食品的一般成分分析

食品的一般成分分析第1頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1水分水是食品的重要組成成分，不同種類的食品，水分含量差別大。水分是食品分析的重要項(xiàng)目之一。水分測(cè)定對(duì)于計(jì)算生產(chǎn)中的物料平衡，和實(shí)行工藝監(jiān)督等方面，有很重要的意義。各種食品水分的含量差別很大。例如，鮮果為69.7%-92.5%，鮮菜為79.7%-97.1%，鮮瘦肉52.6-77.4%，面粉12-14%。面包水分隨品種不同略有差異，一般為32-42%。第2頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月食品中水分可分為結(jié)合水和自由水兩大類。自由水：存在于食品表面濕潤(rùn)水分、滲透水分和毛細(xì)管水，其具有天然水的性質(zhì)。結(jié)合水：與食品中的親水物質(zhì)緊密結(jié)合，一般指吸附水和結(jié)晶水。從結(jié)合水到自由水是逐漸過渡的。第3頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1.1直接干燥法采用比水的沸點(diǎn)稍高的溫度（105oC)加熱試樣一定時(shí)間，讓水分充分蒸發(fā)，根據(jù)試樣減輕的質(zhì)量計(jì)算水分的含量。直接干燥法適用于95～105oC下，不含或含其他揮發(fā)性物質(zhì)甚微的食品。第4頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月測(cè)定方法:取干凈的鋁盒,置于95~105oC干燥烘箱內(nèi),烘30~60min,取出,冷至室溫稱重,烘前后兩次稱重值差不超過2mg為恒重.精密稱取試樣2.00~10.00g于恒重鋁盒內(nèi),烘3h.取出,冷至室溫稱重,復(fù)烘30min,前后兩次稱重值差不超過2mg為恒重.第5頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項(xiàng)不同地區(qū)、國家對(duì)加熱干燥法測(cè)定水分的條件規(guī)定不盡相同。誤差來源于樣品細(xì)度、烘干時(shí)間和溫度。水分的去除通過兩個(gè)階段完成最好。兩次干燥法。樣品的水分的揮發(fā)量與干燥的時(shí)間和溫度有關(guān)。第6頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1.2減壓干燥法利用真空烘箱中的低壓,使樣品水分在100oC的溫度下?lián)]發(fā),根據(jù)樣品減輕的質(zhì)量計(jì)算樣品的水分.適用于105oC左右的溫度下組分易發(fā)生變化的食品如糖漿、果糖、麥乳精、果蔬等的水分測(cè)定。第7頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月測(cè)定方法（GB/T5009.3-2003)精密稱取試樣2.00~10.00g于恒重鋁盒內(nèi),置于真空烘箱中,關(guān)緊箱門,抽至工作壓力40~50kPa,在60oC±5oC溫度下烘4h,緩緩放進(jìn)干燥空氣,打開箱門,冷至室溫稱重,兩次稱重值差不超過2mg為恒重.注意事項(xiàng)：樣品要放置在溫度計(jì)附近.放進(jìn)空氣時(shí)要緩慢第8頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1.3共沸蒸餾法

蒸餾法采用了一種有效的熱交換方式，水分可被迅速移去，食品組分所發(fā)生的化學(xué)變化，諸如氧化，分解等作用，都較常壓烘箱法為小。蒸餾法有多種形式。應(yīng)用最廣的蒸餾法，叫做共沸蒸餾法。裝置如圖。現(xiàn)將共沸蒸餾法則要介紹如下：第9頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月試樣中加入與水不相溶的有機(jī)溶劑,使水分與有機(jī)溶劑形成共沸混合物而降低沸點(diǎn),加熱,使水分連同溶劑一并蒸出,冷凝之并收集在容器中,根據(jù)所得水分的容量計(jì)算被測(cè)物的含水量.第10頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月有機(jī)溶劑種類很多,最常用的是甲苯,苯,二甲苯.下表列舉了一些有機(jī)溶劑的物理常數(shù)。

通常按照下列因素選擇溶劑，如能否完全濕潤(rùn)樣品，適當(dāng)?shù)臒醾鲗?dǎo)，化學(xué)惰性，可燃性以及樣品的性質(zhì)等，樣品性質(zhì)是選擇溶劑的重要依據(jù)。

第11頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)生誤差的原因及其防止:產(chǎn)生誤差的原因很多。例如，樣品中水分沒完全揮發(fā)出來；水分附集在冷凝器及連接管的內(nèi)壁；水分溶解在有機(jī)溶劑中；生成了乳濁液，等等。添加少量戊醇，異丁醇，可防止出現(xiàn)乳濁液；對(duì)熱不穩(wěn)定性的食品，除用低沸點(diǎn)的溶劑外，也可發(fā)散涂布于硅藻土上；為了防止水分附集于蒸餾器內(nèi)壁，須充分清洗儀器。

第12頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1.4快速水分分析法基于紅外線和微波干燥技術(shù)的精密儀器，他們采用高熱源，測(cè)定水分含量為0.005%~100%、質(zhì)量為15mg~40g不等的樣品。自動(dòng)化第13頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1.5卡爾-費(fèi)歇爾(KcalFisher)法適合于測(cè)定低水分含量的食品,如脫水水果和蔬菜,糖果和巧克力及高糖高蛋白低水分樣品.原理:水存在時(shí),碘與二氧化硫發(fā)生氧化還原反應(yīng):SO2+I2+2H2O=H2SO4+2HI為使反應(yīng)向右進(jìn)行到底,體系中加適量吡啶和甲醇:C5H5N?I2+C5H5N?SO2+C5H5N+H2O2C5H5N?HI+C5H5N?SO3C5H5N?SO3+CH3OHC5H5N(H)SO4?CH3

