第一章植物組織培養(yǎng)的基本技術

第一章植物組織培養(yǎng)的基本技術第1頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

實驗室的設計一、植物組織培養(yǎng)實驗室設計二、設備和儀器三、玻璃器皿及用具四、培養(yǎng)條件主要內容第2頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、植物組織培養(yǎng)實驗室設計準備間緩沖室無菌室培養(yǎng)室第3頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

實驗室設計

在進行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應對工作目的和規(guī)模以及需要哪些最基本的設備和條件有個全面的了解，以便因地制宜地利用現有房屋，或新建、改建實驗室。第4頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)模：

1.以工廠化生產為目的，實驗室規(guī)模太小，則會限制生產影響效率。

2.在設計組織培養(yǎng)實驗室時，應按組織培養(yǎng)程序來設計避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。第5頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月。準備室緩沖間培養(yǎng)室接種室第6頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月準備室第7頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月主要工作：完成完成各種器具的洗滌、干燥、各種藥品貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝、培養(yǎng)基的滅菌等。主要設備：水池、工作臺、高壓滅菌鍋、烘箱、藥品柜、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器.

第9頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月緩沖室第10頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月具體要求和工作：面積5m2為宜。進入無菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進出時帶入雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈，以照射滅菌。第11頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月無菌室(也叫接種室，操作室)第12頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月主要工作：用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉移、試管苗的繼代、原生質體的制備以及一切需要進行無菌操作的技術程序。

主要設備：紫外光源、超凈工作臺、顯微鏡、解剖鏡、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）等。第14頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月具體要求：

接種室宜小不宜大，一般7～8平方米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關門時的空氣擾動。接種室要求干爽安靜，清潔明亮。在適當位置吊裝1～2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。

第15頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)室第16頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月主要工作：將接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)室的大小可根據需要培養(yǎng)架的大小、數目、及其他附屬設備而定。其設計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。第18頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月具體要求：周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培養(yǎng)室溫度一般保持在20—27℃左右，安裝空調機。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70%～80%為好，可安裝加濕器。控制光照時間可安裝定時開關鐘，一般需要每天光照10-16h。第19頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月主要設備：培養(yǎng)架、空調機、除濕機、搖床、培養(yǎng)箱、紫外光源等。第20頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月二、設備、儀器(一)大型設備和儀器

大多由鋁合金制成，一般設5-7層，最低一層離地高約2Ocm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架即高2左右。培養(yǎng)架長度都是根據日光燈的長度而設計，如采用40W日光燈，長1.3m，寬度一般為60cm。培養(yǎng)架第21頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

用于植物材料的培養(yǎng)，其內有溫度感受器，控制箱內溫度到所調指標。生化培養(yǎng)箱還配有光照裝置。恒溫培養(yǎng)箱第22頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

超凈工作臺

用于培養(yǎng)物的無菌操作（由鼓風機、濾板、操作臺、紫外燈和照明燈組成）。超凈臺分水平式和垂直式二種型號第23頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

用于干燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌和測定干物重.用于干燥需保持80-100℃；進行干熱滅菌需保持150℃，達1-3h；若測定干物重，則溫度應控制在80℃烘干至完全干燥為止。

烘箱第24頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

高壓滅菌鍋類型：手提式高壓滅菌鍋立式高壓滅菌鍋作用：培養(yǎng)基、水和各種器皿的消毒第25頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月種類較多，用于分離微莖尖可采用雙筒實體解剖鏡。解剖鏡上帶有照相裝置，根據需要隨時對所需材料進行攝影記錄。

第26頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月作用：用于稱取大量元素、微量元素、維生素、激素等藥品精確度0．0001g。電子天平第27頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月作用：測定培養(yǎng)基及酶制劑的ｐＨ值酸度計第28頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。冰箱第29頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月空調機一般要保持在23—27℃左右，具備產熱裝置，并安裝吊式或立式空調機。第30頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月(二）小型用品

1．鑷子類(forceps)

常應用醫(yī)療上的鑷子。根據操作需要有各種類型

2．剪刀類(scissors)

