酶制劑的生產(chǎn)及其應(yīng)用

第十三講

酶制劑的生產(chǎn)及其應(yīng)用1894年，日本科學(xué)家首次從米曲霉中提煉出淀粉酶，并將淀粉酶用作治療消化不良的藥物，從而開創(chuàng)了人類有目的地生產(chǎn)和應(yīng)用酶制劑的先例。1911年，美國科學(xué)家從木瓜中提取出木瓜蛋白酶，并將木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁物。此后，酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用就逐步發(fā)展起1949年，科學(xué)家成功地用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)出了細(xì)菌α－淀粉酶，從此揭開了近代酶工業(yè)的序幕。1971年，第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議在美國召開，會議的主題就是固定化酶的研制和應(yīng)用。20世紀(jì)70年代后期，酶工程領(lǐng)域又出現(xiàn)了固定化細(xì)胞技術(shù)。1986年，我國科學(xué)家利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功，為酶工程的進(jìn)一步發(fā)展開辟了新的途徑。近20年來，隨著基因工程的滲入，使酶的定向改造成為可能，所以在固定化酶、固定化細(xì)胞和固定化原生質(zhì)體發(fā)展的同時，酶分子修飾技術(shù)、酶的化學(xué)合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在積極地開展中，從而使酶工程更加顯示出廣闊而誘人的前景。

酶制劑生產(chǎn)的歷史酶制劑的產(chǎn)品市場全世界已發(fā)現(xiàn)的酶有3000多種目前工業(yè)上生產(chǎn)的酶有60多種真正達(dá)到工業(yè)規(guī)模的只有20多種劑型和品種有60多個2001年為16億美元每年約為7――8％的增長率發(fā)展預(yù)計到2008年銷售額將達(dá)到30億美元

酶制劑的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)80％的工業(yè)酶是水解酶，主要用于降解自然界中的高聚物，如淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)。蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶是目前工業(yè)應(yīng)用的3大主要酶制劑。蛋白酶可用于去污劑、奶制品業(yè)、皮革業(yè)等；淀粉酶用于烘焙、釀造、淀粉糖化和紡織業(yè)；脂肪酶用于去污劑、食品和精細(xì)化工工業(yè)等。生產(chǎn)廠家世界上酶生產(chǎn)廠商有70多家，其中較大的有25家。最大的8家酶制劑生產(chǎn)廠商是：（1）

Novozymes（諾維信公司，丹麥）（2）

GistBroccdes（荷蘭）（3）

Cultot（科特公司，芬蘭）（4）

GenencorInternational（杰能科公司，美國）（5）

Solvay（蘇爾威公司，比利時）（6）

ClrHansen（漢森公司，丹麥）（7）

RhonePonlene（羅蘭，普朗克公司，法國）（8）

Quest（荷蘭）酶制劑的用途UseofindustrialenzymesEnzymicprocesseshavealongtraditioninhumanhistory.Inancienttimesbrewingofbeerandmakingofwineareexamples.Inmorerecentyears,enzymecatalysishasplayedimportantrolesinproductionoffinechemicalsanddrugssuchasVc,aminoacids,antibioticsandsteroids.

Thebestknownexamplestothepublicareuseofenzymesindetergents.Atpresentadetergentalsocontainslipasesandamylasestodissolvefatandstarchstains.Inordertorestorecolourofcottonthathasbeenwashedseveraltimes,cellulasesareadded.Cellulasesarealsousedtogivejeanstheso-called“stone-wash”look.Enzymesarealsoextensivelyusedinotherindustriessuchaspulpandpaperindustry,textileindustry,leatherindustryandforbaking.Enzymesarealsousedindairyindustryandfortheproductionofwine,fruitjuice,beerandalcohol.Inparticularduetoneedofenantiopurepharmaceuticalsandbuildingblocksfororganicsynthesis,theuseofenzymecatalysisinfinechemicalsandpharmaceuticalindustryisincreasing.Whyareenzymesofinterestascatalystsinsynthesis?

Thereareuniqueadvantagesthatenzymesofferwhicharedifficulttoobtainbyconventionalcatalysis.Firstofall,theyhavegreatselectivityandspecificity.Nomatterhowsimpletheenzyme-catalysedchemicalreactionis,thismaybeonthreelevel:

chemoselectivity,regioselectivity

andstereoselectivity

and

stereospecificity.Chemoselectivity

istheabilityoftheenzymetodirectthecatalyticactiontoaspecificfunctionalgroupinthemoleculesoastodistinguishbetweenOHorNH.Whenthesubstratecontainsseveralfunctionalgroupsofthesamekind,asseenincarbohydrates,theenzymeisabletocatalysearegioselectivereactionofoneparticularOH-group.

Thestereochemcialpropertiesofenzymesareextremelyattractiveinorganicsynthesis.Enzymecatalysismaybeusedforproductionofenantiopurechiralmoleculeseitherbyenantioselectiveasymmetricsynthesisortoresolveracemicmixtures.Thestereochemicalpropertiesofenzymesareimportantbutsoisthefactthatenzymesworkundermildconditions.Thelatterisbecomingmoreandmoreimportantasgreaterdemandsaremadeonchemicalprocessindustryconcerningenvironmentalaspects.ImportanceofenantiopurecompoundsNomatterifapairofenantiomershaveexactlythesamechemicalandphysicalproperties,suchasmeltingpoint,boilingpointandspectraandevenshowthesamereactivityinandachiralenvironment,theyare,inprinciple,totallydifferentcompoundswhentheyinteractwithchiralmolecules.Itiswellknownthatsomeenantiomersmayhavedifferentodoursandtastes.Forexample,(S)-carvonetastesofcarawaywhilethethe(R)-enantiomertastesofspearmint.Theeffectofdifferentenantiomersmaybeparticularlysignificantfordrugs.Hencedrugsthatarechiralmustbeadministeredassingleenantiomers.Biotransformation

