第二章目的基因獲得演示文稿

第二章目的基因獲得演示文稿本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分三、目的基因的獲得限制酶酶切直接分離法PCR擴(kuò)增法從mRNA合成cDNA化學(xué)合成法通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)分離法本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分對(duì)已克隆在載體中的目的基因，可根據(jù)目的基因兩側(cè)的限制酶識(shí)別序列，選擇適當(dāng)?shù)南拗泼该盖?，獲得目的基因。（一）限制酶酶切直接分離法注意：目的基因內(nèi)部不能有該限制酶的切點(diǎn)，否則目的基因會(huì)被切成碎片！本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分Ampr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1pPIC9K/hVEGF165EcoRINotIBglIIhVEGF165BglII9.8KbTTSAmpr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1

pPIC9K9.3KbBglIIBglIISnaBIEcoRIAvrIINotISTTf1oriAmprlacZpGEM-T/hVEGF165hVEGF1653.5Kb本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分

（二）PCR法擴(kuò)增目的基因利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過(guò)變性-退火-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的操作技術(shù)。PCR(polymerasechainreaction)：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分以目的基因?yàn)槟０澹铣苫パa(bǔ)的新DNA鏈。雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA；引物與模板單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位配對(duì)、結(jié)合；退火：變性：延伸：變性退火延伸本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分30thcycle？由于每一循環(huán)所產(chǎn)生的DNA片段均能成為下一次循環(huán)的模板，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，即Y=2n(n為循環(huán)次數(shù))。230(109)copies本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分PCR技術(shù)的發(fā)明--DNA操作技術(shù)的革命發(fā)明人：美國(guó)生化學(xué)家KaryB.MullisTheNobelPrizeinChemistry1993MullisKB.Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.ScientificAmerican.1990,262(4):56-61,64-5.1990.04MullisKB.Dancingnakedinthemindfields.1998.04本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分1983.03開(kāi)汽車時(shí)的聯(lián)想：蜿蜒崎嶇的山路--DNA雙螺旋行駛的汽車--一小段DNA引物1972在加州大學(xué)伯克利分校獲得博士學(xué)位1979進(jìn)入私人生物技術(shù)公司Cetus

1983.08正式做有關(guān)PCR原理的報(bào)告1983.09Mullis開(kāi)始動(dòng)手做實(shí)驗(yàn)1984.11首次取得可信結(jié)果1985.01

RandallSaiki加入，結(jié)果毋庸置疑本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分1985.03Cetus公司申請(qǐng)專利1985.12SaikiRK,ScharfSJ,FaloonaFA,MullisKB,HornGT,ErlichHA,ArnheimN.Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.1985,230(4732):1350-4.1986.05冷泉港“人類分子生物學(xué)”專題研討會(huì)1987.01MullisKB,FaloonaFA.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecatalyzedchainreaction.MethodsinEnzymology.1987,155:335-50.本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分1991.12Cetus以$3億將專利賣給Hoffmann-LaRoche公司1986.06Saiki等將耐熱DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技術(shù)。SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfSJ,HiguchiR,HornGT,MullisKB,ErlichHA.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science.1988,239(4839):487-91.1988.011989Science雜志將PCR列為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首，比喻1989年為PCR爆炸年。1986.09Mullis離開(kāi)Cetus公司本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分EppendorfBio-radABI本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分PCR法擴(kuò)增目的基因的前提：已知目的基因全序列或其兩側(cè)序列，化學(xué)合成與模板互補(bǔ)的上、下游引物。

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Taq酶無(wú)3’→5’外切酶活性，無(wú)閱讀校正功能，在擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)引起錯(cuò)配，30次循環(huán)Taq酶錯(cuò)配率約0.25％。措施：?jiǎn)栴}：可能造成目的基因堿基序列的改變。原因：選擇高保真Taq酶，如Pfu。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分因Taq酶對(duì)dATP具有優(yōu)先聚合活性。5’AAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物5’由Taq酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，3’末端總是帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基，而這個(gè)堿基幾乎總是A，T載體TT5’5’T7lacZMCSoriAmpr可用T載體克隆。