可采用醫(yī)療五官科用的中型剪刀。主要用于切斷莖段、葉片等。也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進行剪切。第31頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

3.解剖刀:

切割較小材料和分離莖尖分生組織時，可用解剖刀。刀片要經常調換，使之保持鋒利狀態(tài)，否則切割時會造成擠壓，引起周圍細胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。

4.解剖針:解剖針可深入到培養(yǎng)瓶中，轉移細胞或愈傷組織。也可用于分離微莖尖的幼葉，可以自制。

5.接種盤:第32頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

組培瓶（玻璃）---要求透光度好，能耐高壓高溫,以試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等使用較多。三角錐瓶---

適用于各種培養(yǎng)（如固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、大規(guī)模培養(yǎng)或一般培養(yǎng)）。

培養(yǎng)皿---適于作單細胞的固體平板培養(yǎng)、胚和花藥培養(yǎng)和無菌發(fā)芽。

試管---適合于用少量培養(yǎng)基及試驗各種不同配方時選用。

三、玻璃器皿及用具第33頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學實驗用的玻璃器。包括各種型號的燒杯、量筒、移液管、試劑瓶、容量瓶、試管以及移液管架、玻璃棒、滴瓶等。吸耳球、刷子、記號筆、定時鐘、手套、封口膜、脫脂棉、拖鞋、口罩、白大褂、濾紙。第34頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

濕度的影響包括培養(yǎng)容器內濕度的保持和環(huán)境的濕度條件。

(三)、濕度返第35頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)器具洗滌一、洗滌液洗滌液的種類很多，配制方法也不一樣，可根據要求選擇經濟有效的洗滌液。常用的洗滌劑主要有肥皂、洗衣粉、洗潔精和鉻酸洗滌液等。洗衣粉、洗潔精和肥皂均是很好的去污劑，對于帶油脂太多的玻璃器皿，可先用其他洗滌液除污垢再用洗衣粉水等洗滌。第36頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月二、各種器具的洗滌新器皿；新購置的玻璃器皿一般都有游離的堿性物質，使用前要在1%的鹽酸溶液中浸泡24h再清洗，再用自來水沖洗，最后用蒸餾水洗2～3次徹底清潔后，烘干備用。用過器皿；用過后玻璃器皿如燒杯、試管和培養(yǎng)瓶等要先除去其殘渣，清水沖洗后將器皿放入洗衣粉溶液中浸泡一段時間，然后涮去器皿內污物，如洗滌效果不好，可增加洗衣粉水濃度或適當加熱，器皿內外都要刷到，再用水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗一遍，干燥后備用。第37頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)培養(yǎng)基及其配制主要內容

一、培養(yǎng)基成分

二、培養(yǎng)基的pH

三、培養(yǎng)基的種類、配方及其特點第38頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

在建立培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先找到一合適的培養(yǎng)基。在植物組織培養(yǎng)歷史進程中，事實上也緊密地伴隨著培養(yǎng)基的研制史。對植物的營養(yǎng)要求的不斷認識，對已有培養(yǎng)基的改進，或者將新發(fā)現的植物激素、新的有益成分應用于培養(yǎng)基之中，都大大促進了組織培養(yǎng)研究的迅速發(fā)展，取得越來越多的成功。

一、培養(yǎng)基成分第39頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

培養(yǎng)基成分1、水和瓊脂2、大量元素3、微量元素4、鐵鹽5、有機質6、其它輔助性物質7、植物生長調節(jié)物質一、培養(yǎng)基成分第40頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月1、水

水是植物原生質體的組成成分，也是一切代謝過程的介質和溶媒。它是生命活動過程中不可缺少的物質。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止儲藏過程發(fā)霉變質。大規(guī)模生產時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。第41頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂(agar)

作用：最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。特性：溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。通常所說的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90℃以上的熱水。濃度：瓊脂的用量在6-10g／L之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質難以擴散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度過低，凝固性不好。返第42頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月2、大量元素大量元素就是人們平常所說在培養(yǎng)基中的濃度大于100mg/L的元素。在植物生命中具有非常重要的作用。如氮（N）、硫（S）、磷（P）是蛋白質、氨基酸、核酸和許多生物催化劑即酶的主要或重要組分。它們與蛋白質、氨基酸、核酸和酶的結構、功能、活性等有直接的不可缺少的關系。