dealswiththeuseofbiologicalcatalyststoconvertasubstrateintoaproductinalimitednumberofenzymaticsteps.Biologicalcatalystswhencomparedwithchemicalcatalystshavetheadvantagesoftheirregioselectivityandstereospecificitywhichleadtosingleenantiomericproductswithregulatoryrequisitesforpharmaceutical,foodandagriculturaluse.Theyarealsoenergyeffectivecatalystsworkingatmoderatetemperatures,pressuresandpHvalues.Biotransformationshavebeenperformedbyavarietyofbiologicalcatalysts,suchasisolatedenzymes,cells,immobilizedenzymesandcellsthedevelopmentsofrecombinantDNAtechnologyhaveledtoimprovementsintheenzymeproductionindifferenthostorganismsgivingthebioprocessengineeragreaterchoiceofbiocatalystoption.誘導(dǎo)酶與組成型酶需要加入誘導(dǎo)物才可以產(chǎn)生的酶叫誘導(dǎo)酶不需加入誘導(dǎo)物就可以產(chǎn)生的酶叫組成型酶不需加入誘導(dǎo)物就可以產(chǎn)生誘導(dǎo)酶的突變株，叫做組成型突變株（調(diào)節(jié)性突變）酶的生產(chǎn)酶的生產(chǎn)技術(shù)培養(yǎng)基pH溫度DO培養(yǎng)基碳源氮源碳氮比無機鹽生長因子產(chǎn)酶促進(jìn)劑碳源許多酶類生產(chǎn)以玉米粉、甘薯粉、淀粉等為碳源，價格便宜，而且對產(chǎn)酶有誘導(dǎo)作用有些碳源對酶的合成有分解代謝產(chǎn)物阻遏作用，要注意控制其濃度氮源氮源對微生物產(chǎn)酶有誘導(dǎo)和抑制作用多數(shù)情況下將有機氮源和無機氮源配合使用，在高濃度的有機氮源外添加1-3%的無機氮源碳氮比碳氮比低有利于菌體生長的需要，種子與發(fā)酵前期采用低碳氮比碳氮比高有利于菌體產(chǎn)酶的需要，發(fā)酵中后期采用高碳氮比無機鹽同其它微生物產(chǎn)品生產(chǎn)一樣

氨基酸、維生素、嘌呤堿和嘧啶堿，通過加入玉米漿、酵母膏、麩皮、米糠以及豆餅和玉米來提供生長因子產(chǎn)酶促進(jìn)劑誘導(dǎo)物或誘導(dǎo)物前體表面活性劑，胞外酶，一般使用非離子表面活性劑，而不用陽離子或陰離子試劑pH黑曲霉生產(chǎn)糖化酶同時產(chǎn)生-淀粉酶和葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶pH傾向中性時，糖化酶活性低，另兩種酶活性高pH傾向酸性時，糖化酶活性高，另兩種酶活性低溫度控制

根據(jù)菌體生長和酶合成的需要，進(jìn)行變溫生產(chǎn)，以枯草桿菌As1.398進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)，培養(yǎng)溫度必須從31oC逐漸升溫至40oC，然后再降溫至31oC，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66％DO一般，通氣量少對霉菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長有利，對酶生產(chǎn)不利；通氣量大則相反但也有相反的情況，如黑曲霉的-淀粉酶的生產(chǎn)，酶生產(chǎn)時菌的需氧量為生長旺盛時的36-40%α-淀粉酶生產(chǎn)工藝

生產(chǎn)菌種：芽孢桿菌，BF-7658

生產(chǎn)工藝流程斜面孢子懸浮液種子罐

發(fā)酵罐提取斜面

馬鈴薯培養(yǎng)基或淀粉蛋白胨培養(yǎng)基茄子瓶50ml左右，37℃72h

孢子懸浮液

用50ml無菌生理鹽水洗下種子及發(fā)酵培養(yǎng)工藝配方

種子罐3M3發(fā)酵罐30M3總配比基料補料豆餅粉45.65.35.5玉米粉3117.222.3Na2HPO4

0.80.80.80.8(NH4)2SO4

0.40.40.40.4NH4Cl0.150.150.130.2淀粉酶

10-15萬單位

100萬單位

30萬單位

CaCl2

-0.20.130.4體積

12m3

4m3

不同階段通風(fēng)比為：種子罐0-10小時，1:1.3；10-14小時1:1.45發(fā)酵罐0-12小時，1:0.74；12小時以后1:1.46-1.1中間補料:12小時后，每隔1小時補料一次直至多40小時左右。pH高于6.5，菌體空泡多，意味著出現(xiàn)衰老，多補一些。補料結(jié)束后6-8小時，升至7.5，營養(yǎng)細(xì)胞80%不空泡，酶活不增加，放罐。

補料優(yōu)點：（低濃度發(fā)酵和高濃度補料）1、有利于菌體生長產(chǎn)酶2、發(fā)酵后殘?zhí)?、殘氮低，便于提?、高濃度補料可以保持環(huán)境穩(wěn)定，延長產(chǎn)酶期，增強菌體產(chǎn)酶的誘導(dǎo)作用，增加產(chǎn)酶量ProductionofaminoacidsbybiotransformationsProductionofL-phenylalanine苯丙酮酸＋天冬氨酸苯丙氨酸天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶轉(zhuǎn)化過程天冬氨酸轉(zhuǎn)