青蒿素生物合成研究進(jìn)展

青蒿素生物合成研究進(jìn)展

癲癇是一種嚴(yán)重的流行疾病。據(jù)估計(jì)，每年至少有380萬人感染瘧疾，尤其是在發(fā)展中國家，每年有100萬人因患有瘧疾而死亡。青蒿素(artemisinin)由于其獨(dú)特的過氧橋結(jié)構(gòu),對抗氯喹瘧疾和腦型瘧疾療效顯著且具有速效和低毒的特點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織推薦青蒿素聯(lián)合療法(artemisinincombinationtherapy,ACT)作為治療瘧疾的首選方法。此外,現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物在殺滅寄生蟲、抗腫瘤及抵御艾滋病毒等方面具有很好的效果,這使得國際上對青蒿素的需求非常巨大。然而,青蒿素目前僅在青蒿(黃花蒿)ArtemisiaannuaL.中發(fā)現(xiàn),植物體內(nèi)青蒿素的量很低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%~1%),并不能滿足患者治療的需求。近年來,在諸如微生物改造發(fā)酵生產(chǎn)青蒿素前體、揭示青蒿素生物合成分子機(jī)制、青蒿轉(zhuǎn)基因、細(xì)胞培養(yǎng)合成青蒿素、探索青蒿素與外界環(huán)境關(guān)系、高產(chǎn)青蒿育種等方面取得大量科研成果。本文從目前了解的青蒿素生物合成途徑出發(fā),綜述了青蒿素生物合成途徑、合成部位、外源激素及誘導(dǎo)子對青蒿素生物合成的影響,以及在青蒿基因工程領(lǐng)域近期研究成果。1紫穗槐二烯或青蒿素的合成青蒿素為C15骨架的倍半萜類化合物,其生物合成途徑可分為3個(gè)階段(圖1):1)萜類化合物C5活性單位異戊烯焦磷酸(isopentenyldiphosphate,IPP)與其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate,DMAPP)經(jīng)過酶促反應(yīng)合成紫穗槐二烯(amorpha-4,11-diene,AD);2)AD到二氫青蒿酸(或青蒿酸);3)二氫青蒿酸(或青蒿酸)經(jīng)過不同的氧化反應(yīng)合成青蒿素。在整個(gè)青蒿素生物合成途徑研究中,有3個(gè)值得探討的問題:1)青蒿素C15骨架來源于植物經(jīng)典的甲羥戊酸途徑(mevanolatepathway,MVA)或是新近發(fā)現(xiàn)的MEP途徑(methylerythritolphosphatepathway),抑或兩者均有貢獻(xiàn);2)青蒿素的直接前體是青蒿酸還是二氫青蒿酸;3)二氫青蒿酸(青蒿酸)通過酶促反應(yīng)或自動轉(zhuǎn)化為青蒿素。1.1青蒿素的前體來源青蒿素屬于倍半萜類化合物,其碳骨架來源于共用前體法尼基焦磷酸(farnesyldiphophate,FPP),后者是在FPPS的作用下將IPP和DMAPP以2∶1的比例合成獲得。然而在高等植物中,合成C15活性單位的途徑有來源于定位于胞質(zhì)的MVA途徑和定位于質(zhì)體的MEP途徑。雖然在萜類化合物的合成過程中,上述兩條途徑存在“Closs-Talk”,然而目前證實(shí)在某些化合物合成過程中,這兩條途徑對活性單位的貢獻(xiàn)有主次之分,如蘿芙木中萜類吲哚生物堿異戊二烯基團(tuán)主要來源于MEP途徑。近年來對于青蒿素前體來源途徑的研究主要集中在:Weathers小組通過MVA途徑特異性阻斷劑洛伐他汀(Mevinolin)和MEP途徑阻斷劑磷胺霉素(Fosmidomycin)分別處理青蒿幼苗,均發(fā)現(xiàn)青蒿素的量較對照顯著降低,說明兩條途徑對青蒿素的合成均有重要影響;波蘭科學(xué)院Abdin小組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MVA途徑的關(guān)鍵酶HMGR活性與青蒿素的量密切相關(guān),阻斷MEP途徑青蒿素量僅降低14.2%,而阻斷MVA途徑,較對照青蒿素量降低了80.4%,提示MVA途徑是青蒿素生物合成中碳骨架的主要貢獻(xiàn)者;Schramek等用13CO2作為碳源飼喂青蒿植株,對青蒿素及其碳骨架前體進(jìn)行了深入研究,發(fā)現(xiàn)青蒿素骨架的主要前體為(E,E)-FPP,且MEP途徑提供1分子的IPP構(gòu)成FPP的核心骨架,MVA途徑提供另外的1分子IPP和1分子DMAPP,研究結(jié)果同時(shí)解釋了青蒿素合成場所腺毛體中不同細(xì)胞的具體功能。