第14頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月此法測(cè)得的水分是真實(shí)水分.碘-二氧化硫-吡啶按1:3:10比例溶解在甲醇中,稱為卡爾-費(fèi)歇爾試劑.用此卡爾-費(fèi)歇爾試劑滴定至剛出現(xiàn)微弱黃棕色,表示有過量的碘存在,說明滴定已達(dá)到終點(diǎn).第15頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月卡爾-費(fèi)歇爾(KcalFisher)儀第16頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1.6紅外吸收光譜法近紅外(NIR)范圍(1400~1450nm,1920~1950nm)是水分子-OH的特征波段.NIR法廣泛用于各類食品的水分分析.第17頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2糖類糖在糧食、食品及微生物發(fā)酵研究中具有重要的意義。他是一種重要的功能性食品基料。在植物中糖類占干重85～90%如植物細(xì)胞壁，棉花樹木—纖維素，水稻，土豆—淀粉，水果—G，F(xiàn)動(dòng)物血液—G，肝臟，肌肉—糖原，乳汁—乳糖核糖和脫氧核糖存在于DNA，RNA中是所有生物共有的。第18頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月

單糖（Monosaccharides）：不能被水解成更小分子的糖類，也稱為簡(jiǎn)單糖，3C—7C（丙糖——庚糖），常見的是5C和6C糖，核糖，葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖。

寡糖（Oligosaccharides）：水解時(shí)生成幾個(gè)單糖（2—10個(gè)），有用的是雙（二）糖（蔗糖、麥牙糖、乳糖）多糖（Polysaccharides）：水解時(shí)產(chǎn)生20個(gè)以上單糖分子的糖類，包括：同多糖（由一種單糖或其衍生物構(gòu)成，如淀粉、糖原）雜多糖（由一種以上單糖或其衍生物構(gòu)成如，半纖維素、透明質(zhì)酸）。

