PCR引物及雜交探針設(shè)計

PCR引物及雜交探針設(shè)計

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火（復(fù)性）--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至90~95℃一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至50～60℃，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于70～75℃，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。（230=1073741824）PCR反應(yīng)五要素：引物酶dNTP模板緩沖液（其中需要Mg2+)PCR引物的設(shè)計原則1.引物應(yīng)用模板核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。2.引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段，產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。3.引物長度一般在15~30堿基之間。4.G+C含量在40%~60%之間。5.堿基要隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。6.引物自身不能有連續(xù)4個堿基以上的互補(bǔ)。7.引物之間不能有連續(xù)4個堿基以上的互補(bǔ)。8.引物5′端可以修飾。9.引物3′端不可修飾。PCR引物區(qū)域選擇實時定量RT-PCR實時定量PCR原理所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。1.TaqMan熒光探針:PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變(SNP)，有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。2.SYBR熒光染料:在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo):是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。根據(jù)mRNA序列設(shè)計RT-PCR引物1、引物和探針的特異性2、引物擴(kuò)增的效果3、擴(kuò)增產(chǎn)物在mRNA的位置4、能否鑒別基因組DNA的污染數(shù)據(jù)庫查詢RT-PCR引物方法GenScriptReal-timePCR(TaqMan)PrimerDesignHttps:///ssl-bin/app/primer/primerbank/DNA甲基化特異性PCR引物設(shè)計亞硫酸氫鈉修飾DNA的目的是將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不變。MSP需要特殊要求：1、甲基化引物、非甲基化引物。Tm差異不能太大。2、甲基化引物和非甲基化引物帶有至少一個CpG序

列，越多甲基化位點越好。至少有一個CpG序列在引物3’端。最好設(shè)計一對野生型引物來驗證模板。

3、M和U同時出現(xiàn)條帶，說明這個甲基化位點是半甲基化的，或者你的模板沒修飾完全。

4、MSP的可靠性，最終還是要用測序來確定。miRNA引物設(shè)計由于miRNA序列較短；由于miRNA存在成熟和頸環(huán)序列；用實時定量PCR檢測生物樣品中某種miRNA含量引物設(shè)計是比較特殊的；首先，需完成miRNA逆轉(zhuǎn)錄；然后，進(jìn)行擴(kuò)增。1、Oligod(T)特異的RT引物

（QIAGEN產(chǎn)品為主）由特異序列＋(T)20左右＋兼并堿基V或VN組成。但是RNA在反轉(zhuǎn)錄前需要進(jìn)行末端Poly(A)加尾，所有miRNA可以公用一個Oligod(T)的RT引物，該引物含有一段PCR引物。另外一條引物3'端含有6-8個目標(biāo)miRNA5'端堿基序列，再加一段隨機(jī)序列，以確保引物的Tm值在60℃左右。2、莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT引物

（ABI產(chǎn)品為主）由可以自身呈環(huán)莖狀的特異序列＋6到8個miRNA3’端反向互補(bǔ)堿基組成。(一條miRNA序列特異對應(yīng)一個莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT引物）。另外一條引物3‘端含有6-8個目標(biāo)miRNA5'端堿基序列，再加一段隨機(jī)序列，以確保引物的Tm值在60℃左右。美國signosis公司的一種新方法美國Signosis開發(fā)了一種高靈敏、高分辨的實時PCR方法，用于檢測miRNA的表達(dá)，其應(yīng)用寡核苷酸連接和基于實時PCR的SYBRgreen熒光染料。該方法可用于總RNA或細(xì)胞裂解物中的miRNA表達(dá)的定量分析，無需進(jìn)行cDNA