由此可見,MVA途徑和MEP途徑對青蒿素碳骨架的合成均提供了C15基本單元。1.2青蒿素的來源在早期的研究中,青蒿酸(artemisinicacid)一度被認(rèn)為是青蒿素生物合成的直接前體。Sangwan等通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與無細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用14C標(biāo)記的青蒿酸能夠轉(zhuǎn)化生成青蒿素B及青蒿素,提出青蒿酸可能是青蒿素生物合成的直接前體。然而,如今更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示二氫青蒿素是青蒿素生物合成的直接前體,青蒿酸也被部分學(xué)者認(rèn)為是青蒿素生物途徑中的“DeadEnd”代謝物。Kim等最早在青蒿瘤狀物中發(fā)現(xiàn)青蒿酸,但其不能轉(zhuǎn)化為二氫青蒿酸,且青蒿酸并不能生成青蒿素,推測青蒿素來源于二氫青蒿酸。Wallaart等發(fā)現(xiàn)青蒿素的量較高的植株中二氫青蒿酸量亦較高,而青蒿酸的量相對較低;經(jīng)過夜間霜凍脅迫,青蒿中的二氫青蒿素的量降低而青蒿素的量增高,推測植株通過二氫青蒿酸能夠與細(xì)胞中活性氧類物質(zhì)(reactiveoxygenspecies,ROS)反應(yīng)抵御脅迫,并生成青蒿素。分別用[15-13C2H3]-和[15-C2H3]-標(biāo)記的2種二氫青蒿酸飼喂青蒿根部,分析葉片代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)二氫青蒿酸是11,13-二氫-紫穗槐烷類(如青蒿素)和杜松烷類倍半萜的直接前體,而且其可以通過自發(fā)的化學(xué)反應(yīng)快速生成代謝產(chǎn)物。Bertea等通過分析青蒿葉片與腺毛體中一系列有關(guān)青蒿素合成的氧化還原酶,繪制出青蒿素合成途徑的第2階段,即紫穗槐二烯到二氫青蒿酸;利用同位素標(biāo)記的青蒿酸飼喂青蒿,發(fā)現(xiàn)青蒿素B是青蒿酸的主要代謝產(chǎn)物,而且青蒿酸不能轉(zhuǎn)化為二氫青蒿酸和青蒿素。因此,二氫青蒿素作為青蒿素生物合成直接前體的觀點(diǎn)已經(jīng)被廣為接受。由此可見,青蒿植株中二氫青蒿酸的合成是實(shí)現(xiàn)青蒿素積累的重要前提。1.3青蒿素的生成機(jī)制青蒿素合成的最后一個(gè)階段即青蒿素直接前體是否通過酶促反應(yīng)生產(chǎn)青蒿素的研究具有重要的科學(xué)意義與實(shí)用價(jià)值。由于青蒿素生物合成的最后一步即二氫青蒿酸合成青蒿素的反應(yīng)機(jī)制并不清晰,所以利用微生物工程僅能發(fā)酵生產(chǎn)青蒿素的前體二氫青蒿酸及青蒿酸。印度Narasu小組在以青蒿葉片為材料制備無細(xì)胞提取液,發(fā)現(xiàn)該提取液能夠?qū)⑶噍锼谺催化合成青蒿素,提示可能存在催化合成青蒿素的酶;隨后該小組在次年報(bào)道已純化并鑒定了上述蛋白質(zhì),該酶是由2個(gè)相對分子質(zhì)量分別為2.1×104和1.1×104的亞基組成的二聚體,全酶總相對分子質(zhì)量為6.6×104,以青蒿素B為底物的Km值為0.5mmol/L。這一結(jié)果首次為青蒿素最后一步是酶促反應(yīng)的推測提供了證據(jù),并為利用微生物工程生產(chǎn)青蒿素提供了依據(jù)。然而很遺憾的是直到現(xiàn)在依然未見該蛋白序列或?qū)?yīng)核苷酸序列的報(bào)道。目前更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)推測二氫青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素可能為非酶促反應(yīng)。Towler等發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜(DMSO)能夠有效刺激青蒿植株中青蒿素的積累,但沒有對其機(jī)制進(jìn)行闡述。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),DMSO提高青蒿素積累的機(jī)制并不是提高了關(guān)鍵基因(如ADS、CYP71AV1)的表達(dá),而DMSO誘導(dǎo)ROS的生成可能是提高青蒿素量的關(guān)鍵因素。