第43頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

氮占蛋白質含量的16%-18%，在植物生命活動中占有首要的地位，故又稱為生命元素。

磷在糖代謝、氮代謝、脂肪轉變等過程中不可缺少。第44頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

鉀對于參與活體內各種重要反應的酶起著活化劑的作用，鉀供應充分時糖類合成加強，纖維素和木質素含量提高，莖稈堅韌，植株健壯。

硫氨基酸中都含有硫，這些氨基酸幾乎是所有蛋白質的構成分子。

第45頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月鈣:是細胞壁的組分之一，果膠酸鈣是植物細胞胞間層的主要成分，缺鈣時細胞分裂受到影響，細胞壁形成受阻，嚴重時幼芽、幼根會潰爛壞死。鎂是葉綠素分子結構的一部分，缺少鎂，葉綠素就不能形成，葉子就會失綠，就不能進行光合作用。鎂也是染色體的組成成分，在細胞分裂過程中起作用。返第46頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月3、微量元素

B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質會導致生長、發(fā)育異?，F象。

微量元素指小于100mg/L的元素。第47頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月Mn

對糖酵解中的某些酶有活化作用。B

影響植物的有性生殖如花器官的發(fā)育和受精作用。還具有抑制有毒的酚類化合物的形成的作用，改善某些植物組織的培養(yǎng)狀況，缺硼時細胞分裂停滯，愈傷表現出老化現象。第48頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月Zn

是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等的活化劑。Cu

是細胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影響氧化還原過程。Mo

是硝酸還原酶和鉬鐵蛋白的金屬成分。返第49頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月4、鐵鹽

鐵是一些酶（氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等）的重要組成成分，又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉綠有促進作用。但由于Fe的特殊性質，即很不穩(wěn)定、易沉淀，需要在酸性條件下才能比較穩(wěn)定，故在培養(yǎng)基配制時常常把Fe鹽單獨配制，且以螯合物的形式存在。返第50頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月5、有機質----糖

不同糖類對生長的影響不同。從各種糖對水稻根培養(yǎng)的影響來看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相當，麥芽糖差一些。不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實驗時要根據配方規(guī)定按量稱取，不能任意取量。第51頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月種類：

VB1(鹽酸硫胺素)

、VB6(鹽酸吡哆醇)

、VB3(煙酸)

、

Vc(抗壞血酸)，有時還使用生物素、葉酸、核黃素等。濃度：

0.1－1.0mg/L

作用：

VB1促愈傷組織產生，提高活力

VB6促根生長

VB3與代謝和胚發(fā)育有關

Vc防組織褐變維生素(vitamin)第52頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月肌醇（環(huán)己六醇）促進愈傷組織生長以及胚狀體和芽的形成對組織細胞繁殖、分化的促進作用濃度100mg/L第53頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸(aminoacide)

是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。返第54頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

為了特殊的培養(yǎng)目的，在一部分培養(yǎng)基中還添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西紅柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁等天然復合物以及活性炭，滲透調節(jié)劑等。6、其它輔助性物質第55頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月1)椰乳

是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復合物。一般使用濃度在10％-20％在愈傷組織和細胞培養(yǎng)中有促進作用。第56頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月2)香蕉

濃度：150-200ml/l。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。對pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應用，對發(fā)育有促進作用。第57頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月3)馬鈴薯(potato)

去掉皮和芽后，加水煮30min，再經過過濾，取其濾液使用。用量為150-200g／L。對pH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。第58頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月4)水解酪蛋白或水解乳蛋白

為蛋白質的水解物，主要成分為氨基酸（含有約20種氨基酸的混合物）使用濃度為100-200mg／L。受酸和酶的作用易分解。第59頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月5)其他

酵母提取液(YE)(0.01％-0.05％)，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(0．01％-0．5％)

蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實、未熟玉米的胚乳等。第60頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月6)其它輔助性物質抗生物質抗氧化物活性炭第61頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月A、抗生物質(antibiotic)

種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等用量：5-20mg／L。作用：防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失。對于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5％-10％的抗菌素。注意：抗生素各有其抑菌譜，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但是應當注意抗生素對植物組織的生長也有抑制作用，使用要慎重。第62頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月B、抗氧化物(antioxide)

酚污染——植物組織在切割時會溢泌一些酚類物質，接觸空氣中的氧氣后，自動氧化或由酶類催化氧化為相應的醌類，產生可見的茶色、褐色以致黑色。這些物質滲出細胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)的材料生長停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。在木本，尤其是熱帶木本及少數草本植物中較為嚴重。第63頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月抗酚類氧化常用的藥劑有半胱氨酸及Vc用量：50-200mg／L的濃度方法：洗滌剛切割的外植體表面或過濾滅菌后加入固體培養(yǎng)基的表層。其他抗氧化劑：二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯第64頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月C、活性炭

主要是利用其吸附能力，減少一些有害物質的影響，例如防止酚類物質污染而引起組織褐化死亡。但活性炭對物質吸附無選擇性、既吸有害物質，也吸附有利物質，因此使用時應慎重考慮，不能過量，一般用量為1%--5%。返第65頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月7、植物生長調節(jié)物質植物激素是指自然狀態(tài)下植物體內合成，并從產生處運送到別處，對生長發(fā)育產生顯著作用的微量（1毫克/升以下）有機物；植物生長調節(jié)劑是指一些具有植物激素活性的人工合成的物質。第66頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月植物激素植物生長調節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)中使用的生長調節(jié)物質主要有生長素類和細胞分裂素類兩大類，少數培養(yǎng)基中還添加赤霉素GA3等植物生長調節(jié)物質第67頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

種類IAA

NAA

IBA

2,4－D

作用誘導愈傷組織形成和根分化，促進細胞分裂和伸長生長。根對生長素最敏感，在極低濃度下(10.5-10.8mg／L)就可促進生長，其次是莖和芽。濃度0.05－5mg/L，

(1)、生長素類(auxin)植物生長調節(jié)物質——生長素第68頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月天然的生長素熱穩(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內也易受到體內酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質。生長素配制可先用少量95％酒精助溶。2，4-D可用0．1mol／L的NaOH或KOH助溶。生長素常配成1mg/ml的溶液貯于冰箱中備用。植物生長調節(jié)物質——生長素第69頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月植物生長調節(jié)物質——生長素IAA(吲哚乙酸)

是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA(萘乙酸)

在組織培養(yǎng)中的起動能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。第70頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月植物生長調節(jié)物質——生長素IBA(吲哚丁酸)

是促進發(fā)根能力較強的生長調節(jié)物質。2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)

起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應。第71頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)、GA(赤霉素)

種類：有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應等各有不同。培養(yǎng)基中添加的是GA3。作用：促莖伸長，促胚發(fā)育成植株；打破休眠；特性：赤霉素溶于酒精，配制時可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70％-100％失效，應當采用過濾滅菌法加入。植物生長調節(jié)物質——赤霉素第72頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月植物生長調節(jié)物質——細胞分裂素(3)、細胞分裂素類(cytokinin)

這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA、Kt、玉米素ZT等。其中ZT活性最強，但非常昂貴，常用的是6-BA。細胞分裂素使用濃度：0.05-10mg／L。第73頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基的成分——細胞分裂素在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素有三個作用：①誘導芽的分化促進側芽萌發(fā)生長。細胞分裂素與生長素相互作用，當組織內細胞分裂素／生長素的比值高時，誘導愈傷組織或器官分化出不定芽。②促進細胞分裂與擴大。細胞分裂素多用于誘導不定芽的分化、莖、苗的增殖，③抑制根的分化。避免在生根培養(yǎng)時使用。返第74頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的PH值

