第3章核酸化學(xué)-32hr修改稿教學(xué)課件

第三章

核酸化學(xué)

一．核酸研究的歷史和重要性

歷史：

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1896年瑞士青年科學(xué)家F.Miescher首先發(fā)現(xiàn)核酸。

從外科繃帶的膿細(xì)胞核中分離到含磷很高的酸性化

合物——稱為核素。

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后經(jīng)40-50年的證明核酸的組成——核苷酸單體

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19世紀(jì)末—20世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)：

核酸的四種堿基；核糖核酸(RNA)

根據(jù)核糖不同核酸可分為

脫氧核糖核酸(DNA)l

1944年Avery（美）OswaldTheodoreAvery，

(1877～1955）加拿大生物化學(xué)家

通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗證明DNA是遺傳物質(zhì)——功能。

l

1953年Watson（美）Crick（英）

提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。l

1960年Crick提出了中心法則。

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1973年初DNA體外重組成功。

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2019年人類基因組計劃。

重要性：核酸是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)；

多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)是DNA；

少數(shù)病毒以RNA作為遺傳物質(zhì)。二．核酸的分類

根據(jù)含戊糖的不同分為：RNA——核糖核酸

DNA脫氧核糖核酸

DNA：含脫氧核糖，98%以上存在于細(xì)胞核中。

在核中與組蛋白結(jié)合成核蛋白，形成染色體；

少量存在于線粒體、葉綠葉、質(zhì)粒中。

RNA：90%存在于細(xì)胞質(zhì)中，10%在核中。信使核糖核酸mRNA

RNA按功能分為轉(zhuǎn)運核糖核酸t(yī)RNA

核糖體核糖核酸rRNA

l信使核糖核酸mRNA：

在核中合成，存在于細(xì)胞質(zhì)中；

作為蛋白質(zhì)合成的模板，是將DNA的遺傳信息傳遞

到蛋白質(zhì)的橋梁。

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轉(zhuǎn)運核糖核酸t(yī)RNA：

在核中合成，存在于細(xì)胞質(zhì)中；

作為搬運的工具，攜帶轉(zhuǎn)運氨基酸到核糖體。l

核糖體核糖核酸rRNA：

在核仁中合成，存在于細(xì)胞質(zhì)中；

與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成核糖體，作為蛋白質(zhì)合成場所。三．核酸的組成