此外,利用外源水楊酸(SA)噴灑青蒿葉片發(fā)現(xiàn)青蒿素量提高,其中原因之一為SA刺激植物體細(xì)胞產(chǎn)生ROS,后者促進(jìn)了二氫青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素。在早期的實(shí)驗(yàn)中,Wallaart等通過體外感光實(shí)驗(yàn),推測二氫青蒿酸可能起到清除ROS的作用,從而生成青蒿素。二氫青蒿酸自發(fā)氧化生成青蒿素的步驟已通過體外實(shí)驗(yàn)得到合理解釋。通過以上研究,二氫青蒿酸可能通過自發(fā)氧化的形式而非酶促反應(yīng)生成青蒿素的機(jī)制可以獲得前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持,而且二氫青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素的步驟可能依賴細(xì)胞內(nèi)ROS的爆發(fā)。2青蒿素生物合成下游基因的基因路徑腺狀分泌毛狀體(glandularsecretorytrichomes,GSTs)由植物表皮細(xì)胞發(fā)育形成,具有腺體狀的單(多)細(xì)胞結(jié)構(gòu),通常分布在植物的葉片、莖和花等器官,是許多次生代謝產(chǎn)物合成的場所。目前發(fā)現(xiàn)與青蒿素合成緊密相關(guān)的GSTs由10個(gè)細(xì)胞組成,包括2個(gè)基細(xì)胞、2個(gè)頸細(xì)胞、4個(gè)近頂細(xì)胞和2個(gè)頂細(xì)胞,青蒿素合成反應(yīng)發(fā)生在頂細(xì)胞中。然而在腺毛體細(xì)胞中,僅近頂細(xì)胞具有葉綠體;Schramek等推測這與青蒿素碳骨架合成相關(guān),即需要由定位于葉綠體的MEP途徑提供1分子的IPP為核心形成GPP,后者轉(zhuǎn)運(yùn)至頂細(xì)胞與胞質(zhì)中MVA途徑提供的IPP形成倍半萜的通用前體FPP。事實(shí)上,目前發(fā)現(xiàn)一大類與青蒿素骨架結(jié)構(gòu)相近的艾莫烷型(amorphanetype)化合物在GSTs中合成與儲存。早期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)青蒿素在植物體內(nèi)的積累具有組織特異性,在開花期的花序和葉中青蒿素的量最高。此外,研究結(jié)果也證實(shí)青蒿葉片和花序中GSTs的密度與青蒿素的積累具有密切關(guān)系。然而由于未能分離出GSTs,很難進(jìn)行GSTs特異表達(dá)的基因研究。目前可以通過激光顯微切割及壓力彈射技術(shù)(lasermicrodissection&pressurecatapulting,LMPC)從青蒿不同組織中分離獲得GSTs細(xì)胞用以基因特異性表達(dá)研究。Olsson等利用qPCR分析了青蒿素生物合成下游途徑關(guān)鍵酶基因紫穗槐二烯羥化酶(amorpha-4,11-dienesynthase,ADS)、細(xì)胞色素P450氧化酶(cytochromeP450monooxygenase,CYP71AV1)以及青蒿醛Δ11(13)還原酶(artemisinicaldehydeΔ11(13)reductase,DBR2)僅在腺毛體頂端細(xì)胞表達(dá),而MEP途徑關(guān)鍵酶基因5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(DXR)僅在近頂細(xì)胞中表達(dá)。將以上基因作為重要的靶點(diǎn)基因,通過基因工程改良青蒿,培育高產(chǎn)青蒿素轉(zhuǎn)基因新品種是目前的研究熱點(diǎn)之一,并且取得了良好的效果。3植物激素和誘導(dǎo)子對酪氨酸合成的影響3.1青蒿素合成相關(guān)基因表達(dá)變化利用外源赤霉素(GA3)處理青蒿發(fā)現(xiàn)可顯著增加青蒿素的量以及葉片生物量,在野生型及FPS超表達(dá)植株中,GA3均能上調(diào)青蒿素合成關(guān)鍵基因FPS、ADS及CYP71AV1的表達(dá);脫落酸(ABA,10μmol/L)處理青蒿后青蒿素平均量達(dá)到干質(zhì)量的1.84%,較對照提高了65%;基因表達(dá)分析顯示ABA誘導(dǎo)CYP71AV1等青蒿素合成相關(guān)基因表達(dá),而ADS表達(dá)未見顯著增加,推測ABA的生物合成途徑與青蒿素合成途徑存在“對話”;通過分析青蒿經