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（三）從mRNA合成cDNA以目的基因的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈，然后在Klenow酶作用下合成雙鏈cDNA。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分此法適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆，如血紅蛋白珠蛋白基因。哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中珠蛋白mRNA的比例占總mRNA的90%以上。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的0.5%以下。目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的50-90%。高豐度mRNA：低豐度mRNA：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分步驟：dNTP逆轉(zhuǎn)錄酶primer逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈mRNAcDNA釣取目的基因的mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶去除mRNA-cDNA雜交鏈中的mRNA鏈cDNAKlenow酶dNTPKlenow酶合成cDNA第二鏈cDNAcDNA本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分釣取目的基因的mRNA：與oligo(dT)堿基互補(bǔ)的mRNA結(jié)合到柱上，非mRNA(tRNA、rRNA）流走?？俶RNAoligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纖維素柱oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纖維素柱總RNA1）提取特定組織或細(xì)胞的總RNA，用oligo(dT)纖維素柱分離總mRNA。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分2）根據(jù)已知基因序列合成DNA探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來(lái)分離純化特定mRNA。與探針堿基互補(bǔ)的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特定mRNA探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA纖維素柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA纖維素柱總mRNA本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分克隆平端雙鏈cDNA的方法：平端直接與載體連接；平端接同聚尾；加裝人工接頭(adapter)；加裝銜接物(linker)。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分加裝同聚物尾：利用TdT，在雙鏈cDNA和載體3’端加互補(bǔ)的同聚物尾，退火連接成重組分子。1972年，斯坦福大學(xué)P.Labban和P.Kaiser發(fā)明。CCCCCCCCCCCCdCTPTdTcDNA5’3’載體5’3’GGGGGGGGGGGGdGTPTdTCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGT4DNAligase本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分加裝人工接頭(adapter)1978年，康奈爾大學(xué)吳瑞發(fā)明。adapter是人工合成的一頭具有某種限制酶的粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。GTCGCAGCTTAA5’3’EcoRIadapter本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分注意：adapter易通過(guò)粘端堿基配對(duì)形成二聚體。GTCGCAGCTTAA5’3’AATTCGACGCTG3’5’AATTCGACGCTGGTCGCAGCTTAA5’3’3’5’T4DNAligase將adapter連接到雙鏈cDNA的兩端，直接成為人工粘端。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分CIP去除adapter的5’-P，使5’-P成為5’-OH。5’P-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-P5’3’3’CIP5’OH-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-OH5’3’3’措施：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分加裝銜接物(linker):

linker是人工合成的一段由10-12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或多個(gè)限制酶識(shí)別序列的平末端雙鏈寡核苷酸短片段。EcoRIlinker5’TGGAATTCCAACCTTAAGGT5’3’3’本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分將雙鏈cDNA與linker連接，再用限制酶酶切，可產(chǎn)生粘性末端。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分

（四）化學(xué)合成法1979年，成功合成E.coli酪氨酸t(yī)RNA基因。

Science1976年，H.G.Khorana提出用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想；本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分已知目的基因的DNA序列?；瘜W(xué)合成法的前提：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分小片段粘接法補(bǔ)釘延長(zhǎng)法大片段酶促法戰(zhàn)略：化學(xué)合成的DNA片斷一般局限在200bp以內(nèi)。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分1）小片段粘接法：分別合成12-15bp的單鏈DNA小片段?；旌贤嘶餞4DNAligase片斷之間有互補(bǔ)區(qū)，混合退火形成有斷點(diǎn)的雙鏈，再由T4DNAligase連接成完整雙鏈。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分2）補(bǔ)釘延長(zhǎng)法：混合退火片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可相互作為另一個(gè)片斷延長(zhǎng)的引物，用Klenow酶延伸成完整雙鏈。T4DNA

ligaseKlenow分別合成12-15bp的單鏈DNA小片段及20-30bp的單鏈DNA中片段。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分3）大片段酶促法：分別合成40-50bp的單鏈DNA大片段。混合退火T4DNA

ligaseKlenow片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可相互作為另一個(gè)片斷延長(zhǎng)的引物，用Klenow酶延伸成完整雙鏈。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分化學(xué)合成的份額較大，成本較高。大片段化學(xué)合成的收率極低，如合成50bp的DNA單鏈大片段的總收率僅7.7%。三種方法各有利弊：小片段粘接法：大片段酶促法：化學(xué)合成DNA的單鏈片段愈短，收率愈高；化學(xué)合成的份額較小，成本較低；本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分化學(xué)合成DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去，每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括：基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離、去保護(hù)五大操作單元。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分DNA合成儀是根據(jù)固相亞磷酰胺三酯法原理設(shè)計(jì)的。從反應(yīng)機(jī)理上來(lái)講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酰胺三酯法；具體操作過(guò)程又有液相合成和固相合成兩種形式。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分DNA合成儀基因合成一般都是自己設(shè)計(jì)序列，交給商業(yè)公司合成。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分DNA化學(xué)合成的用途：合成天然基因修飾改造基因設(shè)計(jì)新型基因合成測(cè)序或PCR引物制備寡核苷酸探針制備人工接頭(adaptor)和銜接物(linker)本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分合成天然基因：有些組織特異性mRNA含量很低，很難用cDNA法克隆。有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低。

