共焦顯微鏡與組織病理檢查對真菌性角膜炎的診斷價值

共焦顯微鏡與組織病理檢查對真菌性角膜炎的診斷價值

0fk其他致病性感染的臨床研究真菌性角膜炎（fk）是一種高度盲的疾病。近年來，由于廣泛使用抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑以及膜接觸顯微鏡的增加，發(fā)病率顯著增加。fk有許多常見的病毒，如刀菌、沙丁魚、細菌等。在中國，大多數(shù)病毒都可以用刀菌和沙丁魚感染。比較了膜豆菌和革蘭氏菌在不同膜豆菌感染中的生長特征。1材料和方法1.1材料表面健康成年有色兔24只,質(zhì)量2.0~2.5kg,雌雄兼用(西安交通大學動物中心).使用前裂隙燈顯微鏡檢查,證實無眼前節(jié)病.1.2曲霉菌模型的制作實驗前3d,給與妥布霉素眼液點眼4次/d.將24只兔隨機分成A,B兩組,每組12只.處死A組兔,無菌條件下摘取眼球,用φ8mm環(huán)鉆制備全厚角膜植片備用.B組兔右眼為模型眼,左眼為對照眼.皮下注射速眠新Ⅱ0.2mL/kg進行全身麻醉,右眼10g/L地卡因液表面麻醉,5mL/L慶大霉素溶液沖洗結膜囊,用φ5mm環(huán)鉆在角膜中央劃痕,刮除劃痕中的角膜上皮.取制備好的角膜植片從內(nèi)皮面作“#”形劃痕后,用10-0尼龍線放射狀縫合8針將其固定于刮除上皮的角膜上.用注射器抽取0.1mL曲霉菌混懸液將其注入植片與植床角膜層間的中央,結膜囊涂紅霉素眼膏,3-0絲線縫合上下眼瞼.左眼與右眼制作方法相同,植片與植床角膜層間注入0.1mL生理鹽水作為對照.3d后拆除眼瞼縫線,去除角膜植片,觀察B組兔角膜情況.分別在造模后的第3,7,10,15日行裂隙燈顯微鏡、角膜刮片、角膜共焦顯微鏡(日本NIDEK公司confoscan3)、角膜病理切片檢查及真菌培養(yǎng)且分別處死3只兔,沿角膜緣切取角膜、虹膜,按子午線方向剖成兩等份,一份常規(guī)行40g/L甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE(蘇木素-伊紅)染色和PAS(高碘酸-希夫)染色,光學顯微鏡下觀察其形態(tài)學改變并拍照,一份送培養(yǎng).2結果2.1兔視網(wǎng)膜組織病理學檢測接種真菌的12只兔眼均一次接種成功,在接種的第3日可觀察到淺層角膜真菌病變,病變角膜與健康角膜邊界清晰,角膜表面粗糙,輕度隆起,基質(zhì)混濁水腫,前房無積膿.第7日,可見明顯潰瘍灶并有苔垢樣壞死組織附著,潰瘍邊緣稍隆起毛糙不齊,部分兔角膜周邊可見衛(wèi)星灶,內(nèi)皮面有內(nèi)皮斑,角膜彌漫性霧狀水腫,前房可見積膿.第10日,潰瘍灶縮小炎癥反應減輕.第15日,上皮基本完整,可見瘢痕形成.對照組3d時,角膜上皮基本愈合.2.2曲霉菌的分布3.9moL/L氫氧化鉀濕片法檢查,第3,7日均可查見較粗、長、有分隔的曲霉菌菌絲,及成串的分生孢子,聚集似菊花樣.第10,15日未見到菌絲、孢子.2.3炎癥細胞加前房形貌早期(接種3d)見較直、短、分支比較少的高反光的菌絲及孢子,菌絲在角膜病灶邊緣生長明顯,以垂直、斜行生長方式為主,角膜基質(zhì)細胞腫脹其間伴有少量的炎癥細胞浸潤(圖1A).中期(接種7,10d)在角膜中深基質(zhì)層可見高反光的菌絲明顯變長,數(shù)量增多,周圍見大量的炎癥細胞(如中性粒細胞等)浸潤,及局灶性團狀無細胞區(qū),病變角膜內(nèi)皮面附著大量團、片狀滲出物,突于前房內(nèi),內(nèi)皮細胞腫脹邊界欠清晰(圖1B).后期(接種15d)可在基質(zhì)深層見到少量稀疏分布、短小的真菌菌絲,未見孢子,病變角膜局部可見強反光無細胞結構的瘢痕形成(圖1C).2.4he染色表現(xiàn)PAS染色早期(接種3d)見少量菌絲平行生長于膠原纖維之間(圖2A).中期(接種7,10d)見大量菌絲斜行、垂直或平行生長于基質(zhì)層,菌絲周圍可見圓形高反光孢子,呈串珠樣排列(圖2B).