復(fù)合糖（Combinesaccharides）：糖蛋白和糖脂

糖衍生物（Sugarderivatives）：糖胺、糖酸和糖酯

第19頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月糖類樣品預(yù)處理食品中糖類常與蛋白質(zhì)、脂類和鹽類混雜在一起，導(dǎo)致色譜柱污染，柱壓上升，嚴(yán)重影響色譜柱的分辯率。糖類樣品預(yù)處理是除去混雜物以免污染色譜柱和干擾糖類的分離、分析。糖類樣品預(yù)處理包括提取、除雜質(zhì)凈化和樣品濃縮。第20頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月注意：1、糖易吸濕，因此標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)預(yù)先干燥。2、樣品溫度不能超過80oC。3、雙糖在稀酸溶液中易水解。4、稀糖溶液應(yīng)冷動(dòng)保存。5、象葡萄糖等，在水溶液中會(huì)發(fā)生異構(gòu)化，在堿性溶液中會(huì)發(fā)生烯醇化和降解。第21頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）提取糖酸飲料不需提取，需脫氣。組織中的多糖用熱水或沸水提取，用稀堿提取酸性多糖。低分子量糖類最常用的提取溶劑是80%乙醇，提取選擇性好，效率高，還可沉淀蛋白質(zhì)。第22頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）除雜質(zhì)、凈化用石油醚或乙醚、正己烷、四氯化碳等除去脂類。用乙醇沉淀法除蛋白質(zhì)：用三氯乙酸或高氯酸除蛋白；超濾法除蛋白；Somogyi法除蛋白。用各種離子交換樹脂或混合樹脂脫鹽。C18固相萃取柱。第23頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）樣品濃縮冰凍干燥法離心冷凍干燥法第24頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2.1氣相色譜法測(cè)定糖類氣相色譜要求試樣具有良好的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。需將糖類衍生成具有易揮發(fā)，對(duì)熱穩(wěn)定的衍生物。糖類衍生化(1)三甲基硅醚衍生物是糖的羥基衍生化主要方式之一。優(yōu)點(diǎn)：衍生物揮發(fā)性強(qiáng)，制備快速、簡(jiǎn)便。缺點(diǎn)：由于各種單糖異構(gòu)體和不同大小環(huán)的特殊單糖的存在，色譜峰多于組分單糖數(shù)目，定性定量分析復(fù)雜化第25頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）糖的三氟醋酸酯衍生物和糖醇醋酸酯衍生物糖的三氟醋酸酯衍生物揮發(fā)性強(qiáng)，可用強(qiáng)極性柱分離，分離率顯著提高，試樣量顯著減少。糖醇醋酸酯衍生物優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)糖只有一個(gè)峰，衍生物十分穩(wěn)定，缺點(diǎn)是操作麻煩且耗時(shí)。（3）糖肟和糖腈衍生物糖和鹽酸羥胺在吡啶溶液中加熱反應(yīng)生成糖肟,糖肟可解決異頭碳原子的鑒別.硅烷化的糖肟色譜的復(fù)雜程度大大降低.在糖肟的吡啶溶液中加入醋酸酐,加熱反應(yīng)生成糖腈乙酯衍生物.第26頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）手性糖苷的衍生化試樣經(jīng)HCl-丁醇水解后,用碳酸銀中和,濾液徹底干燥,經(jīng)三甲基硅烷化后,用氣相色譜分離.用三氟乙酸的(+)2-辛醇預(yù)處理后再乙?；?（5）氨基糖的衍生化用4mol/L三氟乙酸將試樣水解,然后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成O-甲基肟乙酸鹽,可使中性糖和氨基糖同時(shí)衍生化,在氣相色譜中很好的分離.（6）糖醛酸的衍生化醛糖和糖醛酸的混合物先用硼氫化鈉還原,當(dāng)糖醛酸內(nèi)酯化后,用正丙胺將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的N-(1-丙基)-醛胺,然后用醋酐和吡啶將其乙?；?第27頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月氣相色譜分離鑒定衍生化糖使用氫火焰離子化檢測(cè)器(FID）。如果三氟乙?；?可使用選擇性電子捕獲檢測(cè)器(ECD),它可檢測(cè)10-12g級(jí)含量的糖.衍生化糖的氣相色譜測(cè)定第28頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月鑒定蜂蜜中是否摻假淀粉糖漿第29頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月第31頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2.2高效液相色譜測(cè)定糖類直接進(jìn)樣，快速，方便，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，特別適合某些熱敏感糖類。（1）鍵合相色譜氨基鍵合相色譜是最重要的一種糖類分析色譜體系，適用于分析單糖、雙糖及寡糖等。第33頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)離子交換色譜離子交換柱不需要每次再生，柱有較好的耐受性。用于糖類分析的有季銨硼酸型陰離子交換樹脂;表面薄殼型陰離子交換樹脂;聚苯乙烯型陽離子交換樹脂.第36頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)凝膠色譜快速,高分辨率,重復(fù)性好.高效凝膠滲透色譜法用于測(cè)定多糖的純度和分子量及制備性的分離多糖.第37頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月流動(dòng)相:水,緩沖液和含水的有機(jī)溶劑.分離相對(duì)分子量為5000~1000000的多糖.第38頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月HPLC分離分析單糖混合物常用離子交換型柱和吸附型柱.吸附色譜或正相色譜適用于寡糖衍生物的分析.多糖中所用的多是高效體積排斥色譜(HPSEC).第39頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月第40頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2.3毛細(xì)管電泳檢測(cè)法用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)可分離衍生化糖類.CE結(jié)合TOF及CE/MS可對(duì)糖肽,糖蛋白,糖脂等進(jìn)行分析.第41頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3維生素維生素（vitamin）是機(jī)體維持正常功能所必需，但在人體內(nèi)不能合成或合成量很少，必須由食物供給的一組低分子量有機(jī)物質(zhì)。維生素的功能通常是作為酶的輔助因子（輔酶與輔基）。因此它對(duì)動(dòng)物體正常生長(zhǎng)與健康是必需的。第43頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月維生素的種類繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)差異很大，通常接溶解性質(zhì)將其分為脂溶性維生素（lipid-solublevitamins）和水溶性維生素（water-solublevitamins）兩大類。根據(jù)分布情況，水溶性維生素又可分為B族維生素與維生素C兩類。