基因操作原理與方法

基因工程原理與方法

艾賓浩斯遺忘曲線選用一些根本沒有意義的，也就是那些不能拼出單詞來的眾多字母的組合，比如asww，cfhhj，ijikmb，rfyjbc等。經(jīng)過對自己的測試，得到了一些數(shù)據(jù)。

基因工程(Geneengineering)是指在體外按既定的目的和方案，將某一目的基因片段，與載體DNA連接，構(gòu)成DNA重組體，并將其導(dǎo)入到受體細(xì)胞中。重組體隨細(xì)胞的繁殖而擴(kuò)增，或同時進(jìn)行目的基因的表達(dá)，產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)或使受體細(xì)胞表現(xiàn)出新的的遺傳性狀?；蚬こ逃址Q遺傳工程(Geneticengineering)，重組DNA(RecombinantDNA)技術(shù)，DNA克隆(DNAcloning)或分子克隆(Molecularcloning)技術(shù)。問題：不同來源、不同物種之間的基因之所以能重組，并按預(yù)計表現(xiàn)出一定的性狀，其原因是什么？First,restrictionendonucleasescleaveDNAatspecificsequencestogenerateasetofsmallerfragments.Second,theDNAfragmenttobeclonedcanbeisolatedandjoinedtoasuitablecloningvectorusingDNAligasetosealtheDNAmolecules

together.

動物模型DNACloning:TheBasics

Toclonemeanstomakeidenticalcopies;itisatermthatwasoncerestrictedtotheprocedureofisolatingonecellfromalargerpopulationofcells,thenallowingittoreproduceitselftogeneratemanyidenticalcells.Insuchaway,sufficientquantitiesofasinglecelltypeweremadeavailableforstudy.Byanalogy,DNAcloninginvolvesseparatingaspecificgeneorsegmentofDNAfromitslargerchromosomeandattachingittoasmallmoleculeofcarrierDNA,thenreplicatingthismodifiedDNAthousandsorevenmillionsoftimes.TheresultisaselectiveamplificationofthatparticulargeneorDNAsegment.基因操作基礎(chǔ)知識與常用技術(shù)一、宿主與質(zhì)粒二、基因工程載體三、質(zhì)粒的提取四、核酸瓊脂糖凝膠電泳五、基因工程中常用的工具酶六、目的基因的獲得（基因組與RNA的提?。┢?、DNA的酶切、回收、連接及重組基因的轉(zhuǎn)化七、基因克隆策略八、重組DNA的鑒定九、DNA序列測定十、重組蛋白的表達(dá)大腸桿菌宿主菌

目前所有的基因克隆大腸桿菌宿主菌均是K12的衍生菌。常用的有DH5α、HB101、JM109、JM105、TG1、XL1-blue、C600、BL21(DE3)等。

一、基因質(zhì)粒載體基因工程載體有質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒以及病毒載體。其中質(zhì)粒載體是DNA最基本的運載工具，也是最早建立起來的基因載體系統(tǒng)，而其它工程載體的構(gòu)建及應(yīng)用均離不開質(zhì)粒載體。質(zhì)粒是細(xì)胞染色體外能獨立復(fù)制的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小從1kb到200kb不等，廣泛存在于多種細(xì)菌中，少數(shù)藍(lán)藻、真菌和綠藻中也存在有質(zhì)粒?；蛸|(zhì)粒載體是從自然界中存在的質(zhì)粒經(jīng)改造后構(gòu)建而來的，主要分為克隆載體和表達(dá)載體兩種，而后者又可分為原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體。質(zhì)粒的性質(zhì)1、質(zhì)粒的復(fù)制與拷貝數(shù)嚴(yán)緊型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒目前常用質(zhì)粒載體的復(fù)制子與拷貝數(shù)質(zhì)粒復(fù)制子拷貝數(shù)pBR322及其衍生質(zhì)粒pMB115-20pUC與pGEM系列質(zhì)粒pMB1500-700pACYC及其衍生質(zhì)粒p15A10-20pSC101及其衍生質(zhì)粒pSC1011-5ColE1ColE115-20質(zhì)粒的性質(zhì)2、質(zhì)粒的不親和性3、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移接合型質(zhì)粒(tra+)、非接合型質(zhì)粒(tra-)4、質(zhì)粒的表型：有的質(zhì)粒賦于宿主細(xì)胞一定的生物性狀，如抗性質(zhì)粒(R質(zhì)粒)、產(chǎn)大腸桿菌素的Col質(zhì)粒、引起細(xì)菌接合的育性質(zhì)粒(F質(zhì)粒)、降解毒物的降解質(zhì)粒。R質(zhì)粒的抗性有：氨芐青霉素(AporAmp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(KmKan)、四環(huán)素(TetorTc)和新霉素(Neo)等

