細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查第一頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三目錄1、實(shí)驗(yàn)原理2、實(shí)驗(yàn)試劑3、試驗(yàn)器具4、檢查方法概述5、供試品溶液的制備6、內(nèi)毒素限值的確定7、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定8、鱟試劑靈敏度復(fù)核9、干擾試驗(yàn)10、供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查第二頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三實(shí)驗(yàn)原理利用鱟試劑與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。陽性結(jié)果細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。第三頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三實(shí)驗(yàn)試劑鱟試劑從海洋無脊椎動(dòng)物“鱟”的藍(lán)色血液中提取的變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥精制而成的生物制劑。鱟試劑的生物活性以其能檢出細(xì)菌內(nèi)毒素的最低有效濃度表示，即鱟試劑的靈敏度，單位為EU/ml。當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。第四頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三實(shí)驗(yàn)試劑細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制得到的內(nèi)毒素，用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)定，仲裁鱟試劑靈敏度。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品

系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽性對照。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法）且對內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用的滅菌注射用水。第五頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三試驗(yàn)器具

刻度吸管、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小試管（16×100mm）、試管架、洗耳球、封口膜或金屬試管帽、時(shí)鐘、脫脂棉、吸水紙、剪刀砂輪。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、30分鐘以上）去除，塑料用具應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗(yàn)無干擾的器械（目前多為無熱原的一次性用品）。第六頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三檢查方法概述凝膠法

限量試驗(yàn)半定量試驗(yàn)光度測定法

濁度法（終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法）顯色基質(zhì)法（終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法）凝膠法：最簡單、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用最廣泛，中國藥典的“仲裁”方法對干擾相對不敏感。較光度測定法不靈敏第七頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三供試品溶液的制備

某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。第八頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三內(nèi)毒素限值的確定一般按公式：L=K/M

式中

L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示。

K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量。注射劑K=5EU/（kg·h），放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kg·h），鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/（kg·h）。

M為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，依據(jù)藥品使用說明書，《臨床用藥須知》確定。例：某產(chǎn)品M為14.3mg/kg，L=5/14.3=0.35EU/mg

假如此產(chǎn)品的濃度為100mg/ml，那么，

L=0.35100=35EU/ml第九頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三最大有效稀釋倍數(shù)的確定

最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）指在試驗(yàn)中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測。MVD=cL/λ

式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則c等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，c的單位需為mg/ml或U/ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L；λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml）。第十頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三鱟試劑靈敏度復(fù)核目的考察鱟試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確、考察檢驗(yàn)人員操作方法是否正確及實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)備1、取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（或國家標(biāo)準(zhǔn)品）一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。

第十一頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三鱟試劑靈敏度復(fù)核

2、按照標(biāo)準(zhǔn)品說明書，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置漩渦混合器上混合15分鐘。然后進(jìn)行稀釋，制備成4個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即2λ、λ、0.5λ和0.25λ（λ為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度）四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。示例某待復(fù)核鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值為0.25EU/ml，細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格為150EU/ml，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，再稀釋制備成濃度為0.50EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml和0.06EU/ml的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

第十二頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三鱟試劑靈敏度復(fù)核細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備圖示：第十三頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三鱟試劑靈敏度復(fù)核待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備

取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑18支，每支加入0.1ml檢查用水使溶解備用（規(guī)格大于0.1ml／支的鱟試劑，按其標(biāo)示量加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶后按0.1ml/管分裝到凝聚管中，至少準(zhǔn)備18管）。加樣

將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支，1列2支。其中4支4列分別加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。第十四頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三鱟試劑靈敏度復(fù)核

加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，垂直放入37℃±1℃恒溫器中，保溫60±2分鐘。結(jié)果觀察將試管輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性，未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。陽性陰性第十五頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三鱟試劑靈敏度復(fù)核計(jì)算當(dāng)最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照為陰性時(shí)實(shí)驗(yàn)為有效，按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果。

λc=lg-1（ΣX/4）式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。

第十六頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三鱟試劑靈敏度復(fù)核例子：結(jié)果判斷當(dāng)λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。第十七頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三干擾實(shí)驗(yàn)

目的確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

第十八頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行干擾試驗(yàn)一般步驟

供試品限值確定

根據(jù)鱟試劑的靈敏度確定MVD范圍（供試品溶液濃度范圍）

預(yù)試驗(yàn)（初篩試驗(yàn)）確定樣品最大不干擾濃度

正式干擾試驗(yàn)干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

目的初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/U活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù),避免干擾試驗(yàn)的盲目性。第十九頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三干擾實(shí)驗(yàn)操作方法

