保存的辣椒種植資源進行了抗病性鑒定，篩選獲得了一批抗病和感病材料，為辣椒抗青枯病育種奠定了基礎，還進一步研究辣椒與青枯菌互作分子機制，為開發(fā)分子標記提供了重要材料。本研究結果為辣椒等茄科抗青枯病抗源篩選提供了參考。致謝:感謝福建農林大學方樹民教授在青枯病病株樣本收集、辣椒種質抗青枯菌實驗室與田間抗性接種方法、辣椒青枯病發(fā)病分級標準中的指導。參考文獻：[1]WangYN,DangFF,LiuZQ,WangX,EulgemT,LaiY,YuL,SheJJ,ShiYL,LinJH,ChenCC,GuanDY,MouSL,HeSL.CaWRKY58,encodingagroupIWRKYtranscriptionfactorofCapsicumannuum,negativelyregulatesresistancetoRalstoniasolanacearuminfection[J].MolPlantPathol,2013,14(2):131-144.[2]DahalD