不同的植物對培養(yǎng)基最適PH值的要求也是不同，5.8能適應大多數植物培養(yǎng)的需要。PH值因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。它的大小可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl來調整。但要注意兩點：第1、經高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基的PH值會下降0.2-0.8。第2、PH值的大小會影響瓊脂的凝固能力，當PH值大于6時，培養(yǎng)基將會變硬，低于5時，瓊脂不能很好的凝固。第75頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月不同的植物不同培養(yǎng)部位不同的培養(yǎng)目的

三、培養(yǎng)基的種類、配方及其特點

培養(yǎng)基多數以發(fā)明人的名字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基(簡稱MS培養(yǎng)基)，也有對某些成分進行改良稱作改良培養(yǎng)基。需選用不同的培養(yǎng)基第76頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）培養(yǎng)基種類據其態(tài)相分：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基據其作用分：誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基據營養(yǎng)水平分：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基據培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程分：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基

第77頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基種類固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基通氣性較好，便于操作，但營養(yǎng)分布不均，生長發(fā)育不整齊。營養(yǎng)分布均勻，生長整齊一致，但通氣性差。第78頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

基本培養(yǎng)基種類MS培養(yǎng)基1962B5培養(yǎng)基1968White培養(yǎng)基1937N6培養(yǎng)基1975KM-8P培養(yǎng)基1974Miller培養(yǎng)基1965Nitsch培養(yǎng)基1963WPM培養(yǎng)基1933第79頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的。無機鹽離子濃度高，硝酸鹽含量較高用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養(yǎng)MS培養(yǎng)基及特點:第80頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的。含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。雙子葉植物尤其木本植物組培可選擇B5培養(yǎng)基及特點：第81頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

White培養(yǎng)基特點：

1937年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計的，1943年隨其專著的出版而問世。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO4的濃度和增加了硼素。

無機鹽數量較低適于生根培養(yǎng)。第82頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月N6培養(yǎng)基特點：

1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計的。

成分較簡單，KNO3和(NH4)2SO4含量高適合花藥培養(yǎng)第83頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

KM-8P培養(yǎng)基特點：

1974年為原生質體培養(yǎng)而設計的。有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質體培養(yǎng)，包括融合的培養(yǎng)。第84頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月合適培養(yǎng)基的選擇：基本培養(yǎng)基；各種激素的濃度與配比

MS培養(yǎng)基適合于大多數雙子葉植物；B5和N6培養(yǎng)基適合于許多單子葉植物；White培養(yǎng)基適合于根的培養(yǎng)；首先試用這些培養(yǎng)基進行初步實驗，在基本培養(yǎng)基確定之后，進行不同種類激素濃度和激素間相互比例的配合試驗。合適培養(yǎng)基的選擇第85頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基的制備—母液的配制和保存

經常使用的培養(yǎng)基，可先將各種藥品配成濃縮一定倍數的母液，放入冰箱內保存，用時再按比例稀釋。母液要根據藥劑的化學性質分別配制。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素、氨基酸等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。大量元素的母液可以配制成10倍、20倍。微量元素可配成50或100倍濃度的混合母液。KI可以單獨配成母液。第86頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

培養(yǎng)基的制備—母液的配制和保存

鐵鹽也容易發(fā)生沉淀，需要單獨配制。一般硫酸亞鐵（FeSO47H2O）和乙二胺四乙酸鈉（Na2－EDTA）配成100倍濃度的鐵鹽螯合劑比較穩(wěn)定，不易沉淀。氨基酸可以和維生素一起配成100或200倍液，也可將它們中的幾種有機成分分別配制。植物生長調節(jié)物質也可以分別配制成母液，儲存于冰箱。一般濃度為0.1～1mg／ml。

IAA、NAA、IBA、2,4-D之類生長素，可先用少量0.lmol/L的HCl或95％的酒精溶解，KT、BA等細胞分裂素則可用少量0.lmol/l的NaOH加熱溶解，然后加水定容。第87頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