如：生長(zhǎng)激素釋放抑制激素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分合成寡核苷酸探針(oligonucleotideprobe)：根據(jù)已知核酸序列，用DNA合成儀合成一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段，作為探針使用。若未知核酸序列，可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列倒推出核酸序列，但需考慮密碼子的簡(jiǎn)并性。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分大多數(shù)氨基酸擁有簡(jiǎn)并密碼子。某段連續(xù)的氨基酸序列:CysMetAspGluMetLys可能的DNA序列:TGTATGGACGAAATGAAACTGG設(shè)計(jì)系列探針:TGTATGGACGAAATGAAATGTATGGACGAGATGAAATGTATGGATGAAATGAAATGTATGGATGAGATGAAATGTATGGACGAAATGAAGTGTATGGACGAGATGAAGTGTATGGATGAAATGAAGTGTATGGATGAGATGAAGTGCATGGACGAAATGAAATGCATGGACGAGATGAAATGCATGGATGAAATGAAATGCATGGATGAGATGAAATGCATGGACGAAATGAAGTGCATGGACGAGATGAAGTGCATGGATGAAATGAAGTGCATGGATGAGATGAAG本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分（五）通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)分離目的基因基因庫(kù)(genepool)基因文庫(kù)(genelibraryorgenebank)

基本概念:本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分是特定生物體全基因組的集合（天然存在）。基因庫(kù)：

本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第44頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分是從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆形式存在（人工構(gòu)建）?；蛭膸?kù)：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為：基因組文庫(kù)(genomicDNAlibrary)

cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)

本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分基因組文庫(kù)：cDNA文庫(kù)：含全部基因。含全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因。鳥(niǎo)槍法構(gòu)建；材料來(lái)自染色體DNA；cDNA法構(gòu)建；材料來(lái)自mRNA；本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第47頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分1、基因組文庫(kù)將某種生物基因組DNA經(jīng)超聲波或限制酶部分酶切處理后，與載體連接，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因的克隆群體。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第48頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分1、基因組DNA的制備：制備的DNA分子量越大，切割后含不規(guī)則末端DNA片段的比率越低，重組率和完備性越高?；蚪M文庫(kù)的構(gòu)建為最大限度保證基因的完整性，基因組DNA在分離純化操作中應(yīng)避免過(guò)度斷裂。

本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第49頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分常規(guī)方法制備的染色體DNA長(zhǎng)度一般100kb，如先將細(xì)胞固定在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1,000kb的DNA片段。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第50頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分一般采用超聲波和限制酶部分酶切法。保證DNA片段大小均一。2、基因組DNA的切割：目的：保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)；本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第51頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分超聲波處理：處理后的DNA片段呈平末端，需加裝人工接頭。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第52頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分產(chǎn)生粘性末端，可與常用克隆位點(diǎn)（如BamHI、BglII）連接。部分酶切法：部分酶切片段大小可控，可得到15-45kb的隨機(jī)片斷；選用4bp識(shí)別序列的限制酶，如Sau3A。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第53頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分3、載體和受體的選擇構(gòu)建大型基因組文庫(kù)（動(dòng)植物和人類），選擇BAC或YAC。根據(jù)載體，選擇E.coli、Yeast。常選-DNA或Cosmid；受體：載體：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第54頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第55頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第56頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分在基因組文庫(kù)構(gòu)建中，最應(yīng)引起重視的問(wèn)題：盡量提高載體與外源DNA片段的連接效率！根據(jù)載體的裝載量，將DNA片段分級(jí)分離；利用CIP，去除載體的5’-P；利用TdT，在DNA片段的3’-OH加同聚尾。措施：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第57頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分基因文庫(kù)的完備性：是指在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率P，與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù)N的關(guān)系：N=ln(1–P)/ln(1–f)P=基因文庫(kù)的完備性（某一基因被克隆的概率）f=克隆片段平均大小/生物基因組大小本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第58頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分N=ln(1–P)/ln(1–f)如：人單倍體DNA長(zhǎng)2.9×106kb，克隆片段平均大小15kb，構(gòu)建完備性0.9的基因文庫(kù)，至少需45萬(wàn)個(gè)克?。划?dāng)完備性提高至0.9999時(shí)，至少需180萬(wàn)個(gè)克隆。即：為保證某一基因以99.99%的機(jī)率至少被克隆1次，需構(gòu)建含180萬(wàn)個(gè)不同重組克隆的基因文庫(kù)，這時(shí)克隆片段總和為整個(gè)基因組的