（一）元素組成

C、H、O、N、P，個別含S

P含量比較恒定，約9～10%，是核酸的特征元素。

測核酸含量常用定P法：

◆各種核酸含磷量比較接近；

◆磷易于測定。

1gP≈10.5g核酸（二）化學(xué)組成——核酸的基本組成單位是核苷酸

兩類核酸（DNA，RNA）經(jīng)不同程度的水解可得到

一系列產(chǎn)物，完全水解的三類終產(chǎn)物是：

磷酸、戊糖（5C）、堿基。

磷酸

核酸→核苷酸戊糖（核糖或脫氧核糖）

核苷

堿基（嘌呤或嘧啶）

兩類核酸（DNA與RNA）的區(qū)別:戊糖、堿基差異。

戊糖（β－D－核糖）

RNA

堿基（腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶）

戊糖（β－D－2－脫氧核糖）

DNA

堿基（腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶）1．磷酸：RNA、DNA兩類核酸均含有。

2．核糖和脫氧核糖

1‘1‘2‘2‘3‘3‘4‘5‘4‘5‘3．堿基－嘌呤堿和嘧啶堿

堿基：是一些含N的雜環(huán)化合物，是嘌呤和嘧啶的衍生

物，具有堿性。

（1）嘧啶堿

三種基本嘧啶堿基：

嘧啶

稀有堿基：核酸中一些含量甚少的堿基，大多是由基本

堿基上發(fā)生甲基化。（2）嘌呤堿：

由一個嘧啶環(huán)和一個咪唑環(huán)形成的雜稠環(huán)。

兩種基本嘌呤堿基：

嘌呤

NH2

糖苷鍵4．核苷：由堿基和戊糖脫水縮合而成的糖苷。

堿基與糖連接方式：糖苷鍵（N－糖苷鍵）

嘧啶核苷：C1′－N1

：由糖C1′與嘧啶N1相連。

嘌呤核苷：C1′－N9

：由糖C1′與嘌呤N9相連。根據(jù)所含戊糖不同分為↗核糖核苷－核苷

↘脫氧核糖核苷－脫氧核苷

嘧啶核苷嘌呤核苷

堿基環(huán)元素編號：1,2,3等；

糖環(huán)元素編號：1′,2′,3′等。

核苷命名：先讀堿基名稱。如：腺苷，胞苷，尿苷。1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)5．核苷酸

核苷酸：由核苷與磷酸形成的磷酸酯叫核苷酸。

由核苷的戊糖的－OH與磷酸成酯。

核糖上有三個自由羥基（2’、3’、5’）可與磷酸成酯，

可形成三種形式的核苷酸：2’-核苷酸；

3’-核苷酸；

5’-核苷酸。

舉例：

脫氧核糖有兩個自由羥基（3’、5’）可與磷酸成酯，

可形成兩種形式的核苷酸：3’-脫氧核苷酸；

5’-脫氧核苷酸。

舉例：

生物體內(nèi)存在的核苷酸多為5’-核苷酸。6．多磷酸核苷酸

核苷酸含有不止一個磷酸，為多磷酸核苷酸，在體

內(nèi)具有重要的生理作用。

如：參與體內(nèi)多種物質(zhì)合成代謝。

AMP：腺苷一磷酸

ADP：腺苷二磷酸

ATP：腺苷三磷酸

7．環(huán)狀核苷酸。

如：3’、5’-環(huán)狀腺苷酸。

磷酸與核糖的3’及5’位碳同時以兩個酯鍵相連。

作用：環(huán)狀核苷酸含量很少，但是在體內(nèi)的代謝中起

重要的調(diào)節(jié)作用。常見的有cAMP，cGMP。四、DNA的結(jié)構(gòu)（deaxyribonucleicacid-DNA）

DNA形狀：多為雙鏈，少數(shù)單鏈；

多為線狀（單、雙），

少數(shù)環(huán)狀（單、雙）；

無支鏈。

分子量大：106——109。

一級結(jié)構(gòu)

DNA的結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)

空間結(jié)構(gòu)

三級結(jié)構(gòu)（一）

DNA的一級結(jié)構(gòu)

1．構(gòu)成DNA的各種脫氧核苷酸的排列順序。

核苷酸連接方式：3′,5′—磷酸二酯鍵。

5’5’3’3’簡寫式

（1）線條式：

豎線表示核糖的碳鏈；

A、T、G、C——堿基；

P——磷酸基；

P一端與C3’相連，另一端與C5’相連；

（2）文字式：

P——在堿基左側(cè)表示P與C5’相連；

在堿基右側(cè)表示P與C3’相連。（二）DNA的二級結(jié)構(gòu)——DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，由Watson，Crick于1953年提出。

1．雙螺旋結(jié)構(gòu)的模型要點:

（1）DNA由兩條多核苷酸鏈圍繞同一中心軸向右纏繞成雙螺

旋，兩鏈彼此平行，走向相反。

2.0nm小溝大溝（2）每條鏈以脫氧核糖和磷酸為骨架(主鏈），處在

雙螺旋的外側(cè)；

糖與磷酸之間以磷酸二酯鍵相連；

糖環(huán)平面基本與螺旋軸平行。

2.0nm小溝大溝（3）堿基在雙螺旋內(nèi)側(cè)，堿基環(huán)平面與螺旋軸相垂

直，兩相鄰堿基之間的距離為0.34nm——堿基堆

積距離。

2.0nm小溝大溝（4）兩條鏈之間通過堿基之間的氫鍵結(jié)合在一起；兩

鏈間形成氫鍵具有一定的堿基配對原則。

配對原則：由一條鏈的嘌呤堿與另一條鏈的嘧啶堿

配對——堿基互補；

而且必須A與T配對，形成兩條氫鍵A=T；

G與C配對，形成三條氫鏈G≡C。.