以MS培養(yǎng)基為例--大量元素母液配制

母液化合物名稱培養(yǎng)基用量（mg/L）擴大倍數稱取量(mg)母液體積(mL)1L培養(yǎng)基吸取母液量（mL）大量元素KNO3NH4NO3MgSO4·7H2OKH2PO4CaCl2·2H2O1,9001,6503701704401019,00016,5003,7001,7004,4001000100第88頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

以MS培養(yǎng)基為例—微量元素母液配制

母液化合物名稱培養(yǎng)基用量mg/L）擴大倍數稱取量mg)母液體積(mL)1L培養(yǎng)基吸取母液量（mL）微量元素MnSO4·4H2OZnSO4·7H2OH3BO3KINa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2O22.38.66.20.830.250.0250.0251002,23086062083252.52.5100010第89頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

以MS培養(yǎng)基為例—鐵鹽與有機物母液配制

母液化合物名稱培養(yǎng)基用量（mg/L）擴大倍數稱取量(mg)母液體積(mL)1L培養(yǎng)基吸取母液量（mL）鐵鹽

Na2-EDTAFeSO4·7H2O

37.327.810037302780100010有機物甘氨酸VB1VB6煙酸肌醇2.00.10.50.5100

10

201551,000100

10第90頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

培養(yǎng)基的制做方法

將配制好的母液按順序排列，先取適量的蒸餾水放入容器，然后依次用專用的移液管按需要量吸取各種母液，并混合在一起。再將瓊脂（事先加熱溶解）和糖加入其中，最后加蒸餾水定容至所需體積。隨即用0.lmol/l的NaOH和HCl將pH調至所需的數值，然后分裝到培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基的pH大多數植物都要求在pH5.6～5.8第91頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

計算：制做3L

MS+6-BA2mg/l+NAA0.1mg/l+蔗糖3%+瓊脂0.6%

需要母液各多少？

大量元素母液（10倍）——？微量元素母液（100倍）——？鐵鹽母液（100倍）——？有機物質母液（100倍）——？

6-BA母液(1mg/ml)——？

NAA母液(0.1mg/ml)——？蔗糖——？瓊脂——？第92頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

培養(yǎng)基的滅菌

培養(yǎng)基一般采用濕熱滅菌法，溫度為121℃-123℃，維持20min，即可達到滅菌的目的。若滅菌時間過長，會使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效。但時間過短，不能保證滅菌的效果，易引起培養(yǎng)基污染。培養(yǎng)基儲藏在4～10℃的條件下。第93頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

培養(yǎng)基蒸氣滅菌所需的最少時間

容積/容器（ml）在121℃下所需要滅菌時間20~5015min7520min250~50025min100030min150035min200040min第94頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月123456第95頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月第96頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

第四節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)

一、外植體的選擇

二、外植體的滅菌三、外植體的接種和培養(yǎng)四、外植體的成苗途徑

主要內容第97頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

植物體的各個部位，如根、莖（鱗莖、莖段）、葉（子葉、葉片）、花瓣、花藥、胚珠、幼胚、塊莖、莖尖、維管組織、髓部等都可以做為外植體。

植物種類不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理狀態(tài)，對外界誘導反應的能力及分化再生能力是不同的。

選擇適宜的外植體需要從植物基因型、外植體來源、外植體大小、取材季節(jié)及外植體發(fā)育年齡等方面加以考慮。一、外植體的選擇第98頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

植物基因型不同，組織培養(yǎng)的難易程度不同。草本植物比木本植物易于通過組織培養(yǎng)獲得成功，雙子葉植物比單子葉植物易于組織培養(yǎng)。木本植物中，獼猴桃較易再生植株；松樹、柏樹等就比較困難。植物基因型不同，組培再生途徑也不同。如十字花科及傘形科中的胡蘿卜、芥菜、等易于誘導胚狀體。茄科中的煙草、番茄、曼陀羅，易于誘導愈傷組織。

植物基因型一、外植體的選擇第99頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

生長健壯無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官或組織作為外植體，離體培養(yǎng)易于成功。因為，這部分器官或組織代謝旺盛，再生能力強。同一植物不同部位之間的再生能力差別較大，如同一種百合鱗莖的外層鱗片比內層鱗片再生能力強，下段比中段、上段再生能力強。因此，最好對所要培養(yǎng)的植物各部位的誘導及分化能力進行比較，從中篩選合適的、最易再生的部位作為最佳外植體。

