體外經(jīng)細胞因子擴增并回輸前后惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞的變化

體外經(jīng)細胞因子擴增并回輸前后惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞的變化

自然損傷細胞（nk）是存在于人體的免疫細胞。在過去，由于技術原因，nk細胞的外部擴張很難達到臨床治療的數(shù)量。擴散混合淋巴結(jié)的nk樣本（表面標記為cd16）20%的細胞只有10%20%。筆者采用改良的培養(yǎng)技術,一次擴增可以達30~50億個混合淋巴細胞,主要含有CD4+、[作者簡介焦順昌,男,1984年第一軍醫(yī)大學畢業(yè),協(xié)和醫(yī)科大學1995級博士。電話:(010)66939761;E-mail:jiaosc@CD8+、CD16+、CD56+等細胞,其中帶有NK樣細胞標志的CD16+/CD56+細胞占20%~70%,可滿足臨床治療的需要。但回輸人體后對機體免疫功能有何影響?本研究試圖回答這一問題。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例選擇及術后輔助治療情況2007年3月-2008年6月于我院診治的惡性實體瘤患者,選取資料完整的共22例。其中非小細胞肺癌8例、大腸癌3例、胰腺癌5例、余為卵巢癌、胃癌、肝癌、惡性黑色素瘤等;術后輔助治療后8例,晚期患者14例。男17例,女5例;平均年齡為54.14±12.96歲(31~77歲)。1.2輸注后細胞毒性檢測1.2.1淋巴細胞體外擴增培養(yǎng)患者簽署知情同意書后,采抗凝血約40mL,在GMP層流實驗室進行擴增培養(yǎng),見張國慶等采用方法。1.2.2回輸方法培養(yǎng)好的混合淋巴細胞經(jīng)質(zhì)量控制合格后混懸于100mL生理鹽水中,用帶有濾膜的輸液器緩慢靜滴約1h,回輸前可肌注苯海拉明20~40mg?；剌斍昂蠹盎剌斶^程仔細監(jiān)測生命體征及毒副反應。每次回輸前抽靜脈血做外周血淋巴細胞亞群檢測。1.2.3淋巴細胞表型檢測外周血淋巴細胞及體外擴增后淋巴細胞應用流式細胞術測定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56-、CD3-CD16+CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56-、CD3+CD16+CD56+細胞在淋巴細胞中所占百分比的情況。1.2.4統(tǒng)計學方法使用SPSS10.0軟件進行分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示(xˉ±s)表示。2結(jié)果2.1細胞培養(yǎng)成熟時所得淋巴細胞的計數(shù)及增殖個數(shù)外周血淋巴細胞擴增培養(yǎng)平均時間為13.46±1.20d;細胞培養(yǎng)成熟時所得淋巴細胞數(shù)為(2.99±0.65)×109,擴增倍數(shù)為488.06±191.25;苔盼蘭染色檢測細胞存活率為97.71%±1.07%。2.2返回后的副反應分析22例患者經(jīng)細胞回輸治療后生命體征及血常規(guī)、肝功能、腎功能等檢查結(jié)果均無明顯改變;回輸后未出現(xiàn)不良反應。2.3表1顯示了前后淋巴結(jié)的形態(tài)變化2.4表2顯示了再利用率前后的出血前后阿什貝林亞組的形態(tài)變化2.5個體是否個體的配比選擇5例多次回輸?shù)幕颊?觀察多次回輸后,不同次數(shù)回輸后2周外周血CD16+/CD56+細胞的百分比。圖1可以看出,不同個體間差距較大,不好比較;但針對每一個體觀察,回輸后外周血CD16+/CD56+細胞比例升高,而多次回輸并未呈持續(xù)上升趨勢,只是一直保持在較高狀態(tài)。其他亞群比例并無變化。3cd18+/cd56+細胞回輸?shù)陌踩苑治鋈绫?所示,外周血淋巴細胞在體外經(jīng)細胞因子刺激并擴增后CD16+/CD56+(%)細胞比例顯著升高,每次回輸?shù)募毎蠧D16+/CD56+細胞占45.6%±18.8%?；剌敿毎隗w內(nèi)的壽命目前不詳,但回輸2周后外周血中仍可檢測到CD16+/CD56+細胞顯著升高達26.4%±13.9%(表2),提示回輸?shù)募毎?周后仍有部分存活。以CD16+/CD56+細胞為主的NKTm細胞受MHC約束力較弱,對腫瘤細胞殺傷具一定廣譜性,故回輸后體內(nèi)CD16+/CD56+細胞的增加有助增強機體抗腫瘤能力,有助打破腫瘤免疫耐受狀態(tài)。一次回輸,2周后仍可看到外周血中CD16+/CD56+細胞比例顯著增高,提示NKTm細胞回輸具有較高的效率,可有效提高機體抗腫瘤免疫功能。各項臨床指標的觀察顯示,NKTm細胞回輸是安全的,未見不良反應。表1顯示,在1次回輸后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞比例無顯著變化,CD16+/CD56+細胞的增多亦未引起不良反應,表明NKTm細胞治療在增強機體抗腫瘤免疫、克服腫瘤免疫耐受的同時,并未打破機體免疫平衡狀態(tài),不會引起免疫失衡所致的疾病,即使多次連續(xù)回輸,CD16+/CD56+細胞一直維持較高水平但未持續(xù)上升,其他各亞群比例基本未變。該結(jié)果提示NKTm細胞連續(xù)多次回輸是安全的。本研究顯示NKTm細胞回輸可以顯著提高機體抗腫瘤細胞免疫功能,多次連續(xù)回輸可以使這一功能保持在一個較高水平,有助于對體內(nèi)腫瘤細胞的持續(xù)殺傷,且具有良好的安全性。存在問題:盡管初步研究顯示出NKTm細胞回輸具有一定抗腫瘤臨床療效,但嚴格設計的隨機對照臨床研究仍十分必要;完成這樣的臨床研