第44頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3.1維生素A又名抗干眼病維生素，或視黃醇。維生素A性質(zhì)活潑，不穩(wěn)定，易被氧化，遇紫外光易分解。維生素A最大吸收波長(zhǎng)在325nm附近，具有天然熒光。第45頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月維生素A在食品中常以酯類形式存在，樣品用苛性堿－乙醇溶液在抗氧化劑保護(hù)下，加熱皂化后，可使其轉(zhuǎn)化為游離的維生素A，然后用有機(jī)溶劑提取。維生素A容易氧化，操作應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。通常采用RP-HPLC分析維生素A，其優(yōu)點(diǎn)是能以短鏈視黃酯作內(nèi)標(biāo)物，而且可能同時(shí)分離測(cè)定類胡蘿卜素、視黃酯及維生素E。但使用RP-HPLC時(shí)，往往需要先除去樣品的非極性溶劑，再將其溶解于流動(dòng)相或適宜溶劑中。在大多數(shù)情況下，紫外325nm檢測(cè)維生素A都能獲得足夠的靈敏度和選擇性，光電二極管陣列檢測(cè)器的應(yīng)用也越來越普遍。第46頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月牛奶、蛋黃中維生素A的HPLC測(cè)定如下：（1）樣品處理牛奶（50mL)、蛋黃(5g)乙醇60mL,50%NaOH20mL50oC回流30min乙醚提取，用蒸餾水洗滌提取液無水硫酸鈉脫水后，加0.2gBHT,定容100mL取10mL,在50oC恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用1.0mL無水甲醇溶解,搖勻后上機(jī)測(cè)定.第47頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)色譜條件：色譜柱為μBondapakC18(300mm×3.9mm);流動(dòng)相為甲醇-水（90：10）；流速1.0mL/min;UV325nm,或熒光檢測(cè)器，Em=480nm,Ex=325nm;進(jìn)樣2μL。第48頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月維生素D又稱為抗佝僂病維生素，是類固醇衍生物。主要包括D2（麥角鈣化醇）及D3（膽鈣化醇）。自然界中，最豐富的維生素D的來源是魚的肝臟和動(dòng)物體的內(nèi)臟。從樣品中提取維生素D的方法與提取維生素A的方法類似，先使用KOH或NaOH－乙醇皂化以除去類脂，再用有機(jī)溶劑提取，把水溶性的干擾成分除去，在提取時(shí)可加入抗氧化劑。5.3.2維生素D第49頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月測(cè)定維生素D的方法有比色法、分光光度法、氣相色譜法和高效液相色譜法。比色法由于它的精密度及選擇性差，只能用于較純樣品的測(cè)定。氣相色譜法需要對(duì)樣品衍生，操作麻煩。高效液相色譜法測(cè)定維生素D具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，被AOAC選為正式的方法。第50頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）氣相色譜法氣相色譜法測(cè)定維生素D通常用甲基或三甲基硅醚化，但在測(cè)定過程中，維生素D2和維生素D3在高溫（150oC)下容易形成兩種熱異構(gòu)物，并出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰。由于轉(zhuǎn)化成兩種熱異構(gòu)物的比率是一定的，故可用于維生素D的測(cè)定。第51頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）HPLCHPLC可以分離測(cè)定維生素D2和維生素D3的異構(gòu)體及其代謝產(chǎn)物，可以將維生素D與維生素D前體及α-生育酚、維生素A及其脂類分開。一般在硅膠柱上的正相模式進(jìn)行，也有用C18鍵合固定相，以甲醇或者乙腈做流動(dòng)相。維生素D具有強(qiáng)紫外吸收，一般選用紫外檢測(cè)器，λmax=265nm,λmin=228nm.第52頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月食品中同時(shí)含維生素D2和維生素D3的情況很少，植物性食品和強(qiáng)化食品主要含維生素D2，動(dòng)物性食品主要為維生素D3。在維生素D的色譜分析中，測(cè)定維生素D3通常用維生素D2作內(nèi)標(biāo)，反之亦然。第53頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3.3維生素E維生素E又稱生育酚（tocopherol），有六種，其中四種α、β、γ和δ種有生物活性。自然界以α-生育酚（結(jié)構(gòu)如下圖）分布最廣。維生素E在無氧條件下對(duì)熱穩(wěn)定，但對(duì)氧十分敏感，易自身氧化，能避免脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，因而能保護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。黃色粘油狀物，不溶于水，溶于有機(jī)溶劑。第54頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月動(dòng)物組織中所含維生素E的測(cè)定較復(fù)雜，在測(cè)定之前首先要除去類脂如膽固醇，它的存在會(huì)引起嚴(yán)重干擾。去除類脂通常采用有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑是氯仿、丙酮、乙醚和乙醇。從樣品中提取維生素E有皂化法及直接提取法兩種。直接提取法：用有機(jī)溶劑直接提取，然后在低溫下進(jìn)行濃縮結(jié)晶。除去脂類，將維生素E分離出來。對(duì)一些植物性樣品可以用熱的乙醇或丙二醇及氯仿在索氏提取器中將脂溶性物質(zhì)提出來。提取后凈化處理：固相萃取法和TLC等。第55頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）氣相色譜法氣相色譜法測(cè)定維生素E，樣品需要衍化，衍生產(chǎn)物通常是三甲基硅醚，用氫火焰離子檢測(cè)器。采用硅酮類的OV-1、OV-17作為固定相。硅酮類的OV-1、OV-17已用于食品（如大麥、面粉、谷物、脂肪和油脂）樣品的測(cè)定。三甲基硅醚化GC法測(cè)定動(dòng)物脂肪和植物油中的生育酚被推薦為IUPAC（1981）方法。第56頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）HPLC生育酚具有強(qiáng)熒光性，同時(shí)還對(duì)熒光檢測(cè)器有著故有的敏感和選擇性。因此維生素E測(cè)定時(shí)多選擇熒光檢測(cè)器（Ex295nm，Em330nm）。而生育酚酯熒光性較弱，若在色譜分析前未經(jīng)水解，則要用UV檢測(cè)器（280nm）。用甲醇從食品樣品中將維生素E提取出來，提取液通過反相色譜柱分離，分配體系進(jìn)行HPLC分析，用含水的甲醇溶液為流動(dòng)相，作恒流洗脫，在10min內(nèi)即可完成一次。采用紫外吸收檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。第57頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月水溶性維生素包括B族維生素和維生素C。水溶性維生素體內(nèi)過剩的部分均可由尿排出體外，因而在體內(nèi)很少蓄積，也不會(huì)因此而發(fā)生中毒。又因?yàn)樵隗w內(nèi)的儲(chǔ)存很少，所以必須經(jīng)常從食物中攝取。