外值體來源一、外植體的選擇第100頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

對大多數植物來說，莖尖是較好的外植體，由于莖形態(tài)已基本建成，生長速度快，遺傳性穩(wěn)定，也是獲得無病毒苗的重要途徑，如月季、蘭花、大麗花、非洲菊無病毒苗的生產等。但莖尖往往受到材料來源的限制，為此可以采用莖段、葉片等作為培養(yǎng)材料，如菊花、各種觀賞秋海棠、黃花夾竹桃等。另外，還可根據需要選擇鱗莖。（如麝香百合），花莖或花梗（如蝴蝶蘭），花瓣、花蕾（如君子蘭），根尖（如雀巢蘭屬），胚（垂笑君子蘭），無菌實生苗（吊蘭）等部位作為外植體進行離體培養(yǎng)。一、外植體的選擇第101頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

外植體的大小，應根據培養(yǎng)目的而定。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒，則外植體宜??；如果是進行快速繁殖，外植體宜大。但外植體過大，殺菌不徹底，易于污染；過小離體培養(yǎng)難于成活。一般外植體大小在0.5～1.cm為宜。具體說葉片、花瓣等約為0.5cm2，莖段則長約0.5cm，莖尖分生組織帶一兩個葉原基0.2～0.3mm大小等。

一、外植體的選擇外值體大小第102頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

離體培養(yǎng)的外植體最好在植物生長的最適時期取材，即在其生長開始的季節(jié)里取樣，若在生長末期或已經進入休眠期取樣，則外植體會對誘導反應遲鈍或無反應。如蘋果芽在春季取材成活率為60％，夏季取材下降到10％，冬季取材在10％以下。百合鱗片外植體，春、秋季取材易形成小鱗莖，夏、冬季取材培養(yǎng)，則難形成小鱗莖。

一、外植體的選擇取材季節(jié)第103頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

外植體的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡直接影響離體培養(yǎng)過程中的形態(tài)發(fā)生。一般認為，沿植物的主軸，越向上的部分所形成的器官其生長的時間越短，生理年齡也越老，越接近發(fā)育上的成熟，越易形成花器官；反之越向基部，其生理年齡越小。如在煙草的培養(yǎng)中，植株下部組織產生營養(yǎng)芽的比例高，而上部組織產生花器官的比例高。一般情況下，越嫩，年限越短的組織具有越高的形態(tài)發(fā)生能力，組織培養(yǎng)越易成功。

外值體的發(fā)育年齡一、外植體的選擇第104頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

外植體滅菌的一般步驟

1．預處理，先對植物組織進行修整，去掉不需要的部分，將準備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經過預處理的植物材料，其表面仍有很多細菌和真菌。

2．將植物組織塊置于一個玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋沒材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用無菌水沖洗三次。

二、外植體的滅菌第105頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月外植體消毒第106頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月3.將適當濃度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸鈉)(含有幾滴活化劑Tween20或Tween80)，使材料完全浸沒在消毒液中，蓋上蓋，把玻璃瓶置入超凈工作臺滅菌一定時間。在滅菌期間須把玻璃瓶搖動2～3次。

4．消毒處理后，將瓶蓋打開，將消毒液倒出，注入適量的無菌蒸餾水，再蓋上蓋，搖動數次，將水倒掉，重復3～4次。

二、外植體的滅菌植體滅菌的一般步驟第107頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、外植體的滅菌

消毒劑使用濃度%去除難易消毒時間（min）效果次酸鈣9～10易5～30很好次氯酸鈉2.0易5～30很好過氧化氫10～12最易5～15好氯化汞0.1～1.0較難2～10最好溴水1～2易2～10很好硝酸銀1.0較難5～30好抗生素4～50mg/L中30～60較好常用滅菌劑的使用及其效果第108頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