(jīng)茉莉酸甲酯(MeJA)處理后的次生代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn),青蒿素、青蒿酸及二氫青蒿酸分別提高了49%、80%、28%;除此之外,甲基青蒿酸和鯊烯分別提高了50%和67%;青蒿懸浮細(xì)胞能在30min內(nèi)對外源MeJA產(chǎn)生響應(yīng),CYP71AV1基因表達(dá)上調(diào)且青蒿素量增加3倍;不同化學(xué)型的青蒿植株對MeJA的誘導(dǎo)存在不同的響應(yīng)方式,I型青蒿在MeJA的刺激下能夠促進(jìn)二氫青蒿酸和青蒿素的積累,而II型青蒿卻表現(xiàn)出青蒿酸和青蒿素量的降低;SA促進(jìn)青蒿素積累主要表現(xiàn)在2個(gè)方面:一是導(dǎo)致胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,催化二氫青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素;二是上調(diào)青蒿素合成途徑關(guān)鍵酶基因ADS的表達(dá)。3.2紫外線輻照對青蒿素合成的調(diào)控利用100mg/L殼聚糖處理青蒿葉片,能夠誘導(dǎo)ADS基因和DBR2基因表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)活性氧物質(zhì)H2O2及O2·有明顯增加,青蒿素及其前體二氫青蒿酸量較對照分別提高了53%和72%;將腦苷脂加入青蒿毛狀根培養(yǎng)體系中,青蒿素量達(dá)22.4mg/L,較對照提高了2.3倍;紫外線不僅能夠改變青蒿生長、生物量、色素量及胞內(nèi)氧化酶活性,而且能夠提高青蒿素和類黃酮的量。在青蒿花期采用UV-B和UV-C輻射處理后,青蒿素的量分別提高了10.5%和15.7%,且青蒿素合成相關(guān)基因HMGR、CPR及ADS表達(dá)量上調(diào)。雖然咪康唑能夠促進(jìn)青蒿懸浮細(xì)胞中CPR與DBR2基因表達(dá),而且使青蒿素的量較對照增加2.5倍,但是其對細(xì)胞的生長存在毒副作用;糖類物質(zhì)作為信號分子影響植物乙醛酸途徑和花青素合成途徑次生代謝產(chǎn)物的積累已有報(bào)道,葡萄糖與果糖的添加比例對青蒿素的合成起到重要作用,葡萄糖有利于青蒿素合成,而果糖具有抑制合成作用。Weather小組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在葡萄糖刺激下,6個(gè)涉及青蒿素合成的關(guān)鍵酶基因如HMGR、DXS、DXR、FPS、ADS和CYP71AV1轉(zhuǎn)錄水平顯示不同程度上調(diào),該研究從分子水平揭示了葡萄糖對青蒿素積累的重要影響。4青艾酒酶的研究4.1青蒿fps基因檢測青蒿素代謝工程是植物基因工程研究領(lǐng)域熱點(diǎn)之一,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)超表達(dá)青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因或抑制支路重要基因表達(dá)已有諸多報(bào)道。在青蒿中超表達(dá)IPI基因發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素、葉綠素及青蒿素的量有不同程度的提高,其中青蒿素的量較對照提高30%~70%。將青蒿FPS基因超表達(dá)后,轉(zhuǎn)基因植株中青蒿素量最高可達(dá)0.9%,較對照提高了34.4%。構(gòu)建來源于長春花的HMGR基因及青蒿的ADS基因植物高效表達(dá)載體,獲得的雙基因轉(zhuǎn)基因株系中青蒿素的量最高達(dá)1.73mg/g,較對照有大幅度提高。景福遠(yuǎn)等超表達(dá)腺毛體特異表達(dá)的細(xì)胞色素P450蛋白CYP71AV1及其伴體蛋白CPR基因,轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的量約為對照組2.4倍。4.2青蒿素生物合成途徑的基因表達(dá)在青蒿轉(zhuǎn)基因研究中,已有利用代謝工程中的通過反義RNA技術(shù)或RNAi技術(shù),降低特定代謝途徑上重要基因的表達(dá),減少非目的產(chǎn)物的生成,從而促進(jìn)代謝流朝向目標(biāo)產(chǎn)物積累。FPP是植物體內(nèi)合成倍半萜及三萜的前體,在不同