第58頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3.4維生素C又稱L-抗壞血酸（ascorbicacid）。它在人體內(nèi)不能合成，必須依靠外界供給。維生素C不僅具有廣泛的生理功能，而且在食品工業(yè)上常用作抗氧化劑。因此測(cè)定食品中維生素C的含量用以評(píng)價(jià)食品品質(zhì)及食品加工過程中維生素C的變化情況具有重要的意義。測(cè)定維生素C的方法有2，4-二硝基苯肼氧化法、極譜法、熒光法、色譜法等，氣相色譜法很少應(yīng)用，現(xiàn)在多使用高效液相色譜法。第59頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）2，4-二硝基苯肼比色法（GB12392-90)

用草酸提取樣品，活性炭使提取液中還原型抗壞血酸氧化成為脫氫抗壞血酸，與2，4-二硝基苯肼作用生成紅色的脎，其呈色的強(qiáng)度與總抗壞血酸含量成正比。此法操作比較簡(jiǎn)便、快速，不需要特殊儀器，并適用于各種食品。第60頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）熒光法抗壞血酸在氧化劑存在下，被氧化成脫氫抗壞血酸，氧化型的抗壞血酸與鄰苯二胺作用生成有熒光的喹喔啉衍生物。此熒光化合物的激發(fā)波長(zhǎng)是350nm，熒光波長(zhǎng)在433nm，其熒光強(qiáng)度與抗壞血酸含量成正比。第61頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）氣相色譜法維生素C是種難揮發(fā)性的物質(zhì)，通常將其衍生為三甲基硅醚衍生物，用非極性固定液作固定相，F(xiàn)ID檢測(cè)，可以分離測(cè)定抗壞血酸、脫氫抗壞血酸和2，3-dioxo-古羅糖酸。食品中維生素C可用偏磷酸進(jìn)行提取，用纖維素層析柱去除干擾物質(zhì)，衍生化后測(cè)定。另一種方法是用乙醇提取食品中維生素C和非揮發(fā)性有機(jī)酸，加乙酸鉛進(jìn)行沉淀，再將維生素C變成游離態(tài)，衍生后測(cè)定。第62頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）液相色譜法

HPLC測(cè)定維生素C的分離方式主要有三大類：①反相鍵合相色譜，一般采用十八烷基硅烷鍵合相作固定相，極性溶劑作流動(dòng)相；②離子交換色譜，常采用帶離子交換基團(tuán)的硅膠鍵合相式離子交換樹脂作固定相，流動(dòng)相通常為酸性緩沖溶劑，有時(shí)在酸性緩沖溶劑中摻入一定量的有機(jī)溶劑；③反相離子對(duì)色譜，它是在維生素C的HPLC分析中采用最多的方法。通常采用帶烴基的非極性硅膠硅烷化鍵合相為固定相，以甲醇水溶液等極性溶液為流動(dòng)相，在流動(dòng)相中加入一種堿性反離子，常用的反離子為十二烷基三甲基銨鹽等各種季銨鹽。第63頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.4脂類和脂肪酸脂類包括油類、脂肪類和類脂三種基本形式。大部分構(gòu)成食物的脂肪和動(dòng)物體脂主要以甘油三酯為其基本結(jié)構(gòu)。甘油三酯實(shí)際上就是一分子甘油與三分子脂肪酸所形成的酯，構(gòu)成三個(gè)分子脂肪酸的種類很多，目前已知存在于自然界的脂肪酸有40多種。第64頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.4.1脂肪的提?。?）乙醚抽提法適用于一般食品，特別是脂肪含量比較高的，脂肪和組織結(jié)合比較少的，干燥的粉末和容易粉碎的食品。試樣粉碎或進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚?，除去水分等的脂肪容易被抽提，食品干燥狀態(tài)下適宜采用索氏抽提器的抽提方法。抽提用的乙醚或石油醚要求無水、無醇、無過氧化物，揮發(fā)殘?jiān)康?，因?yàn)樗痛紝?dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解，如水溶性鹽類、可溶性糖類等，可使測(cè)定結(jié)果偏高。過氧化物會(huì)導(dǎo)致脂肪氧化及在烘烤時(shí)也有引起爆炸的危險(xiǎn)。乙醚中的過氧化物，主要是在貯存過程中，由于空氣、光線和溫度的作用，致使乙醚緩慢氧化而形成的過氧化物。第65頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月檢查過氧化物的方法：取6ml乙醚，加2ml10％碘化鉀溶液，用力振搖，放置1min，若出現(xiàn)黃色，則證明有過氧化物存在。應(yīng)另選乙醚或處理后再用。除去乙醚中過氧化物的方法：取乙醚5份加10％亞硫酸鈉1份，加鹽酸酸化，振搖、靜置分層后，棄去水層，再用水洗至中性，用無水氯化鈣或無水硫酸鈉脫水后，再進(jìn)行恒溫（34.5℃）重蒸餾，重蒸餾時(shí)可放入無銹鐵絲幾段或光亮鋁片幾片，蒸餾后，再用無水氯化鈣或無水硫酸鈉脫水，放置一晝夜，取上層清液使用。第66頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）酸分解法適用于結(jié)合或包藏于組織中的脂肪。結(jié)合或包藏于組織中的脂肪常不溶于水，但加酸后因水解而形成液狀的食品，如：谷類、面包、通心粉、豆類、蛋類、蘑菇類、烹調(diào)加工食品等。（3）勒譯戈特里布（Roese-Crotflieb)法主要在牛奶和乳制品中的應(yīng)用，適用于含乳脂肪的食品和含脂量比較高的液狀或乳狀的食品。用乙醚抽提。（4）氯仿-甲醇混合液抽提法適用于大豆和大豆制品，蛋類等含磷脂等多的極性脂肪食品。氯仿-甲醇（2：1）抽提。第67頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.4.2脂類氣相色譜法分析大部分脂類在GC分析前必須經(jīng)過衍生化，因?yàn)樗鼈儾皇菗]發(fā)性差就是對(duì)熱不穩(wěn)定。由于脂類通常只含碳、氫、氧元素，檢測(cè)一般采用氫火焰離子檢測(cè)器（FID）。第68頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月除了食用油外，幾乎所有的脂類樣品都需要初提取。對(duì)含活性酶的生物組織樣提取，需要用降解酶預(yù)先將脂肪酶和脂氧合酶失活。游離脂肪可用有機(jī)溶劑直接提取，但結(jié)合了非脂類組分的脂類在萃取前需要酸水解等處理，以形成游離態(tài)。第69頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月舉例：脂肪酸酯的GC檢測(cè)脂肪酸酯用醚或氯仿－甲醇混合液提取后，用堿處理，甘油酯以及磷脂等構(gòu)成脂肪酸的物質(zhì)變成水溶性的堿鹽，然后用有機(jī)溶劑去除不皂化物（甾醇、萜烯、蠟等），再用酸水解，使其轉(zhuǎn)變成游離脂肪酸。經(jīng)硫酸甲酯化處理后成為脂肪酸甲酯，用GC分離各種脂肪酸。脂肪酸甲酯混合物大多采用填充柱進(jìn)行分離，常用為3％-20％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）固定液涂漬在惰性的擔(dān)體上，柱長(zhǎng)1.5-3.0m。固定液可使用極性的或非極性的，一般極性固定液對(duì)不飽和甲酯有較好的分離，不飽和甲酯的保留時(shí)間比飽和甲酯的保留時(shí)間長(zhǎng)，但在非極性固定液上洗脫順序剛好相反。第70頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月毛細(xì)管GC分析脂肪酸甲酯通常用極性固定相如Carbowax20M和SP-2340。不飽和脂肪酸在極性固定相上的分離效果要比非極性相好。多不飽和脂肪酸有著很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，魚油中所含的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）具有降血脂、抗血栓和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。鄭立立等研究了氣相色譜－紅外光譜聯(lián)用分析魚油中EPA和DHA的方法，采用氫火焰、紅外光譜雙檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)，建立了EPA和DHA的蒸氣相紅外標(biāo)準(zhǔn)譜圖和氣相色譜保留時(shí)間數(shù)據(jù)庫，提供了一種在無法找到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下對(duì)魚油中EPA和DHA進(jìn)行定性、定量分析的簡(jiǎn)便方法。第71頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.4.3脂類HPLC分析（1）脂肪脂肪的HPLC分離測(cè)定可采用正相色譜法和反相色譜法。一般而言，正相色譜法主要用于脂肪類別之間的分離，而反相色譜法多用于同族物質(zhì)的分離。由于反相色譜操作比較容易，因此應(yīng)用較多，其中以C18柱應(yīng)用最廣。采用RP－HPLC時(shí)非水流動(dòng)相更為有利，因?yàn)樗茉黾又镜娜芙舛龋乐乖谥铣霈F(xiàn)沉淀，提高柱效和穩(wěn)定性。第72頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月脂肪在反相柱上的洗脫順序與其碳鏈長(zhǎng)度和雙鍵數(shù)量有關(guān)。脂肪的不飽和度增加，出現(xiàn)峰較早，但鏈長(zhǎng)增加，則出峰較遲。由于碳鏈長(zhǎng)度和雙鍵數(shù)量對(duì)保留時(shí)間影響正好相反，因此高碳數(shù)的飽和脂肪和多不飽和脂肪的峰形會(huì)出現(xiàn)重疊。通常反式異構(gòu)體在對(duì)應(yīng)的順式后出峰，雙鍵的位置越接近羧基保留時(shí)間越短。第73頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月