虹膜組織腫脹,血管高度擴張充血,可見大量新生血管.后期(接種15d)未見明顯菌絲生長.HE染色早期(接種3d)見基質(zhì)細胞腫脹,炎性細胞浸潤不明顯.中期(接種7,10d)見基質(zhì)細胞腫脹明顯,局部組織溶解,大量炎性細胞浸潤,以中性粒細胞為多,病灶局部也可見淋巴細胞、巨噬細胞.后期(接種15d)見基質(zhì)細胞腫脹減輕,角膜小面形成,膠原纖維排列紊亂,基質(zhì)層炎性細胞浸潤減少(圖2C).2.5培訓角膜標本接種于Sabouraud培養(yǎng)皿上,將其置于25℃下培養(yǎng)可見有曲霉菌菌落生長.3臨床病理切片檢查目前,臨床診斷真菌性角膜炎的方法有刮片染色,培養(yǎng),病理切片,角膜共焦顯微鏡和多聚酶鏈反應(PCR),然而這些方法在臨床早期診斷中都存在一定的不足.因此真菌性角膜炎的臨床早期快速診斷方法仍是目前的研究熱點之一.角膜共焦顯微鏡能在活體上從四維(三維空間和時間)水平對角膜組織進行快速的、無損傷的光學斷層掃描成像.本實驗通過建立與真菌性角膜炎發(fā)病相似的動物模型,應用角膜共焦顯微鏡可直觀的看到菌絲、孢子的形態(tài),菌絲在角膜基質(zhì)內(nèi)的生長方式(如垂直、斜性、平行生長),侵入角膜組織的層面及角膜內(nèi)皮面的反應情況,顯示菌絲的立體生長狀態(tài).共焦顯微鏡檢查時,物鏡鏡頭并不與角膜直接接觸,而是通過一種對角膜有保護作用的眼用凝膠接觸受檢查的角膜,不會對角膜造成損傷,在病情發(fā)展過程中可以反復多次的進行檢查,為及時判斷病情,評價療效,制定治療方案提供客觀依據(jù),亦可指導臨床角膜刮片的再次取材部位,為提高其檢測陽性率提供可靠的依據(jù).通過兔模型組織病理切片的常規(guī)染色和特異性染色,可觀察到某一時間點病變角膜中真菌菌絲形態(tài)、數(shù)量的變化,侵入角膜的范圍,區(qū)分中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的浸潤情況.但臨床病理切片只能通過活檢或手術后獲得,部位局限,容易漏診,且無法在活體角膜上觀察病變角膜的病情演變;而共焦顯微鏡具有無創(chuàng)性、可重復性,它可在活體對真菌性角膜炎發(fā)病過程中菌絲的形態(tài)、數(shù)量變化,生長方式,侵入角膜組織的范圍、深度以及炎癥細胞浸潤的部位進行詳細的觀察,這也為真菌性角膜炎的臨床治療用藥,手術方式的選擇提供了重要的依據(jù).病理切片的標本制作需經(jīng)組織切片、固定和特殊染色(如PAS染色)等處理,在此過程中不可避免的帶入了人為干擾因素,尤其在角膜只有少量菌絲生長時.因此在兔真菌性角膜炎造模的后期,在角膜只有少量菌絲生長時,很可能因人為干擾因素或切片部位的差異而病理切片未能檢到菌絲.共焦顯微鏡檢查對角膜組織進行的是快速的光學斷層掃描成像無需特殊處理,既縮短了檢查所需的時間,也減少了標本處理過程中可能帶入的人為干擾因素和所造成的假象.故造模后期除共焦顯微鏡仍可在角膜深基質(zhì)層見到少量菌絲外其余檢查均未檢見菌絲,也體現(xiàn)了共焦顯微鏡在真菌檢測中具有更高的靈敏性,這對真菌性角膜炎潰瘍愈合后仍需繼續(xù)用藥以防復發(fā)提供了客觀依據(jù).真菌性角膜炎的致病菌種類較多,形態(tài)各異,共焦顯微鏡對不同菌種的影像學特點目前尚無統(tǒng)一的診斷標準,只能根據(jù)形態(tài)區(qū)分絲狀類真菌和孢子類真菌,而不像病理切片可確定具體菌種.它可進行與組織病理切片同樣的關于菌絲及孢子的形態(tài)、數(shù)量變化,菌絲生長方式,侵入角膜組織的范圍、深度以及炎癥細胞浸潤的部位等詳細的觀察,但由于不能進行活體組織染色,目前對炎癥細胞的種類上不能區(qū)分,在病變區(qū)周圍僅從形態(tài)上可辨認出有分葉的中性粒細胞和小園形細胞可能為淋巴細胞.共焦顯微鏡雖具有無創(chuàng)性、可重復性及早期快速診斷的優(yōu)點,但其在檢查過程中需要患者的密切配