配對的堿基彼此稱為互補堿基。

根據(jù)堿基互補原則，當(dāng)一條多核苷酸鏈的序列確定后即

可推知另一條互補鏈的序列。（5）螺旋每上升一圈，含十對堿基，上升一圈的距離

3.4nm，兩相鄰核苷酸之間的夾角為36°，螺旋

直徑為2nm。

成對堿基大致在同一平面，堿基與螺旋軸垂直；

兩相鄰堿基之間的距離為0.34nm

——堿基堆積距離。

上述為B-型DNA的結(jié)構(gòu)，生物體主要為B-DNA。

其他結(jié)構(gòu)：A-DNA,；

C-DNA；

Z-DNA。

（6）多數(shù)天然DNA為雙鏈結(jié)構(gòu)（dsDNA），少數(shù)病毒

DNA為單鏈（ssDNA）。2．維持DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的作用力

（1）互補堿基對之間的H鍵——不是主要力

因為H鍵的力很小，而且斷裂時具有協(xié)同性。

（2）堿基堆積力——主要作用力

堿基對之間電子云可以在一定程度上相互交蓋，

形成堿基堆積力。

(3)離子鍵

由磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷與介質(zhì)中陽離子之間形成。

減少了DNA分子自身的斥力。（三）DNA的三級結(jié)構(gòu)

三級結(jié)構(gòu)：指DNA在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步卷曲

或再次螺旋，即為三級結(jié)構(gòu)。四、DNA與基因組

（一）

DNA與基因

基因：DNA分子中最小的功能單位稱為基因。

基因：結(jié)構(gòu)基因

調(diào)節(jié)基因

基因組：某種生物體所含的全部基因的總和稱為該生物

的基因組。（二）原核生物與真核生物基因組特點

原核生物：基因組比較簡單，通常只有一個DNA分子

（一個染色體，且分子比較小。

真核生物：基因組比較復(fù)雜，一般含有若干個DNA分

子（多個染色體）。

如：人23對染色體。五、RNA的結(jié)構(gòu)與功能

RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，有多種不同功能，多數(shù)天然RNA分子為一條單鏈，一些區(qū)域可自身回折，形成局部的雙螺旋。

