抗體醫(yī)學(xué)知識講座

抗體醫(yī)學(xué)知識講座抗體醫(yī)學(xué)知識講座第1頁

抗體是指能與對應(yīng)抗原特異性結(jié)合含有免疫功效球蛋白。

抗體產(chǎn)生：機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌球蛋白?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第2頁20世紀(jì)60年代發(fā)覺多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類似球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)概念，而抗體是生物學(xué)功效概念。抗體醫(yī)學(xué)知識講座第3頁

多克隆抗體：病原微生物含有各種抗原決定簇抗原物質(zhì)，所以這些抗體制劑也是各種抗體混合物，故稱多克隆抗體?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第4頁1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（monoclonalantibodyMcAb）。單克隆抗體含有高度特異性、均一性、起源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點，為抗體制備和應(yīng)用提供了全新伎倆，還促進(jìn)了基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第5頁

單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用與疾病診療和治療。單克隆抗體檢測與一些疾病相關(guān)抗原，輔助臨床診療。用放射性核素標(biāo)識單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，做免疫定位診療。抗體醫(yī)學(xué)知識講座第6頁

單克隆抗體用于臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體藥品對腫瘤進(jìn)行定向治療?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第7頁第二節(jié)單克隆抗體

單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與含有沒有限增殖能力骨髓瘤細(xì)胞相融合，經(jīng)過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第8頁抗體醫(yī)學(xué)知識講座第9頁抗體醫(yī)學(xué)知識講座第10頁

一、抗原與動物免疫制備特定抗原單克隆抗體，首先要制備用于免疫適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動物免疫。有抗原能夠用化學(xué)合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第11頁

為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，免疫動物和骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系動物進(jìn)行免疫。當(dāng)前常見骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，所以免疫動物也采取對應(yīng)品系?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第12頁

免疫方法采取體內(nèi)免疫法和體外免疫法。

體內(nèi)免疫法適合用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時應(yīng)用，普通用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細(xì)菌細(xì)胞抗原）免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔10個細(xì)胞進(jìn)行首次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。7抗體醫(yī)學(xué)知識講座第13頁可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行首次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。普通再采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細(xì)胞分裂?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第14頁

脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將

0.1～0.2ml抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。細(xì)胞抗原需105個，可溶性抗原需10μg。

抗體醫(yī)學(xué)知識講座第15頁

體外免疫法用于不能采取體內(nèi)免疫情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引發(fā)免疫抑制。優(yōu)點：需抗源量少，免疫期短，干擾原因少。抗體醫(yī)學(xué)知識講座第16頁

體外免疫法：用4～8周齡BALB/c

小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5～5μg/ml,在5%CO

37C下培養(yǎng)4～5天,再分離脾細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞融合。o2o抗體醫(yī)學(xué)知識講座第17頁二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合方法：脾細(xì)胞（1×10）骨髓瘤細(xì)胞（2×10）混合聚乙二醇誘導(dǎo)下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液遲緩稀釋。87抗體醫(yī)學(xué)知識講座第18頁

用于細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)含有融合率高，本身不分泌抗體，所產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力強(qiáng)，長久穩(wěn)定。

PEG相對分子量4000，濃度為50%

二甲基亞砜增加融合率。抗體醫(yī)學(xué)知識講座第19頁

細(xì)胞融合后可產(chǎn)生各種融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細(xì)胞。選擇性培養(yǎng):

培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。

A阻斷DNA合成?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第20頁抗體醫(yī)學(xué)知識講座第21頁

三、篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆常見檢測方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。克隆化是指單個細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖而取得細(xì)胞集團(tuán)整個培養(yǎng)過程?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第22頁ELISA用于破傷風(fēng)抗體篩選抗體醫(yī)學(xué)知識講座第23頁四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀判定雜交瘤細(xì)胞判定：染色體分析。它是判定客觀指標(biāo)，了解分泌抗體能力。單抗進(jìn)行Ig類和亞類判定：用羊或兔抗Ig不一樣類或亞類抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或ELISA判定。親和力、特異性、純度、分子量測定。抗體醫(yī)學(xué)知識講座第24頁五、單克隆抗體大量制備體外培養(yǎng)法可獲10μg/ml抗體體內(nèi)誘生法可獲5～20mg/ml抗體用BALB/c小鼠。降植烷接種雜交瘤細(xì)胞取腹水離心上清?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第25頁

六、單克隆抗體純化依單抗IgG類和亞類不一樣，選各種不一樣純化方法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體純化方法：1離心取上清，超濾，鹽析。2分離⑴凝膠過濾用于IgGIgM單抗純化。⑵陰離子交換層析IgG單抗純化。⑶親和層析IgG單抗純化?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第26頁第三節(jié)鼠源性單克隆抗體

改造

雜交瘤單抗為鼠源性，應(yīng)用人體產(chǎn)生人抗鼠抗體及毒副作用。對鼠源性單抗進(jìn)行基因加工和改造。目標(biāo)：降低免疫源性；降低相對分子量。人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第27頁抗體醫(yī)學(xué)知識講座第28頁Ig分子結(jié)構(gòu)抗體醫(yī)學(xué)知識講座第29頁Ig分子基因結(jié)構(gòu)抗體醫(yī)學(xué)知識講座第30頁一、人鼠嵌合抗體

抗原抗體結(jié)合功效—抗體可變區(qū)（V）同種性免疫源性—抗體穩(wěn)定區(qū)（C）在基因水平上將鼠源單抗H和L鏈可變區(qū)基因分離出來，分別與人IgH和L鏈穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表示完整人-鼠嵌合抗體?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第31頁二、改形抗體（CDR移植抗體）Ig分子中參加組成抗原結(jié)合部位區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個可變區(qū)。H和L鏈各有三個CDR，其它個別稱框架區(qū)。用鼠源單抗CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人Ig分子含有鼠源單抗抗原結(jié)合特異性。可消除免疫源性?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第32頁抗體醫(yī)學(xué)知識講座第33頁三、小分子抗體

基因工程小分子抗體僅表示鼠源單抗V區(qū)片段，相對分子量為原抗體1/80～1/3。即保留CDR區(qū)，而Ig分子中C區(qū)不表示。小分子抗體類型有：①Fab片段抗體②Fv抗體③單鏈抗體抗體醫(yī)學(xué)知識講座第34頁④單域抗體⑤最小識別單位單鏈抗體優(yōu)點：①可去除非特異性反應(yīng)競爭性表面蛋白，腫瘤顯象背景愈加清楚性。②易滲透腫瘤組織中增加藥品治療濃度。③免疫源性小，可消除人抗鼠排異反應(yīng)?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第35頁

單鏈抗體大多在大腸桿菌中表示，有三種形式：①直接在細(xì)胞質(zhì)中表示；②與其它菌體融合表示融合蛋白；③分泌表示含有功效單鏈抗體?？贵w醫(yī)學(xué)知識講座第36頁四、雙功效抗體雙功效抗體就是雙特征抗體。它是一個非天然性抗體。其結(jié)合抗原兩個臂含有不一樣特