甲型肝炎病毒-IgM檢測(cè)(ELISA法)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)

甲型肝炎病毒--IgM檢測(cè)(ELISA法)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)原理本法是用抗人μ鏈捕獲待測(cè)血清中特異性IgM，然后用HAV與特異性—IgM抗體反應(yīng)，再加酶標(biāo)記抗M抗體，最后加底物顯色。標(biāo)本采集采集前病人準(zhǔn)備：受檢者應(yīng)空腹。標(biāo)本種類(lèi)：血清或血漿。標(biāo)本要求：采集病人靜脈血2ml（可用EDTA抗凝），室溫放置不超過(guò)4小時(shí)，分離血清備用。標(biāo)本儲(chǔ)存：2-8°C保存不應(yīng)超過(guò)1周，-20°C不應(yīng)超過(guò)3個(gè)月，-70°C長(zhǎng)期保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本運(yùn)輸：密封，室溫運(yùn)輸。標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)：污染、標(biāo)本量不足、嚴(yán)重溶血或脂血標(biāo)本不宜作此項(xiàng)檢測(cè)。試劑6.1試劑名稱(chēng)：抗HAV—IgM檢測(cè)ELISA試劑盒6.2試劑生產(chǎn)廠家：xx技術(shù)研究所6.3包裝規(guī)格：48Test/Kit6.4試劑盒組成：包被反應(yīng)板，樣品稀釋液，酶標(biāo)記抗體，陽(yáng)性對(duì)照血清，陰性對(duì)照血清，濃縮洗滌液，底物A，底物B，終止液，封口膜，密封袋。6.5試劑儲(chǔ)存條件及有效期：2-8°C避光保存，有效期6個(gè)月。儀器設(shè)備儀器名稱(chēng)：自動(dòng)酶標(biāo)儀儀器廠家：Rayto儀器型號(hào)：RT-2100C操作步驟平衡：將試劑盒各組分取出，平衡至室溫（18-25°C），微孔板開(kāi)封后，余者及時(shí)以自封袋封存。配液：濃縮洗滌液配制前充分搖勻（如有晶體應(yīng)充分溶解），濃縮洗滌液和蒸餾水或去離子水按1：19稀釋后使用。編號(hào)：將微孔條固定于支架，按序編號(hào)。加樣品稀釋液：用加樣器在微孔反應(yīng)條板孔中加入樣品稀釋液，每孔100l，空下四孔準(zhǔn)備加對(duì)照。加標(biāo)本和留空白：將每份待檢標(biāo)本各5l分別加入已有樣品稀釋液的各孔中，留下一孔不加標(biāo)本作空白對(duì)照，標(biāo)好位置。加對(duì)照：在預(yù)先空下的四孔中用加樣器分別加入陰性對(duì)照一孔，陽(yáng)性對(duì)照三孔，每孔100l，標(biāo)好位置。對(duì)照應(yīng)在所有標(biāo)本加完以后再加，以保證閾值準(zhǔn)確性。溫育（一）：充分混勻，加上封板膜，置37℃溫育20分鐘。洗滌（一）：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時(shí)間）。加酶：分別在每孔中加入酶標(biāo)記抗體100l，輕拍混勻。8.10溫育（二）：充分混勻，加上封板膜，置37℃溫育30分鐘。8.11洗滌（二）：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時(shí)間）。8.12顯色：每孔加入底物A、B各50l，輕拍混勻，置37℃暗處10分鐘。8.13終止：每孔加終止液50l，混勻。8.14測(cè)定：用酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)450nm或雙波長(zhǎng)450/630nm測(cè)定各孔OD值（用單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)需設(shè)空白對(duì)照一孔，30分鐘內(nèi)完成測(cè)定，并記錄結(jié)果）。9.結(jié)果判斷與分析9.1臨界值（C.O.）的計(jì)算：臨界值＝陰性對(duì)照孔OD值N×2.1，陰性對(duì)照OD均值大于0.1時(shí)應(yīng)重新試驗(yàn)，小于0.05時(shí)以0.05計(jì)算。9.2結(jié)果判定：樣品OD值S/C.O>=1者為陽(yáng)性樣品OD值S/C.O<1者為陰性10.質(zhì)量控制：每次均應(yīng)有陰陽(yáng)對(duì)照，其OD值應(yīng)在要求范圍內(nèi)。參考值范圍：陰性12.臨床意義：血清中抗HAV-IgM在亞臨床期即已出現(xiàn)，其滴度在感染后3個(gè)月維持在1000以上，已被公認(rèn)為早期診斷甲型肝炎的依據(jù)。13.操作性能：特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好。14.方法局限性15.注意事項(xiàng)15.1每板建議設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照血清各兩孔，設(shè)空白對(duì)照時(shí)，不加樣品及酶標(biāo)記抗體，其余各步相同。15.2洗滌時(shí)各孔均須加滿(mǎn)，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈。15.3加試劑前應(yīng)將試劑瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。如果滴加，滴加前應(yīng)棄去1-2滴。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。注意勿將試劑滴在孔壁上。15.4所有樣品都應(yīng)按傳染源處理。15.5封口膜使用說(shuō)明15.5.1微孔板拆封后，在取出當(dāng)天所需的微孔條后，其余微孔條可以封口膜封存以避免受潮。在封存時(shí)，注意勿把封口膜粘貼到微孔條底部，以免影響其透光性。15.5.2微孔板溫育時(shí)，以封口膜覆蓋孔口，可避免其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的非預(yù)期的影響。15.6不同品名、不同批號(hào)的試劑不可混用，以免產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。16.當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)（儀器）不能工作時(shí)，所采取的補(bǔ)救措施：應(yīng)保證所有操作步驟正確無(wú)誤；可以比對(duì)陰陽(yáng)對(duì)照，肉眼判讀；無(wú)法準(zhǔn)確判讀者，應(yīng)留樣待系統(tǒng)正常后