堿基組成：四種：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、

胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U）；

還有一些稀有堿基。

堿基之間不像DNA那樣有嚴(yán)格的組成規(guī)律

即：A≠U，G≠C；

但：A≈U，G≈C。

原因：RNA分子為單鏈不是雙螺旋，只有局部回折形

成雙螺旋。(一)tRNA

含量：占全部RNA的15%。

功能：

1．?dāng)y帶轉(zhuǎn)運AA到核糖體，合成蛋白質(zhì)；

tRNA的AA臂與AA結(jié)合攜帶AA，每種AA只能由特

定的tRNA搬運；2．識別密碼——反密碼子環(huán)上的反密碼子能與mRNA

上的密碼子通過堿基互補配對而識別、結(jié)合。

特點：每種AA至少有一種特定的tRNA。

細(xì)胞內(nèi)一般有50種以上不同的tRNA。

真核細(xì)胞生物細(xì)胞tRNA甚至可多達(dá)100多種。結(jié)構(gòu)特點：

1．分子量比較小25000道爾頓左右，由70-90個堿基組

成，沉降系數(shù)4s左右。

2．堿基組成有較多的稀有堿基。

3．3’-端都為——CpCpA-OH。接合活化的氨基酸（與

氨基酸結(jié)合）故稱為接受末端。

4．5’端，大多為pG…或者pC…..。5．二級結(jié)構(gòu)都呈類似的三葉草結(jié)構(gòu)：

葉柄：有局部雙螺旋構(gòu)成，A=U，G=C配對。

三片小葉：由突環(huán)構(gòu)成。三葉草分為以下幾部分：

l

氨基酸臂：

7對堿基對組成，富含G，包括3’和5’兩個末端。

3’-末端最后三個堿基CCA-OH，接受活化氨基酸。

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二氫尿嘧啶環(huán)：含兩個二氫尿嘧啶。

環(huán)：由8-12個核苷酸組成。

臂：由3-4對堿基對——二氫尿嘧啶臂。

l

反密碼子環(huán)

環(huán)：7個核苷酸組成，環(huán)正中三個核苷酸為反密碼子。

臂：由5對堿基組成。l

額外環(huán)

由3-18個核苷酸組成，環(huán)大小變化較大，不同的

tRNA具有大小不同的額外環(huán)。

l

TΨC環(huán)

環(huán)：由7個堿基組成，大多tRNA均含T和Ψ。

T——胸腺嘧啶核糖核苷

Ψ——假尿嘧啶核苷

臂：由5對堿基組成。6．三級結(jié)構(gòu)

在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，整個分子的扭曲使未配對堿基按堿基配對原則形成氫鍵，構(gòu)成三維結(jié)構(gòu)，似一倒“L”形。（二）

rRNA

含量：占全部RNA的80%左右，存在于核糖體內(nèi)。

作用：

（1）與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體，作為蛋白質(zhì)合成場所。

核糖體＝rRNA（60%）+蛋白質(zhì)（40%）

（2）在蛋白質(zhì)合成中起催化作用。核糖體（核蛋白體，核糖核蛋白體）：

分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微小顆粒，直徑20—30nm。

游離存在（少）；附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上（多數(shù)）。

特點：成分穩(wěn)定代謝不活躍，分子量大10-6。

核糖體為一大一小兩個亞基，原核真核不同。

rRNA結(jié)構(gòu)——類三葉草（三）

mRNA

含量：占全部RNA的3-5%。

作用：以DNA為模板合成，作為蛋白質(zhì)合成的模板，

mRNA的核苷酸序列，決定相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基

酸序列。

將DNA的遺傳信息傳向蛋白質(zhì)的橋梁。

特點：代謝活躍，更新快，分子量差異較大。

（四）RNA的其它功能

1981年發(fā)現(xiàn)有些RNA具有生物催化劑的功能。

核酶：具有催化活性的RNA。四、核酸的性質(zhì)

（一）一般理化性質(zhì)

1．兩性性質(zhì)

核酸含酸性的磷酸基和堿性的堿基（嘌呤，嘧啶）

為兩性電解質(zhì)，但是通常表現(xiàn)為酸性。

2．DNA、RNA分子量都很大DNA＞RNA。

DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末。

微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。常用乙醇從溶液中沉

淀核酸。3．粘度很大

DNA為線性或環(huán)狀分子，長約1um-4um不等，直徑

2nm。

直徑：長度可達(dá)到10-7，故黏度很大。

RNA粘度<DNA

DNA由于形成雙螺旋，分子具有一定的剛性。

但由于直徑：長度比很大，又有一定的柔性。（二）

紫外吸收性質(zhì)