構(gòu)建質(zhì)粒載體的條件

1、復(fù)制子與質(zhì)粒的拷貝數(shù)2、選擇標(biāo)記：抗性基因?；蚬こ梯d體用得最多的Amp抗性基因、其次是Kan抗性基因，還有少量的Cm和Tc抗性基因。3、分子量大?。?-10kb4、盡可能多的單一限制酶切位點:MCSpBR322由三部份構(gòu)成：pRSF2124的Amp基因，pSC101的Tet基因、pMB1的復(fù)制子(與ColE1類似)。Amp與Tet基因上有多個單一限制酶位點，外源基因插入其中可引起抗性的插入失活克隆載體克隆載體

pUC18/19pUC系列載體由pBR322的Amp基因、復(fù)制子和lacZ基因(來自M13mp質(zhì)粒)組成，lacZ基因內(nèi)有一由多個限制酶位點組成的DNA片段(多克隆位點，MCS)。pUC分子量較小，缺失了pBR322中控制質(zhì)粒復(fù)制的rop基因，因而有較高的拷貝數(shù)，每子細(xì)胞中可高達(dá)500-700個分子?？寺≥d體

pUC118/119pGEM-3Zf(+)pGEM系列載體與pUC，同樣為分子量小，拷貝數(shù)高的質(zhì)粒，也有l(wèi)acZ基因，主要不同處是MCS兩端的啟動子和單鏈復(fù)制子不同，也提供了不同的MCSpGEM-3Zf(-)pGEM-5Zf(+)

pGEM-5Zf(-)

pGEM-Tvector

pPoly2/sfinotpPoly2/sfinot為一很小的質(zhì)粒，可克隆較大的基因片段表達(dá)載體

在克隆載體的基礎(chǔ)上發(fā)展而成。在克隆載體的適當(dāng)位置插入與原核或真核表達(dá)有關(guān)的元件(啟動子、終止子)，并且在啟動子與終止子之間有合適的MCS，即構(gòu)建成了表達(dá)載體。表達(dá)載體一般要求有強(qiáng)的啟動子和強(qiáng)的終止信號，有的還含有增強(qiáng)子。一些特殊用途的表達(dá)載體還有其它一些功能元件，如：調(diào)控序列、信號肽、跨膜區(qū)、定位表達(dá)等。真核表達(dá)載體除有原核抗基因外，不少載體還有其它抗藥性基因，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物使轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得抗某些藥物的能力。如：新霉素(Neo)、潮素(hygro)、dhfr(氨甲蝶呤)原核表達(dá)載體pET-28a(+)原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體pBV220pBV220為我國科學(xué)家張智清構(gòu)建，為溫控型原核表達(dá)質(zhì)粒，在我國已廣泛應(yīng)用原核表達(dá)載體pEZZ18pEZZ18在MCS的上游有SPA的分泌信號序列，為一分泌性原核表達(dá)載體真核表達(dá)載體pcDNA3.1

pcDNA3.1含有CMV立即早期啟動子與增強(qiáng)子、牛生長激素基因的終止信號，及Neo抗性基因。轉(zhuǎn)染有該質(zhì)粒的細(xì)胞在G418(Neo類似物)的作用下能存活，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則死亡，據(jù)此，可克隆得到穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞系。真核表達(dá)載體

