食品生物技術(shù)概論 廖威 第三章 酶工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

第三章酶工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用食品生物技術(shù)概論酶工程的概述酶工程（enzymeengineering)又稱酶技術(shù)，是指利用酶催化的作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品的過程，它是酶學(xué)理論與化學(xué)技術(shù)相結(jié)合而形成的一門新技術(shù)。酶工程是生物工程的重要組成部分，它與基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程相互依存、相互促進(jìn)，它們在生物工程的研究、開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化過程中要靠彼此合作來實現(xiàn)。

一、酶工程的內(nèi)容1.酶工程的分類：（1）化學(xué)酶工程：自然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶、化學(xué)人工酶的研究和應(yīng)用。（2）生物工程酶：①用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）；②修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）；③設(shè)計新酶基因，合成自然界不曾有的酶（新酶）。（8）抗體酶、人工酶和模擬酶

抗體酶是一類具有催化活性的抗體。是抗體的高度專一性與酶的高效催化能力二者巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。其研究內(nèi)容是：抗體酶的制備、結(jié)構(gòu)、特性、作用機(jī)理、催化反應(yīng)類型、應(yīng)用等。人工酶是用人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白質(zhì)。據(jù)1977年Dhar等人報道，人工合成的Glu—Phe—Ala—Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八肽具有溶菌酶的活性。其活性為天然溶菌酶的50%。利用有機(jī)化學(xué)合成的方法合成了—

些比酶結(jié)構(gòu)簡單得多的具有催化功能的非蛋白質(zhì)分子。這些物質(zhì)分子可以模擬酶對底物的結(jié)合和催化過程。既可以達(dá)到酶催化的高效率，又能夠克服酶的不穩(wěn)定性。這樣的物質(zhì)稱為模擬酶。用環(huán)糊精已成功地模擬了胰凝乳蛋白酶等多種酶。酶的生產(chǎn)酶的提取酶的分離純化制成酶制劑后直接利用制成固定化酶（或固定化細(xì)胞）后利用用于治療疾病用于加工和生產(chǎn)一些產(chǎn)品用于化驗診斷和水質(zhì)臨界測定用于生物技術(shù)其他分支領(lǐng)域酶制劑的利用酶制劑的生產(chǎn)

一、酶的生產(chǎn)酶的生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，并且通過人工控制而獲得所需要的酶的過程。3種方法：提取法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法。最常用的是微生物發(fā)酵法。1.微生物發(fā)酵生產(chǎn)法的優(yōu)點

①微生物菌株種類繁多，酶的品種齊全。②微生物生長繁殖快，生活周期短，酶的產(chǎn)量高。③微生物培養(yǎng)方法簡單，生產(chǎn)原料來源豐富，價格低廉，機(jī)械化程度高，經(jīng)濟(jì)效益高。④微生物有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過適應(yīng)、誘導(dǎo)、誘變及基因工程等方法培育出新的產(chǎn)酶菌種。2.微生物發(fā)酵法制酶對生產(chǎn)菌的要求

①安全可靠，非致病菌，不會產(chǎn)生有毒物質(zhì)。②產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易退化，不易感染噬菌體。③繁殖快，產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶。④能利用廉價的原料，發(fā)酵周期短，易培養(yǎng)。⑤產(chǎn)生的酶容易分離純化。3.發(fā)酵方法與發(fā)酵條件

（1）發(fā)酵方法①固體發(fā)酵法：以麩皮、米糠等為基本原料，加無機(jī)鹽和適量水分（通常50%左右）進(jìn)行的微生物培養(yǎng)。方法：淺盤法（培養(yǎng)基不超過5cm）轉(zhuǎn)鼓法（培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)翻動）通氣式厚發(fā)酵（培養(yǎng)基可達(dá)20～30mm）3.發(fā)酵方法與發(fā)酵條件