倍。9.3本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第59頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分即：為保證某一基因以99.99%的機(jī)率至少被克隆1次，需構(gòu)建含180萬(wàn)個(gè)不同重組克隆的基因文庫(kù)，若1個(gè)基因文庫(kù)的插入片段總和為整個(gè)基因組的10倍以上，就能從基因文庫(kù)中調(diào)出任何一段DNA序列。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第60頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：除盡可能高的完備性外，理想的基因文庫(kù)還應(yīng)具備：重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選?？寺】倲?shù)不宜過(guò)大，以減輕篩選工作的壓力；載體的裝載量必須大于基因的長(zhǎng)度；含有相鄰DNA片段的重組克隆之間，需存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)，以利于克隆排序；克隆片段易于從載體分子上完整卸下；本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第61頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分基因組文庫(kù)的保存影印濾膜保存法保存文庫(kù)于液體培養(yǎng)基中保存單個(gè)克隆子于液體培養(yǎng)基中本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第62頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分1）影印濾膜保存法：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第63頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分2）保存文庫(kù)于液體培養(yǎng)基中從平板上挑取全部克隆，接種于含適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)代后，加入終濃度25%的甘油，-70℃保存。缺點(diǎn)：由于文庫(kù)菌落生長(zhǎng)的不均勻性，可能導(dǎo)致文庫(kù)中某些特定序列過(guò)多或過(guò)少。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第64頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分3）保存單個(gè)克隆子于液體培養(yǎng)基中從平板上挑選單個(gè)克隆，接種于含適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)至一定濃度時(shí)，加入終濃度25%的甘油，-70℃保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過(guò)多，工作量大。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第65頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分從基因組文庫(kù)中篩選目的基因大型基因組文庫(kù)由數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)重組克隆組成，除一些具特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因）可用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選）直接篩選外，一般均需多輪操作步驟。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第66頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分密集鋪板（1-10萬(wàn)）雜交挖取鋪板目的重組克隆鋪板根據(jù)目的基因已知核苷酸序列進(jìn)行篩選本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第67頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分通過(guò)構(gòu)建基因組文庫(kù)獲取目的基因的問(wèn)題：該方法僅適用于原核基因的分離，較少采用。不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。工作量大，需了解目的基因的背景知識(shí)；不能獲得最小長(zhǎng)度的目的基因；本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第68頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分“鳥(niǎo)槍法(shotgun)”：又稱“散彈法”用限制酶部分酶切染色體DNA將酶切片段克隆入載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞并擴(kuò)增分離帶有目的基因的DNA片段篩選目的重組子本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第69頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分用“鳥(niǎo)槍法”獲取目的基因：缺點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便。工作量大；具有一定的盲目性。優(yōu)點(diǎn)：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第70頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分優(yōu)點(diǎn)：保證目的基因的完整性，提高目的重組子的出現(xiàn)頻率，簡(jiǎn)化操作。鳥(niǎo)槍法操作的改進(jìn)：

使用特定限制酶完全酶切染色體DNA。前提：已知目的基因的酶切圖譜。策略：用目的基因兩端的限制酶完全酶切染色體DNA，然后與載體拼接。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第71頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分2.0kb1.6kb1.8kb如：已知目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開(kāi)，瓊脂糖凝膠電泳分離，切下區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠中回收DNA片段，與載體連接。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第72頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分基因組文庫(kù)重組克隆的排序構(gòu)建大型基因組文庫(kù)技術(shù)上并不困難，若文庫(kù)插入片段總和為基因組的10倍以上，就能從其中調(diào)出任何一段DNA序列。