HPLC分析脂類最常用的檢測(cè)器是蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）。它具有以下優(yōu)點(diǎn)：①它能檢測(cè)任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品；②因?yàn)镋LSD的響應(yīng)與樣品的官能團(tuán)和光學(xué)特征無關(guān)，所以脂肪酸不需要衍生，這樣極大減少了樣品的前處理和消除了紫外末端區(qū)檢測(cè)的麻煩；③ELSD能適用于多溶劑梯度洗脫，基線平穩(wěn)，因而可提高分辨率和分析速度，測(cè)定游離脂肪酸和二甘油酯、三甘油酯；④靈敏度很高。第74頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）脂肪酸

常規(guī)HPLC方法用于非衍生脂肪酸的檢測(cè)從靈敏度和選擇性來說都是不可取的，因?yàn)槠浠衔锿ǔ２缓泻线m的發(fā)色團(tuán)，許多不同的衍生技術(shù)已被用來克服這些障礙，常用的衍生化方法有以下幾種。①苯甲酰甲基溴和苯甲酰甲基溴衍生化這類試劑對(duì)羧酸的衍生化反應(yīng)常在質(zhì)子惰性溶劑如苯、乙腈、丙酮中進(jìn)行。加入衍生化試劑之前先用氫氧化鉀或碳酸鉀或碳酸氫鉀中和酸。為了提高反應(yīng)的靈敏度和選擇性，常常需要加入冠醚和叔胺作為催化劑。第75頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月②3-羥甲基-吡啶衍生稱取適量樣品，加10倍樣的3-羥甲基-吡啶和4-二甲基氨基吡啶的二氯甲烷溶液，于室溫下反應(yīng)3h，加己烷-乙醚（1：1）溶液提取，用2mol/LHCl和水進(jìn)行液液分配，衍生物用C8柱分離，流動(dòng)相為乙腈-水（92：8），UV檢測(cè)或熒光檢測(cè)。③4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（BrMMC)衍生

