大豆根際促生氫氧化細(xì)菌的分離與篩選

大豆根際促生氫氧化細(xì)菌的分離與篩選

董忠民等人提出，經(jīng)過(guò)多年的研究，提出了一種不含氫酶（hup）的根腫瘤釋放理論，以促進(jìn)根間氫氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步促進(jìn)植物生長(zhǎng)。促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR)對(duì)農(nóng)作物的增產(chǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值,已日益引起人們的重視。由于氫氧化細(xì)菌的獨(dú)特特征,土壤氫氧化細(xì)菌的分離極其困難,并且氫氧化細(xì)菌作為PGPR的相關(guān)研究報(bào)道較少。許多PGPR刺激植物生長(zhǎng)取決于ACC脫氨酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylatedeaminase,1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶)的活性,植物中ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid,1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸)是乙烯合成的前體物質(zhì),ACC水平的降低導(dǎo)致了植物中乙烯含量的減少,從而促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)從大豆根際土壤中分離氫氧化細(xì)菌,從分離菌株中篩選出具有促生能力的菌株并對(duì)其進(jìn)行了ACC降解分析,獲得了具有ACC脫氨酶的氫氧化細(xì)菌,為進(jìn)一步開(kāi)展氫氧化細(xì)菌促進(jìn)作物生長(zhǎng)的研究提供一定參考。1材料和方法1.1nano32.0g,kh2po-4.3.3菌株來(lái)源:陜西關(guān)中地區(qū)HUP-大豆根際土壤。供試作物為小麥。礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基(MSA):NaNO32.0g,K2HPO41.2g,MgSO40.5g,KCl0.5g,KH2PO40.14g,Fe2(SO4)3·H2O0.01g,酵母膏0.02g,瓊脂15g,水1L;pH7.2。主要藥品ACC從Sigma公司購(gòu)得。1.2混合氣體h持續(xù)通H2混合氣體和通空氣裝置如圖1所示?？烧{(diào)節(jié)氣流的壓縮空氣通入到2個(gè)裝有300mL磷酸溶液(100mmol·L-1)的1L密閉錐形瓶中。其中1個(gè)錐形瓶的磷酸溶液中放入2個(gè)碳棒作為惰性電極,通過(guò)控制直流電的電流量來(lái)調(diào)節(jié)陰極H2的產(chǎn)生量,形成混合氣體(H2+空氣)。將混合氣體通入裝有60mL混合土樣的玻璃管后從V2排出,V1用來(lái)調(diào)節(jié)V2氣流量的大小。另1個(gè)錐形瓶沒(méi)有電極,不能電解水產(chǎn)生H2,將該錐形瓶的氣體(不含H2)通入裝有60mL混合土樣的玻璃管后從V4排出,V3用來(lái)調(diào)節(jié)V4氣流量的大小。通過(guò)一個(gè)自制的H2檢測(cè)裝置來(lái)檢測(cè)氣流量。1.3hup-大豆根際土壤的生物處理cdh、o2、co采用氣體循環(huán)培養(yǎng)體系(持續(xù)通氫氣裝置),通過(guò)電解水的方式產(chǎn)生H2,與通入的空氣混合,形成流速為280mL·min-1,含H2量為4.16×10-5~1.25×10-4mol·L-1的混合氣體。對(duì)采集的HUP-大豆根際土壤通入4.16×10-5mol·L-1H2混合氣體富集培養(yǎng)1個(gè)月。采用礦質(zhì)鹽固體培養(yǎng)基,在適當(dāng)?shù)腍2、O2和CO2下以H2作為唯一能源,CO2作為主要碳源分離富集培養(yǎng)土壤中的氫氧化細(xì)菌。對(duì)分離出的細(xì)菌菌株進(jìn)行耗氫能力測(cè)定和自養(yǎng)生長(zhǎng)能力測(cè)定。1.4小麥種子的處理將選定的20株氫氧化細(xì)菌接種于加入可溶性淀粉的MSA液體培養(yǎng)基中,37℃搖床,轉(zhuǎn)速120r·min-1培養(yǎng)28h。室溫下將小麥種子在蒸餾水中浸泡7~10h,待小麥種子萌芽,挑取無(wú)蟲(chóng)害完整的萌芽小麥種子,放入到平皿中,每平皿10粒,倒入菌懸液10mL,每處理5次重復(fù)。加入大腸桿菌菌懸液的小麥平板和不加任何菌懸液的小麥平板均作為對(duì)照。放入恒溫光照培養(yǎng)箱中,于26℃培養(yǎng)3~5d,觀察平板小麥根生長(zhǎng)情況。1.5亞硝酶對(duì)氫氧化細(xì)菌的檢測(cè)1.5.1acc的制備將MSA培養(yǎng)基作了簡(jiǎn)單的改變,液體MSA培養(yǎng)基中加入了可溶性淀粉作為碳源。50mL錐形瓶中加入9mL液體MSA培養(yǎng)基,滅菌。稱(chēng)取20mgACC藥品,溶解在20mL蒸餾水中,配成1mg·mL-1的ACC溶液,用滅過(guò)菌的微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾ACC溶液,制成無(wú)菌ACC溶液。取1mL無(wú)菌ACC溶液加入到上述滅菌的液體MSA培養(yǎng)基錐形瓶中,使瓶中的ACC溶液濃度為0.1mg·mL-1。