石蠟包埋技術(shù)

石蠟包埋技術(shù)組織石蠟包埋和切片技術(shù)包埋劑embeddingagent在制作切片或超薄切片時，由于組織是柔軟的，或局部的軟硬不均，這樣制作厚薄均勻的切片是困難的。所以有必要用一定物質(zhì)浸透組織內(nèi)部，整個組織一樣硬化，以利于切成薄片，這種物質(zhì)叫做包埋劑。一股用光學(xué)顯微鏡觀察的切片，用石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等作包埋劑；電子顯微鏡則用環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯樹脂、異丁烯樹脂及水溶性樹脂。石蠟制片法是將材料經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟后包埋在石蠟里面進行切片的方法。此法適用范圍，制片手段完備，能將材料切成極薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成連續(xù)的片子，這是其它制片法難以達到的，因此在光學(xué)顯微鏡的制片技術(shù)上它是最常用的一種方法。除了一些經(jīng)不住石蠟切片法中所應(yīng)用的各種藥劑處理的材料不能應(yīng)用石蠟切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作時間較長，操作過程復(fù)雜以及材料易發(fā)硬或發(fā)脆等缺點。該法多采用旋轉(zhuǎn)式切片機進行切片。石蠟制片操作程序如下：（一）材料的采集與分割采集材料應(yīng)根據(jù)制片的目的和要求而定，材料要有代表性，無病蟲害或其它損傷，如要觀察病理解剖，則要取病斑、病癥部位。采下的材料應(yīng)立即放在標本箱或濕布包起來帶回實驗室進行分割固定（如有條件也可在試驗地采集后進行分割固定）。為使固定液能迅速的滲透材料，材料要進3行分割。分割時動作要迅速，以防材料萎蔫。分割塊的大小，宜小不宜大，一般不超過1cm，分割后立即殺死固定。（二）殺死與固定利用藥劑迅速把細胞殺死，以保持材料本來的狀態(tài)和結(jié)構(gòu)。常用的固定有F.A.A固定液、卡諾固定液等。將固定液放在具塞小瓶中，投入材料，蓋好瓶蓋。用F.A.A固定液固定，時間至少24小時。F.A.A固定液既是良好的固定劑，也是保存劑，因此材料可長期保存在固定液中備用?？ㄖZ固定液穿透力強，固定較小材料一般1~6小時即可，最多不超過24小時。因卡諾固定液不能做保存劑，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每級約20min.，然后保存在70%的酒精中備用。（三）脫水脫水的目的是除去組織中的水分，便于透明、浸蠟、包埋等步驟的進行，因為這些程序中所用的藥品都不能與水混合，所以必須脫水。常用的脫水劑為酒精。脫水過程應(yīng)緩慢進行，不能操之過急或時間過長，以免組織變硬變脆或發(fā)生收縮現(xiàn)象。脫水采用等級脫水（系列脫水），即從較低70%?80%?95%（此時可加少許番濃度酒精開始，逐漸替換到高濃度酒精。一般為：50%?紅，使組織著色便于包埋時定位）？無水酒精（兩次），每級停留時間2~4小時或更長（無水酒精中時間宜短）。用95%酒精配制各濃度酒精的方法:設(shè)原有酒精濃度為A，所需配制酒精濃度為B，則取Bml原有酒精，加上A-Bml蒸餾水，即可獲得Aml的B%的究竟。例如:95%酒精配成70%的酒精，則取70ml的95%酒精，加上25ml蒸餾水，則配成了95ml的70%的酒精。（四）透明透明的目的是將脫水劑從材料中除去，使材料透明，增記折光系數(shù)；同時便于下步的浸蠟和包埋等程序（因為究竟不能溶解石蠟）。透明劑是一種既能與脫水劑混合，又能與包埋劑混合的藥劑。常用的透明劑為二甲苯和氯仿，適用原則也是逐級進行，可減少材料收縮。一般步驟是：2/3純酒精+1/3二甲苯？1/2純酒精+1/2二甲苯？1/3純酒精+2/3二甲苯?二甲苯（兩次），每級停留時間0.5?2小時或更長些。二甲苯穿透能力強，但又宜使材料收縮變脆，使用時不能在其中停留時間過長。若材料放入二甲苯中時有白色混濁現(xiàn)象發(fā)生，說明材料脫水不徹底，應(yīng)把材料退回至純酒精中再行脫水。（五） 浸蠟浸蠟的目的是逐漸除去透明劑，并為包埋劑所代替。