pIRESneo

pIRESneo含有CMV立即早期啟動子與增強(qiáng)子、牛生長激素基因的終止信號，及Neo基因、提高mRNA穩(wěn)定性的內(nèi)含子IVS和核糖體進(jìn)入位點(IRES)。IRES的存在可使同一mRNA分子上的2個ORF得以有效翻譯。在抗性基因與外源基因分別由不同的啟動子控制的表達(dá)載體中，由于外源基因丟失后，并不影響抗性基因的表達(dá)，此類型的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在G418的作用下存活下來的約60%的細(xì)胞不表達(dá)外源基因。而該載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在G418的作用下存活的細(xì)胞大部份均表達(dá)外源基因。真核表達(dá)載體

pVAX1

為一結(jié)構(gòu)簡單的真核表達(dá)質(zhì)粒，F(xiàn)DA同意其作為基因疫苗的載體表面呈現(xiàn)真核表達(dá)載體

pDisplay

該載體與pcDNA3結(jié)構(gòu)類似。在其MCS的上游有引導(dǎo)分泌的信號肽序列，在MCS的下游有PDGFR基因的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域編碼的多肽將表達(dá)的外源蛋白錨定在細(xì)胞膜上。真核表達(dá)載體pGFP-C1該載體與pcDNA3.1結(jié)構(gòu)類似。在MCS的上游有綠色熒光蛋白(GFP)的基因序列，外源基因插入GFP的下游形成融合表達(dá)?？捎糜谘芯炕虻谋磉_(dá)定位。pCIVector

該載體與pcDNA3結(jié)構(gòu)類似。在緊跟CMV啟動子的下游有CMV立即早期基因的第一個內(nèi)含子，該內(nèi)含子可提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。pCI-neoVector

pCATVector

一些特殊的載體（一）、染色體定位整合載體：基因整合平臺系統(tǒng)(geneintegrationplatformsystem).包括2個部分：整合平臺：受體細(xì)胞基因組上特定的一個DNA區(qū)域，是外源DNA定位整合的位置定位整合克隆載體：除與一般質(zhì)粒載體所需要的元件外，還有一個或2個與整合平臺區(qū)域同源的DNA序列。利用基因整合平臺系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的方法也稱為基因打靶(genetargeting)或基因定位同源重組①、內(nèi)源平臺雙交換置換克隆載體系統(tǒng)②外源平臺雙交換置換克隆載體系統(tǒng)③、內(nèi)源平臺雙交換插入克隆載體系統(tǒng)④、內(nèi)源平臺單交換插入克隆載體系統(tǒng)（二）、人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體是一種“穿梭”載體，含有質(zhì)?？寺≥d體所必須的第一受體(E.coli)源質(zhì)粒的復(fù)制子(ori),還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點、端粒和自制起始位點的序列。該類載體在E.coli中可按質(zhì)粒形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制，當(dāng)與目的基因連接后，轉(zhuǎn)化第二受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的按染色體DNA復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。特點：可容納1000kb甚至3000kb的DNA片段類型：BAC、YAC（三）、組織特異性表達(dá)克隆載體在高等真核生物中，一些特殊的DNA調(diào)控序列(啟動子)可調(diào)控基因只在一定的組織中才進(jìn)行有效的表達(dá)。選用這樣的啟動子可以構(gòu)建一系列組織特異性表達(dá)載體1、乳腺表達(dá)載體2、腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)載體，如Her23、植物：花藥與種子特異性表達(dá)載體三、質(zhì)粒的提取四、核酸的瓊脂糖凝膠電泳注：根據(jù)本人經(jīng)驗用TAE緩沖液時，即使小至150bp的DNA分子在0.75%的瓊脂糖凝膠中分離得也很好五、基因工程工具酶

分子生物學(xué)中常用的工具酶有限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、RnaseA、堿性磷酸酶、DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激、核酸酶（一）限制性內(nèi)切酶與連接酶

Restrictionendonucleases&ligase能識別并切割dS-DNA分子內(nèi)特殊核甘酸序列的酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。1952午Luria和Human在研究T偶數(shù)噬茵體及1953年Bertani和Weigle在研究λ和P2噬菌體的宿主范圍時發(fā)現(xiàn):當(dāng)一個噬茵體從其天然宿主E.coli品系A(chǔ)轉(zhuǎn)到另一個品系B細(xì)胞中時，往往不能生長。他們把此現(xiàn)象稱為宿主控制性限制現(xiàn)象1962年，Arber及其同事們作了大量工作，經(jīng)過放射性同位素標(biāo)記證明，噬菌體在新品系中的損害伴隨有其DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，他們提出了限制-修飾酶假說來解釋這種現(xiàn)象。