然而基因文庫(kù)的克隆是隨機(jī)序列，必須將所有克隆排列成一個(gè)像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。

這項(xiàng)工作的工作量遠(yuǎn)大于文庫(kù)構(gòu)建。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第73頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分酶切片段末端標(biāo)記法隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法染色體走讀法基因組文庫(kù)重組克隆的排序方法：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第74頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分酶切片段末端標(biāo)記法：1、將單一YAC克隆插入DNA片段用限制酶均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素。HHHH載體DNA克隆DNA本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第75頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分2、然后用Sau3A將末端標(biāo)記的DNA片段降解成碎片，PAGE電泳，每10個(gè)YAC克隆走在一塊板上，形成10個(gè)克隆的特征性DNA指紋圖譜。SSSSSSSSSSSSSSSSSSS10克隆指紋圖譜12345678910本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第76頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分3、電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)克隆DNA的指紋圖譜有部分相同，二者就有互相重疊的可能性，在染色體上則可能是排列一起的。10克隆指紋圖譜12345678910本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第77頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法：1、將若干YAC克隆固定在薄膜上，復(fù)制20份薄膜；合成20種不同序列的短探針（序列隨機(jī)）。0102030405060708091011121314151617181920ABCDEFG本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第78頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分2、用20種探針隨機(jī)定位雜交（1對(duì)1）20份YAC克隆薄膜。若某2個(gè)克隆同時(shí)對(duì)同一種探針呈現(xiàn)雜交陽(yáng)性反應(yīng)，則這2個(gè)克隆有可能相互重疊。0102030405060708091011121314151617181920ABCDEFG20個(gè)隨機(jī)探針本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第79頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分3、若將雜交陽(yáng)性結(jié)果記為“1”，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序。0102030405060708091011121314151617181920DABCEFG111111111111111111111111111111本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第80頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分0104120613140214071911150508160310092018DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第81頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分1、從基因文庫(kù)中任取1個(gè)克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將其兩端序列分別亞克隆，亞克隆片段在0.5-2.0kb范圍內(nèi)。染色體走讀法(chromosomewalking)：走讀的起點(diǎn)克隆片段亞克隆旁測(cè)序列本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第82頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分2、以亞克隆DNA片段為探針，與基因文庫(kù)雜交，陽(yáng)性克隆中的插入DNA片段必定與起點(diǎn)克隆所含的DNA片段連鎖在一起。

走讀的起點(diǎn)克隆片段亞克隆旁測(cè)序列探針標(biāo)記第一輪雜交陽(yáng)性克隆陽(yáng)性克隆本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第83頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分3、再以陽(yáng)性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，直至線型染色體DNA的端點(diǎn)。陽(yáng)性克隆陽(yáng)性克隆第二輪雜交第二輪雜交本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第84頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分走讀的起點(diǎn)克隆片段本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第85頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分將某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，與載體連接，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的克隆群體。

2、cDNA文庫(kù)本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第86頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫(kù)，容易構(gòu)建；具有時(shí)空性和組織細(xì)胞特異性。cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)：不含內(nèi)含子序列；可以在細(xì)菌中直接表達(dá)；包含該生物全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因；本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第87頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分在高度分化的生物體中，不同組織或細(xì)胞在相同時(shí)段、相同環(huán)境背景下，mRNA種類、表達(dá)水平也不同。同一組織或細(xì)胞在不同時(shí)段、不同環(huán)境背景下，mRNA種類、表達(dá)水平不同。具有時(shí)空性和組織細(xì)胞特異性：本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第88頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分cDNA文庫(kù)特異地反映某種組織或細(xì)胞中，在特定發(fā)育階段表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此具有時(shí)空性和組織細(xì)胞特異性。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第89頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分cDNA文庫(kù)的構(gòu)建總RNA提取mRNA的分離純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第90頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分1）總RNA提?。荷虡I(yè)化試劑盒。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第91頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分利用mRNA含polyA尾，將其從總RNA中分離純化，mRNA只占總RNA的1-2%。2）mRNA的分離純化：商業(yè)化oligo(dT)纖維素柱。哺乳動(dòng)物mRNA長(zhǎng)度為，大部分為。本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第92頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分本文檔共102頁(yè)；當(dāng)前第93頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)48分3）cDNA第一鏈的合成：cDNA第一鏈mRNAAAAAAAAAAAAAAA3’AAAAAA