1.5.2菌株的制備取一環(huán)氫氧化細(xì)菌斜面菌苔,接種到ACC培養(yǎng)基中。同時(shí)接種氫氧化細(xì)菌到無(wú)ACC溶液的液體MSA培養(yǎng)基中作為對(duì)照組。以無(wú)菌ACC液體培養(yǎng)基和無(wú)菌不含ACC的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。將錐形瓶放入搖床,轉(zhuǎn)速120r·min-1,于37℃搖瓶培養(yǎng)48h。1.5.3正丁醇乙酸水顯色劑取搖床培養(yǎng)48h的菌懸液作硅膠板薄層層析。展層劑為正丁醇∶乙酸∶水(V/V/V)=75∶15∶10,硅膠板為支持物,推展時(shí)間2h,顯色劑為0.5%的茚三酮溶液,120℃烘烤2min顯色。1.6處理數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1初始?xì)錆舛葘?duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響從MSA平板上共分離到40株單菌落,接斜面通混合氣體培養(yǎng)長(zhǎng)出菌苔后,用氣相色譜檢測(cè)40株菌株在密閉條件下3d(72h)的吸氫值,即H2濃度減少量,以此判斷菌株是否具有氧化氫能力及其大小。吸氫值(mol·L-1)=密閉試管中初始H2濃度(mol·L-1)-培養(yǎng)3d后密閉試管中剩余H2濃度(mol·L-1)。從表1可以看出,有22株菌株的吸氫值大于1.25×10-4mol·L-1,占測(cè)定菌株總數(shù)的55%;A04和A19的吸氫值大于1.66×10-4mol·L-1,有較大的耗氫能力,即吸氫值的大小反映了細(xì)菌對(duì)氫氣的消耗能力大小。在通H2的MSA培養(yǎng)基上,2~4周內(nèi)有20株菌株先后長(zhǎng)出明顯的菌落,在不通H2的MSA培養(yǎng)基上,4周內(nèi)均無(wú)明顯菌落生長(zhǎng)。表明這20株細(xì)菌均能利用H2為能源,以CO2為主要碳源進(jìn)行無(wú)機(jī)化能自養(yǎng)生長(zhǎng)?？梢猿醪脚袛噙@20株菌株均為氫氧化細(xì)菌。2.2小麥根長(zhǎng)對(duì)小麥的促生效果將分離到的20株氫氧化細(xì)菌菌株通過(guò)小麥促生試驗(yàn)檢測(cè),篩選到11株具有顯著促生作用的細(xì)菌菌株。從表2可以看出,用菌株A03、A06、A10、A11、A14、A20、A21、A26、A31、A35、A39處理的小麥根長(zhǎng)都顯著優(yōu)于對(duì)照和大腸桿菌,增長(zhǎng)幅度為111%~397%,其中菌株A06、A11對(duì)小麥的促生效果最好,和對(duì)照比較根相對(duì)生長(zhǎng)361%和397.6%。用菌株A04、A09等菌株處理的小麥根長(zhǎng)都優(yōu)于對(duì)照,增長(zhǎng)幅度范圍在102%~111%,但是差異不顯著。用菌株A05、A18、A19、A23、A24、A27、A40處理的小麥根長(zhǎng)略低于對(duì)照。2.3acc氨基酸發(fā)酵對(duì)有顯著促進(jìn)小麥生根作用的A03、A06、A10、A11、A14、A20、A21、A26、A31、A35、A39等11株菌株進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,僅有菌株A06的菌懸液培養(yǎng)48h后,沒(méi)有檢測(cè)到ACC這種非蛋白氨基酸的存在,而其它菌株的菌懸液的ACC顯色反應(yīng)表明,培養(yǎng)前與培養(yǎng)48h后的顏色沒(méi)有太大變化。結(jié)果說(shuō)明只有菌株A06擁有ACC脫氨酶,能夠利用ACC這種非蛋白氨基酸為氮源;其它菌株不具有利用ACC的能力。圖2為菌株A06、A11、A21、A35的層析結(jié)果。3促進(jìn)作物生長(zhǎng)的活性成分本研究通過(guò)檢測(cè)菌株氧化氫能力和化能自養(yǎng)生長(zhǎng)能力,從通氫氣富集土壤中篩選了20株氫氧化細(xì)菌。小麥促生結(jié)果表明,有11株細(xì)菌能夠顯著促進(jìn)小麥根生長(zhǎng),增長(zhǎng)幅度為111%~397%,但篩選的大豆根際氫氧化細(xì)菌能否在自然土壤中發(fā)揮其促生效果,需要進(jìn)一步的深入研究。ACC是乙烯合成的關(guān)鍵中間前體,從種子或根部滲出大量的ACC將會(huì)被細(xì)菌利用,被ACC脫氨酶粘著到氨和α-酮基丁酸鹽上。在植物中ACC是乙烯合成的前體物質(zhì),ACC水平的降低導(dǎo)致了植物中乙烯含量的減少,從而促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)(圖3)。11株具有促生能力的氫氧化細(xì)菌中僅有菌株A06具有ACC脫氨酶,其它菌株具有促生能力的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。利用薄層層析快速檢測(cè)具有ACC脫氨酶活性的氫氧化細(xì)菌,是基于ACC作為一種非蛋白氨基酸,能夠在ACC脫氨酶的作用下水解為氨和α-丁酮酸。茚三酮能夠與氨基酸發(fā)生顯色反應(yīng),與α-丁酮酸無(wú)顯色反應(yīng)的原理。實(shí)驗(yàn)證明薄層層析檢測(cè)方法可靠實(shí)用、簡(jiǎn)單易行,為氫氧化細(xì)菌促生機(jī)制的研究提供了切實(shí)有效的研究途徑。豆科根際土壤的氫氧化細(xì)菌作為一個(gè)特殊的種群,其作為PGPR促進(jìn)作物生長(zhǎng)的研究才剛剛起步,很多試驗(yàn)結(jié)果表明,作為PGPR促進(jìn)作物生長(zhǎng)的