1、將無可檢測到內(nèi)毒素的供試品進(jìn)行一系列倍數(shù)的稀釋，但最大的稀釋倍數(shù)不得超過MVD=CL/λ0.03（0.03EU/ml為現(xiàn)今我國市售鱟試劑的最高靈敏度）。

2、使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即該濃度的供試品稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ濃度）。另取2支細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作陰性對照，2支加入2λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽性對照。例制備稀釋倍數(shù)為4的供試品陽性對照溶液：0.3ml4.0λEU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液+0.3ml稀釋倍數(shù)為2的供試品稀釋液＝0.6ml含2λEU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋倍數(shù)為4的供試品稀釋液

3、保溫60±2分鐘，觀察并記錄結(jié)果。第二十頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三干擾實(shí)驗(yàn)

4、當(dāng)陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時(shí)，實(shí)驗(yàn)有效。當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn)，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。

5、當(dāng)系列濃度中所有濃度的供試品管都不為陰性，或供試品陽性對照不為陽性時(shí)，說明供試品對內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)存在干擾，則應(yīng)對供試品進(jìn)行更大稀釋倍數(shù)（不得超過MVD=CL/λ0.03），或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。

6、當(dāng)供試品的內(nèi)毒素限值單位為EU/mg或EU/U活性單位時(shí)，應(yīng)將最小不干擾稀釋倍數(shù)換算成最大不干擾濃度（即稀釋倍數(shù)下溶液的濃度），以mg/ml或活性單位/ml表示。第二十一頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三干擾實(shí)驗(yàn)舉例

某注射液限值為2.5EU/ml，按MVD＝CL/λ計(jì)算出靈敏度為0.03EU/ml下的MVD為83倍，將供試品溶液進(jìn)行一系列稀釋，用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下：稀釋倍數(shù)原液510204080供試品溶液－－－－－－－－－－－－供試品陽性對照－－－－－－++++++由以上結(jié)果可初步確定該樣品的最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，可在此濃度下進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。第二十二頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三干擾實(shí)驗(yàn)正式干擾實(shí)驗(yàn)

制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ。

制備含內(nèi)毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將同支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個(gè)濃度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含內(nèi)毒素的供試品溶液。

鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/λ支的鱟試劑36支，備用。

第二十三頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三干擾實(shí)驗(yàn)加樣準(zhǔn)備好的36支鱟試劑放在試管架上，按下圖加樣。0.1ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液0.1ml檢查用水0.1ml含內(nèi)毒素的供試品液0.1ml供試品液加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，放入37℃±1℃恒溫器中，保溫60±2分鐘，觀察并記錄結(jié)果。第二十四頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三干擾實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算如兩組最大濃度2.0λ均為陽性，最低濃度0.25λ均為陰性，陰性對照4管均為陰性時(shí)，按下式計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）。Es=lg-1（ΣXs/4）Et=lg-1（ΣXt/4）式中

Xs、Xt分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）。第二十五頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三干擾實(shí)驗(yàn)當(dāng)Es在0.5λ～2λ（包括0.λ和2λ）及Et在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用，可在該濃度下對此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。當(dāng)Et不在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下干擾實(shí)驗(yàn)。應(yīng)使用適宜方法排除干擾，如可將供試品進(jìn)行更大倍數(shù)稀釋（不超過MVD

）。建立新品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時(shí)，每個(gè)廠家至少取三個(gè)批號的供試品。用兩個(gè)以上鱟試劑生產(chǎn)廠家的鱟試劑進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。第二十六頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照，同時(shí)每次實(shí)驗(yàn)必須做2支陽性對照和2支陰性對照。供試品溶液的制備根據(jù)內(nèi)毒素限度值，計(jì)算MVD=CL/λ。然后將供試品進(jìn)行稀釋，其稀釋倍數(shù)不得超過MVD。一般稀釋至MVD；如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗(yàn)要求的第二濃度作為日常檢查濃度。陽性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。第二十七頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ濃度的內(nèi)毒素溶液。陰性對照

即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑8支，每支加入0.1ml檢查用水使溶解備用。加樣

8支管中2支加入0.ml供試品溶液或其稀釋液作為供試品管，2支加入0.1m