BrMMC是最典型的香豆素類熒光衍生化試劑，它與羧酸的反應(yīng)在質(zhì)子惰性溶劑（如丙酮、乙腈等）中進(jìn)行，以無水碳酸鉀或冠醚為催化劑。由于試劑及其衍生物對(duì)光敏感，最好在暗處操作，BrMMC可用于測(cè)定脂肪酸、二元酸等。衍生物用C8或C18柱分離，甲醇或乙腈的水溶液作流動(dòng)相，熒光檢測(cè)。第76頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.5氨基酸氨基酸的分離和檢測(cè)手段，以往用化學(xué)分析法、層析法、比色法、氣相色譜法、氨基酸自動(dòng)分析儀。隨著高效液相色譜及填料的發(fā)展，HPLC在氨基酸檢測(cè)方面顯示了其特有的優(yōu)越性。但大多數(shù)氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特性，為提高分析檢測(cè)靈敏度和分離選擇特性，通常將氨基酸衍生，衍生方式有柱前衍生法與柱后衍生法。HPLC與各種衍生相結(jié)合的氨基酸分析技術(shù)，構(gòu)成了具有廣泛適用性的現(xiàn)代氨基酸分析技術(shù)。第77頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.5.1樣品處理測(cè)定蛋白質(zhì)中的總氨基酸，必須先把蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸?？刹捎盟崴?、堿水解和酶水解方法，其中以酸水解法應(yīng)用最廣泛。1）酸水解條件：常用硫酸或鹽酸進(jìn)行水解。一般用6mol/LHCl，4mol/LH2SO4煮沸回流24小時(shí)左右。優(yōu)點(diǎn)：可蒸發(fā)除去鹽酸，水解徹底，終產(chǎn)物為L(zhǎng)-α-氨基酸，產(chǎn)物單一，無消旋現(xiàn)象。缺點(diǎn)：色氨酸破壞，絲氨酸和蘇氨酸有一小部分被水解，同時(shí)天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來。第78頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月在蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)定中，水解過程的嚴(yán)格控制和條件選擇至關(guān)重要，否則將引起較大的實(shí)驗(yàn)誤差。水解時(shí)必須注意以下環(huán)節(jié)：①鹽酸的純度。在酸水解時(shí)，某些氨基酸，如酪氨酸，能與鹽酸中的氯等鹵素反應(yīng)生成鹵代物而影響測(cè)定結(jié)果。因此應(yīng)選擇優(yōu)級(jí)純鹽酸，并加以苯酚以抑制上述反應(yīng)。②氮?dú)獗Ｗo(hù)。在高溫水解時(shí)，空氣或試劑中的氧的存在會(huì)使氨基酸進(jìn)一步分解，影響水解回收率。③水解溫度和時(shí)間。常采用的酸水解條件是110℃，24h。若提高水解溫度，水解時(shí)間可縮短，但對(duì)個(gè)別氨基酸的水解回收率有較大影響。第79頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月2）堿水解條件：分析色氨酸可采用堿水解法。一般與5mol/LNaOH煮沸10-20小時(shí)。優(yōu)點(diǎn)：水解徹底，色氨酸不被破壞，水解液清亮。缺點(diǎn)：產(chǎn)生消旋產(chǎn)物，破壞的氨基酸多。第80頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月3）酶水解某些氨基酸對(duì)酸或堿不穩(wěn)定，在酸或堿水解時(shí)易被破壞，某些蛋白質(zhì)樣品在酸或堿水解不完全，影響某些氨基酸的回收率。對(duì)這些樣品可采用酶水解法。酶水解法可定量測(cè)定天東氨酸、谷氨酸和色氨酸。條件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常溫37～40℃，pH值5～8。優(yōu)點(diǎn)：氨基酸不被破壞，不發(fā)生消旋現(xiàn)象。缺點(diǎn)：水解不完全，中間產(chǎn)物多。第81頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月凈化食物中含有大量非氨基酸的其它成分如有機(jī)酸、脂肪、蛋白質(zhì)等，它們都會(huì)干擾氨基酸的色譜測(cè)定。因此在測(cè)定之前，需要脫蛋白及濃縮、凈化等樣品前處理。⑴脫蛋白質(zhì)沉淀法是脫除蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑主要為有機(jī)溶劑，如乙腈、甲醇、乙醇和丙酮等；有機(jī)酸和無機(jī)酸，如苦味酸、三氯乙酸、高氯酸等；鹽類，如碳酸銨、汞鹽、鎢酸鹽等。采用有機(jī)溶劑和酸處理的樣品最適合于HPLC分析。第82頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月⑵固相萃取法固相萃取法常用氧化鋁、活性碳、硅藻土、離子交換樹脂、C18固相萃取柱等，后者的選擇性和提取效率高，再現(xiàn)性好，使用方便，為優(yōu)先考慮選擇的固相萃取法。⑶超濾法超濾法是使用一種可使樣品按照分子量大小進(jìn)行篩分的過濾膜。大分子的組分被阻留，小分子的組分則通過膜。超濾法特別適合于氨基酸樣品前處理中除去蛋白質(zhì)和微量生物大分子，具有操作簡(jiǎn)便、回收率高的優(yōu)點(diǎn)。第83頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.5.2氣相色譜法由于氨基酸的高極性、低揮發(fā)性以及對(duì)熱不穩(wěn)定，因此氨基酸在GC分析之前需要衍生化。通常利用氨基酸的羧基和氨基與醇和酸酐作用，即酯化反應(yīng)和?；磻?yīng)，得到易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的衍生物，適合于GC分析。第84頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸的衍生過程有兩步反應(yīng)，首先在酸性、加熱條件下，氨基酸分子中的羧基與醇發(fā)生酯化反應(yīng)，然后氨基與酸酐發(fā)生酰化反應(yīng)，生成N(O,S)-酰氨基酸酯。