細(xì)菌的限制與修飾系統(tǒng)Restrictionendonucleases

arefoundinawiderangeofbacterialspecies.WernerArberdiscoveredthattheirbiologicalfunctionistorecognizeandcleaveforeignDNA(e.g.,theDNAofaninfectingvirus);suchDNAissaidtoberestricted.Thecell'sownDNAisnotcleavedbecausethesequencerecognizedbytherestrictionendonucleaseismethylated(andtherebyprotected)byaspecificDNAmethylase.Therestrictionendonucleaseandthecorrespondingmethylaseinabacteriumaresometimesreferredtoasarestriction-modificationsystem.Therearethreetypesofrestrictionendonucleases,designatedI,II,andIII.TypesIandIIIaregenerallylarge,multisubunitcomplexescontainingboththeendonucleaseandmethylaseactivities.TypeIrestrictionendonucleasescleaveDNAatrandomsitesthatcanbe1,000basepairsormorefromtherecognitionsequence.TypeIIIenzymescleavetheDNAabout25basepairsfromtherecognitionsequence.ThetypeIIrestrictionenzymes,firstisolatedbyHamiltonSmith,aresimpler,requirenoATP,andcleavetheDNAwithintherecognitionsequenceitself?TheextraordinaryutilityofthetypeIIenzymeswasfirstdemonstratedbyDanielNathans,andthesearetheenzymesusedmostwidelyforrecombinantDNAwork.

Morethan800restrictionendonucleaseshavebeendiscoveredindifferentbacterialspecies.Over100differentspecificsequencesarerecognizedbyoneormoreoftheseenzymes.Thesesequencesarealmostalwaysshort(fourtosixbasepairs,occasionallymore)andpalindromicSomerestrictionendonucleasescleavebothstrandsofDNAsoastoleavenounpairedbasesoneitherend;theseendsareoftencalledbluntends.OthersmakestaggeredcutsonthetwoDNAstrands,leavingtwotofournucleotidesofonestrandunpairedateachresultingend.Thesearereferredtoascohesiveendsorstickyends.becausetheycanbase-pairwitheachotherorwithcomplementarystickyendsofotherDNAfragments.常用限制性內(nèi)切酶(RE)(一)產(chǎn)生3＇凹端的REBamHⅠ:GGATCCEcoRⅠ:GAATTCHindⅢ:AAGCTTSalⅠ:GTCGACXbaⅠ:TCTAGAXhoⅠ:CTCGAGBamHⅠ:GGATCCNNNGGATCCNNNNNNCCTAGGNNNBamHⅠNNNGGATCCNNNNNNCCTAGGNNN(二)產(chǎn)生3‘凸端的REKpnⅠ:GGTACCPstⅠ:CTGCAGNNNGGTACCNNNNNNCCATGGNNN

KpnⅠ

NNNGGTACCNNNNNNCCATGGNNN（三）、產(chǎn)生平端的REEcoRⅤ:GATATCSmaⅠ:CCCGGGNNNNGATATCNNNNNNNNCTATAGNNNNEcoRⅤNNNNGATATCNNNNNNNNCTATAGNNNN限制酶活性單位的定義：在限定的溫度和緩沖液下，1小時消化1μgDNA所需要的酶量。如何進(jìn)行限制酶切反應(yīng)DNA的酶切反應(yīng)一般總反應(yīng)體積常用20μl，DNA量用0.1-1.0μg。在一微量離心管中分別加入以下反應(yīng)組份1、10×反應(yīng)Buffer………2μl2、DNA….0.1-1.0μg3、限制酶…2-5μ4、水補(bǔ)至…20μl將上述各組份混勻后，置適當(dāng)溫度(多為37℃)作用1-4小時，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定.IsolationofDNAWhereisDNA?LysisBufferStraining&CentrifugationSummaryanimationoftherunningofanagarosegelDNA酶切注意事項1.市售RE酶均保存在含50%的甘油儲藏Buffer中，甘油在酶切反應(yīng)中濃度過高，對酶切效率有抑制作用，所加酶量不能超過反應(yīng)總體積的1/10，特別注意控制在多個酶切反應(yīng)中酶的總量。2.目前，在DNA的酶切反應(yīng)中，往往超量使用酶。市售RE酶的濃度多數(shù)為10μ/μl。以前，RE特別昂貴，多取0.1μlRE進(jìn)行小量DNA的酶切鑒定。目前，價格已大大降低，可不必如此經(jīng)濟(jì)。如TaKaRa公司酶的說明書要求小量DNA的酶切鑒定用1μl每個反應(yīng)，Promega則要求0.5μl每個反應(yīng)。理論上每個反應(yīng)用0.1μl即可切得很好。實際工作中每3-5個反應(yīng)用1μl酶是完全可靠的。DNA酶切注意事項