各種外植體的滅菌方法

（1）莖尖、莖段及葉片等的消毒植物的莖、葉部分多暴露于空氣中，有的具有茸毛、油脂、蠟質和刺等，在栽培上又受到泥、肥中的雜菌污染，所以消毒前要經自來水較長時間的沖洗。消毒時要用70%的酒精浸泡數秒，無菌水沖洗2～3次，然后按材料的老、嫩和枝條的堅實程度，分別采用2%～10%的次氯酸鈉溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入幾滴吐溫-80，消毒后用無菌水沖洗3次后方可接種。二、外植體的滅菌第109頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）果實及種子的消毒根據清潔度，用自來水沖洗10～20分鐘，甚至更長時間。再用純酒精迅速漂洗一下。果實用2%次氯酸鈉溶液浸10min后，用無菌水沖洗2～3次，就可取出果實內的種子或組織進行培養(yǎng)。種子則要先用10%次氯酸鈉浸泡20～30min甚至幾小時。對難以消毒的還可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒5min。進行胚或胚乳培養(yǎng)，對種皮太硬的種子，可先去掉種皮，再用4%～10%的次氯酸鈉溶液浸泡8～10min，經無菌水沖洗后，即可取出接種。二、外植體的滅菌第110頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）花藥的消毒用于培養(yǎng)的花藥，實際上多未成熟，由于它的外面有花萼、花瓣或穎片保護，通常處于無菌狀態(tài)，所以只要將整個花蕾或幼穗消毒就可以了。一般用70%酒精浸泡數秒，然后用無菌水沖洗2～3次，再在漂白粉清液中浸泡10分鐘，經無菌水沖洗2～3次即可接種。二、外植體的滅菌第111頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

（4）根及地下部器官的消毒根和地下部器官生長于土中消毒較為困難。除預先用自來水洗滌外，還應用軟毛刷刷洗，用刀切去損傷及污染嚴重部位，吸水紙吸干后，再用酒精漂洗?？刹捎?.1%～0.2%升汞浸5～10min或2%次氯酸鈉溶液浸10～15min，然后以無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干后可接種。

二、外植體的滅菌第112頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月二、外植體的滅菌總的來說有以下幾點：（1）對植體進行修剪去掉不需要的部分。（2）在流水下進行對外植體表面灰塵沖洗。（3）用70%酒精浸10—30秒不等殺死外植體表面的細菌。（4）用無菌水沖洗表面殘余的酒精3----5遍.（5）用0.1%的氯化汞浸泡10分鐘。（6）倒出氯化汞，用無菌水沖洗外植體3-5遍。（7）用濾紙進行吸干外植體之后進行切割。第113頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、外植體的接種和培養(yǎng)

（一）無菌操作(接種工作)

（二）外植體的培養(yǎng)

第114頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

植物組織培養(yǎng)的接種是把經過表面消毒后的植物材料切碎或分離出器官、組織細胞，并把它們轉放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程，是一種無菌技術。整個操作的過程，一切用具、材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)室、工作人員的衣物都要無菌。在操作過程中引起的污染，主要是由材料本身帶菌和工作人員本身引起的。

（一）無菌操作

三、外植體的接種和培養(yǎng)第115頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

植物組織培養(yǎng)技術實際上是一種無菌操作和無菌培養(yǎng)技術，做好接種室的消毒是至關重要的。污染的主要來源是空氣中的細菌和真菌孢子，因此，每次接種前半小時應進行地面的清潔衛(wèi)生工作，并用70％酒精噴霧使空氣的灰塵沉降。用紫外線燈照射20分鐘。接種前工作臺面要用新潔爾滅或酒精擦洗。

（1）接種室的消毒三、外植體的接種和培養(yǎng)第116頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）工作人員要求

①入無菌室前，要洗手。②入室時要穿上經過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。③操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要經常用酒精擦洗手。不準講話，以免微生物污染材料、培養(yǎng)基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。

三、外植體的接種和培養(yǎng)第117頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月?lián)Q上工作服擦工作臺酒精擦拭手第118頁，課件共131頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）材料的切取切取和接種較大的材料肉眼觀察即可操作