常用的包埋劑是石蠟。浸蠟過程是使石蠟慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟漸漸深入到材料的細胞中去，最后使透明劑完全被石蠟取代，以便切片。一般所用的石蠟分軟蠟（熔點40?以下）和硬蠟（熔點40?以上）。浸蠟過程一般是從低溫到高溫、從低熔點到高熔點逐漸進行，這一過程不能操之過急，否則浸蠟不徹底影響切片。此外，軟材料可用熔點較低石蠟，較硬的材料可用熔點較高的石蠟;冬季可用熔點較低的石蠟，夏季可用熔點較高的石蠟。石蠟必須純凈，不含雜質(zhì)。整個浸蠟過程需在恒溫箱內(nèi)進行（按需要調(diào)整溫度）。材料最后一次二甲苯透明后即可浸蠟，浸蠟過程中逐漸使二甲苯揮發(fā)，并不斷加入純石蠟，直至石蠟飽和為止。浸蠟時間大約廣2天。（六） 包埋（埋蠟、沉床）材料浸蠟后再換兩次已熔融的純蠟，然后將材料和石蠟一起倒入提前疊好的包埋紙盒中，用加熱的鑷子迅速將材料按一定的間隔和所需的切面擺放整齊，同時用加熱的鑷子趕走材料周圍的氣泡，待紙盒表面的石蠟?zāi)毯髮⒓埡衅椒湃肜渌?，使石蠟迅速凝固。最后從紙盒中取出蠟塊，以便保存。注意將樣品編號封于蠟塊上，以免樣品混淆。（七） 修塊將已包埋好的蠟塊切成小塊，每一小塊包含一塊材料。然后按照所需的切面，用單面刀片將小蠟塊切成梯形，并可粗視到材料切面。然后用燒紅的蠟鏟把蠟塊底部牢固的粘接在載蠟器上。（八）切片用切片機（如旋轉(zhuǎn)切片機）將蠟塊切成連續(xù)的蠟帶。切片時先把切片刀夾在刀架上，再把載蠟器夾在固定裝置上（注意安裝切刀的角度，刀口運行方向與材料切面平行），然后調(diào)整好所需厚度，一般可在7~14微米，視材料和所需觀察對象而定，一般葉片、芽可厚些，胚囊和花粉?？杀⌒D(zhuǎn)動切片機切片。（九）粘片切下來的切片經(jīng)過鏡檢（根據(jù)情況也可不檢），將符合要求的切片粘在潔凈的載玻片上。粘片時先在載玻片上滴上一小滴粘片劑（可用蛋青和甘油各50ml，加1g水楊酸混合而成），加幾滴蒸餾水，然后用鑷子小心把切片放在水上，在35-40?下，用撥針將切片伸直、展平，傾斜載片，使水流去并烘干。（十）脫蠟、染色、脫水透明和封片粘片后要經(jīng)過脫蠟、染色、再次脫水透明，然后封片永久保存。下面以植物生物學(xué)中觀察組織結(jié)構(gòu)最常用的番紅-固綠染色法說明脫蠟、染色、脫水透明和封片的過程：二甲苯？二甲苯（每次均10~15min.）?1/3純酒精+2/3二甲苯（1~2min.）?1/2純酒精+1/2二甲苯（1?2min.）?2/3純酒精+1/3二甲苯（1?2min.）?純酒精兩次（每次廣2min.）?95%、85%、70%、50%梯度酒精復(fù)水（每級廣2min.或更長）？用1%番紅配50%酒精染色1小時?50%、70%、85%、95%梯度酒精脫水（每級廣2min.或更長）？用0.1%固綠配95%酒精復(fù)染2~5秒?95%酒精脫水1~2分鐘?純酒精兩次（每次1~2min.）?2/3純酒精+1/3二甲苯透明（1~2min.）?1/2純酒精+1/2二甲苯透明（1?2min.）?1/3純酒精+2/3二甲苯透明（1?2min.）?二甲苯？二甲苯（每次均10~15min.）?加拿大樹膠封片?貼標簽鏡檢及保存。組織石蠟包埋和切片技術(shù)1、 切取組織，浸泡在4,用pH7.4BS配成的甲醛固定劑中，室溫24小時。附：4,甲醛固定劑（5ml）:4.5ml1XPBS（pH7.4）+0.5ml甲醛2、 倒掉甲醛固定劑，加pH7.4BS，每隔8小時更換一次，4?保存，換液共3天。3、打開烘箱，調(diào)溫至62?，融石蠟。4、酒精梯度脫水（30,、50,、70,、80,、90,、95%、100,X2），隔30分鐘更換一次。5、50,酒精，50,二甲苯30分鐘（過渡步驟）。6、 100，二甲苯，時刻觀察組織塊至透明。7、 放入烘箱中已經(jīng)預(yù)融的50,石蠟，50,二甲苯中，30分鐘。8、 100,石蠟兩遍，每次2小時。（若石蠟浸潤不夠，仍有二甲苯，則包埋后的石蠟塊較脆，易分層、斷裂。）冰箱或水中冷凝，9、100,石蠟紙盒內(nèi)凝固（先用蠟打底，再放入組織塊，澆上蠟包埋，放入4?標明組織塊放入方向），4?存放備用。10、 修塊。11、 融化石蠟?zāi)ㄓ趬K底，貼在木塊上，壓實。12、 切片（5,10^m），將切片平展于平板上，光面朝上。13、 將光面朝下，