3.每一RE生產(chǎn)廠家均有其酶切反應(yīng)Buffer種類，一般以10×濃度提供：如Promega公司的A、B、C、D、E、K、MBuffer，TaKaRa公司的L、M、H、KBuffer。MBI公司的B、G、O、RBuffer。每種Buffer均用固定顏色蓋的小管分裝。酶有多種，但Buffer只有4-8種，裝酶的小管蓋的顏色與相應(yīng)裝Buffer小管蓋的顏色一致。4.雙(多)酶切Buffer的選擇：相同Buffer；不同Buffer的酶切5.選擇酶的一個經(jīng)驗：同一廠家越便宜的酶其質(zhì)量和性能越有保證，因質(zhì)量和性能好的酶大家用得多，其價格自然便宜。6.在多數(shù)情況下，一個小時可將DNA切割完全，如若超過2個小時還切割不完全，在酶的質(zhì)量沒有問題的前提下，一般是質(zhì)粒DNA的純度不夠，有時用酚-氯仿提抽可解決問題，但多數(shù)情況下進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA往往達(dá)不到目的(原因不明)，明智的選擇是重新提取和純化質(zhì)粒。(二）DNAligase1、T4DNAligase催化DNA分子的5‘-P與3’-OH之間形成磷酸二酯鍵。它既能連接粘性末端，又能連接平端，但連接粘端的效率比平端的要高得多。其連接活性多數(shù)廠商用Weiss單位(μ)表示,濃度一般是1-3μ/μl。在多數(shù)情況下對于DNA重組來說，平端用1μ，而粘端用0.1μ即可達(dá)到有效連接DNA分子的目的。2.大腸桿菌DNA連接酶：一般只能連接粘性末端，不能連接平端，很少使用。（三）RNA酶RNaseA:用于消化DNA制品中的RNA。RNA酶特別穩(wěn)定，100℃煮10分鐘活性不下降。來源多，人的皮膚上即有RNA酶，因此，提取RNA要特別小心（四）分子生物學(xué)其它常用酶1、Klenow片段

NNGGATCCNNNNNNNNNNCTGCAGNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNGACGTCNNNBamHⅠ+PstⅠ

GATCCNNNNNNNNNNCTGCAGNNNNNNNNNNGKlenow+dNTPGATCCNNNNNNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNGKlenow用于補(bǔ)平限制酶切割DNA產(chǎn)生的3‘凹端和削平3‘凸端，但后一作用已被T4噬菌體DNA聚合酶所代替2、T4多聚核苷酸激、堿性磷酸酶T4多聚核苷酸激用于缺乏5′-P基團(tuán)的DNA片段進(jìn)行磷酸化、堿性磷酸酶的作用恰恰相反，它用于除去DNA分子的5′-P基團(tuán)，以阻止酶切后DNA載體的自身環(huán)化。注①：PCR產(chǎn)物的5′末端沒有磷酸根，因此，PCR產(chǎn)物之間不能直接連接，需要用T4多聚核苷酸激酶先加上磷酸根。注②：為降低基因克隆的背景，提高轉(zhuǎn)化子的陽性率，常用堿性磷酸酶除去DNA載體酶切后的5′-P基團(tuán)。但這一目的通過提高外源基因片段與載體的分子比例可很好達(dá)到這一目的。六、目的基因的獲得基因克隆是將不同的目的基因與載體相連接，組