核酸的堿基對240-290nm紫外光有強(qiáng)烈的吸收。其

最大的吸收峰在260nm。應(yīng)用：

１．純度鑒定——定性

最大吸收峰：核酸：260nm

蛋白質(zhì)：280nm

由OD260/OD280比值可鑒定核酸的純度。

∵純DNAOD260/OD280為1.8

純RNAOD260/OD280為2.0

∴如果核酸中含蛋白質(zhì)雜質(zhì)，OD260/OD280↓。

（蛋白質(zhì)λMAX=280nm）；

DNA中含RNA雜質(zhì)，OD260/OD280↑。2．DNA和RNA的定量測定

（1）純核酸樣品由OD260可直接測含量。

（條件：pH=7,比色皿厚度1cm）

1OD=50ug/mlDNA雙螺旋

1OD=40ug/ml單鏈DNAorRNA

1OD=20ug/ml寡聚核苷酸（2）由摩爾磷消光系數(shù)表示核酸含量

摩爾磷消光系數(shù)ε(p)：

每升含1mol磷的核酸溶液(pH7)的消光值(光吸收

值)。

在260nm天然RNAε(p)7000--10000

天然DNAε(p)6000--8000（三）核酸的變性

1.核酸變性：受某些理化因素的影響，核酸分子中雙螺

旋堿基對之間的氫鍵而破裂，雙螺旋解開

變成單鏈的過程。（分子量不變）變性因素：（１）溫度升高。

（２）有機(jī)溶劑。

（３）變性劑。

（４）4>pH>10。變性結(jié)果：

（１）紫外吸收增加-----增色效應(yīng)：

由于核酸變性而引起紫外吸收增加的現(xiàn)象。

原因：變性后堿基暴露，光吸收增強(qiáng)。

（２）粘度下降。（η↓）

原因：分子由雙螺旋（具有一定剛性）變成線

團(tuán)狀。

（３）浮力密度上升。（ρ↑）

（４）生物活性喪失。2.DNA熱變性和Tm：

過程：

DNA溶于稀鹽溶液→加溫到80-100℃→雙螺旋H鍵斷

裂成兩股單鏈，紫外吸收驟然增加。

熱變性特點：

爆發(fā)式的——變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)，

而不是隨溫度升高而逐漸發(fā)生，類似固態(tài)

結(jié)晶的熔解。

DNA熱變性溫度稱為熔點（融點），用Tm表示

Tm：紫外吸收的增加量（增色效應(yīng)）達(dá)最大量一半時的

溫度。

（加熱變性使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度。）

DNATm值一般在70—85℃，不同的DNA，Tm不同。3．影響Tm的因素

（1）G-C含量：

含G-C高，Tm高；因為G-C含3對氫鍵；

含A-T高，Tm低；因為A-T含2對氫鍵。

（2）溶液的離子強(qiáng)度：

離子強(qiáng)度低，Tm低。

（3）溶液pH：高pH使核酸失去質(zhì)子，喪生成H鍵的

能力。低pH易脫嘌呤。

（4）變性劑——破壞H鍵（四）復(fù)性

復(fù)性：變性的DNA在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開的互補

鏈重新堿基配對形成雙螺旋的過程。

DNA熱變性及復(fù)性示意圖

復(fù)性后一系列理化物性及生物學(xué)活性可恢復(fù)。

減色效應(yīng)：核酸在復(fù)性過程中紫外吸收值降低的現(xiàn)象。影響復(fù)性的因素：

(1)

熱變性的DNA：緩慢冷卻可復(fù)性，且可逆復(fù)性。

——退火(Annealing)。

驟然冷卻不可復(fù)性。（2）單鏈濃度高，隨機(jī)碰撞機(jī)會多，復(fù)性速度快。

（3）片斷大，不易復(fù)性。

（4）片斷重復(fù)序列高，易復(fù)性。

（5）維持溶液一定的離子強(qiáng)度，以減少核酸磷酸基的

負(fù)電荷斥力。

五、核酸的分子雜交和印跡技術(shù)

分子雜交：不同來源的單鏈DNA，如有相同區(qū)段（堿

基互補區(qū)），互補形成雙鏈DNA—DNA，

or單鏈DNA與RNA互補形成DNA—RNA

雜合雙鏈的過程叫分子雜交。雜交可發(fā)生在：

DNA–DNA:Southern