H3NCHCOOH+R’OHH3NCHCOOR’+H2OH3NCHCOOR’+(R’’CO)2OR’’CONHCHCOOR’+R’’COOH+H+RR++H+R+R第85頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月酯化反應(yīng)的醇一般是異丙醇、正丙醇、異丁醇或正丁醇，用鹽酸作為酸性催化劑，?；瘎┩ǔ槿宜狒?、五氟丙酸酐。氨基酸在衍生過程中應(yīng)注意三個(gè)方面：①由于酯類衍生物的易揮發(fā)性，在蒸發(fā)除去酰化試劑時(shí)會(huì)有損失，因此在衍生化前就要加內(nèi)標(biāo)；②氨基酸在高濃度的醇溶液中溶解度較差；③玻璃表面的硅羥基會(huì)加速N-酰基氨基酸酯衍生物的分解，因此反應(yīng)瓶表面需硅烷化處理。第86頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月氣相色譜法測(cè)定氨基酸通常采用火焰氫離子檢測(cè)器（FID）檢測(cè)，由于FID對(duì)碳?xì)浠衔镉休^高的響應(yīng)，食品中含有的其它有機(jī)酸會(huì)干擾氨基酸的測(cè)定，而需除去；其次實(shí)驗(yàn)用水引入不純含碳物也影響氨基酸的定量。第87頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.5.3液相色譜法柱后衍生法傳統(tǒng)的氨基酸分析技術(shù)用離子交換色譜分離氨基酸，柱后與茚三酮反應(yīng)。此法需要專門的氨基酸分析儀。用茚三酮為衍生化試劑常需要采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，對(duì)儀器要求較高。第88頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月柱前衍生法利用RP-HPLC。要求將氨基酸在柱前轉(zhuǎn)化為適合于反相色譜分離并能被靈敏檢測(cè)的衍生物。迄今已報(bào)道的柱前衍生試劑有很多，主要有鄰苯二甲醛（OPA)、丹酰氯（DNS-Cl）、磺酰氯二甲偶氮苯（DABS-Cl）和異硫氰酸苯酯（PITC）等。第89頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.5.4直接測(cè)定法大量氨基酸分析方法建立在柱前和柱后衍生化的氣相色譜和液相色譜之上。雖然這些方法比經(jīng)典的離子色譜方法快速且檢測(cè)限更低，但是這些方法耗時(shí)更長(zhǎng)。當(dāng)使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）檢測(cè)未衍生化氨基酸所需的樣品預(yù)處理最少，并且可靠和準(zhǔn)確。第90頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.6蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)的方法很多，一般是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化特性來進(jìn)行定量的方法，這些方法大致可分為兩類：一類是利用蛋白質(zhì)共性的方法，如凱氏法、雙縮脲法等；另一類是利用蛋白質(zhì)中含有特定氨基酸殘基的方法，如紫外吸收光譜法、色譜法、染色結(jié)合法等。第91頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月5.6.1蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（1）凱氏定氮法樣品中的蛋白質(zhì)與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，測(cè)出樣品轉(zhuǎn)化后的氮含量。第92頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）雙縮脲法在堿性條件下，銅離子和多肽（至少有兩個(gè)肽鍵）生成的復(fù)合物呈紫紅色，吸收波長(zhǎng)為540nm，比色所得的吸光度值和樣品中的蛋白質(zhì)含量成正比。這是一種快速蛋白檢測(cè)方法，但其靈敏度較低，比福林-酚法要低100倍。第93頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）福林-酚比色法蛋白質(zhì)與福林-酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。作用機(jī)理是蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性銅鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，同時(shí)也由于蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。呈色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)含量成正比，是檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法。第94頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）考馬斯亮藍(lán)染料比色法考馬斯亮藍(lán)G250是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色，在620nm處有最大吸收值，可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定?？焖伲m合大量樣品的測(cè)定。靈敏度與福林-酚法相似，但不受酚類、游離氨基酸和小分子肽的影響。第95頁，課件共105頁，創(chuàng)作于2023年2月（5）280nm紫外吸收法由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此具有吸收紫外光的性質(zhì)，在280nm處，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其濃度成正比，可作定量測(cè)定。（6）肽鍵紫外吸收法蛋白質(zhì)溶液在238nm下均有吸收，其吸收強(qiáng)弱與肽鍵的多少成正比。根據(jù)這一性質(zhì)，可測(cè)定樣品在238nm下的吸收值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照，求出蛋白質(zhì)