②液體發(fā)酵法：利用合成的液體培養(yǎng)基在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行攪拌通氣培養(yǎng)的發(fā)酵方法。方法：間歇發(fā)酵法連續(xù)發(fā)酵法3.發(fā)酵方法與發(fā)酵條件（2）發(fā)酵條件的控制

發(fā)酵條件既要有利菌體生長繁殖，又不影響酶的形成。一般處理是先確定菌體生長的最適條件，然后作出調(diào)整以滿足酶生成的需要。首先，培養(yǎng)基組成對菌的生長和酶的合成具有最直接的影響。其次，通風(fēng)量、培養(yǎng)溫度等因素不僅影響菌體生長，也影響酶的合成。一般來說在低于生長溫度下產(chǎn)酶量高。培養(yǎng)溫度還影響酶活力的穩(wěn)定性。另外，在生產(chǎn)中掌握適宜酶的回收期時也很重要，對于大多數(shù)胞外酶來說，酶合成與菌株生長大致平行，生長停止時酶產(chǎn)量達(dá)最大，再培養(yǎng)酶產(chǎn)量多要下降。4.產(chǎn)酶常用的微生物（1）細(xì)菌：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等（2）放線菌：鏈霉菌（3）霉菌：黑曲霉、米曲霉、紅曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等（4）酵母：啤酒酵母、假絲酵母5.微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)：

在人工控制的條件下，有目的利用微生物培養(yǎng)來生產(chǎn)所需的酶。包括：培養(yǎng)基，發(fā)酵方式的選擇，發(fā)酵條件的控制管理等。

（1）培養(yǎng)基①碳源②氮源③無機(jī)鹽類④生長因子⑤pH

（2）酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式①固體發(fā)酵：用于真菌的酶生產(chǎn)，如米曲霉生產(chǎn)淀粉酶，曲霉和毛霉生產(chǎn)蛋白酶。②液體深層發(fā)酵：控制發(fā)酵條件溫度、通氣和攪拌、pH等發(fā)酵條件。

（3）提高酶產(chǎn)量的措施①選育優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株②添加誘導(dǎo)物：酶的作用底物，酶的反應(yīng)產(chǎn)物，酶的底物類似物。③降低阻遏物濃度④表面活性劑⑤添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑

二、酶的分離純化酶的分離純化：是指從微生物的發(fā)酵液或動植物組織提取液及細(xì)胞培養(yǎng)液中得到不同純度、高質(zhì)量的酶產(chǎn)品。酶分離純化的方法是根據(jù)酶的蛋白質(zhì)特性而建立的。酶的分離純化細(xì)胞破碎酶的提取離心分離過濾與膜分離層析分離電泳分離萃取分離濃縮干燥結(jié)晶1、細(xì)胞破碎除胞外酶之外，絕大多數(shù)酶都存在于細(xì)胞內(nèi)部。先收集細(xì)胞，破碎細(xì)胞，讓酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，然后進(jìn)行酶的提取和分離純化細(xì)胞破碎的方法：機(jī)械破碎法、物理破碎法、化學(xué)破碎法、酶促破碎法等。

細(xì)胞破碎方法及原理分類細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎原理機(jī)械破碎法搗碎法研磨法勻漿法通過機(jī)械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎物理破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，從而使細(xì)胞破碎化學(xué)破碎法添加有機(jī)溶劑添加表面活性劑通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎酶促破碎法自溶法外加酶制劑法通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎2、酶的提取酶的提取過程就是在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分地溶解到提取液中的過程。酶的提取方法：鹽溶液提取法、酸溶液提取法、堿溶液提取法、有機(jī)溶劑提取法等。

酶的主要提取方法提取方法用于提取的溶劑提取的酶的性質(zhì)鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液在低鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液在稀酸溶液中溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH8～12的水溶液在稀堿溶液中溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑與脂類結(jié)合或者含較多非極性基團(tuán)的酶3、酶的分離純化酶的純化就是把雜質(zhì)從酶溶液中除掉或從酶溶液中把酶分離出來。包括：沉淀、過濾、層析、電泳、萃取、結(jié)晶、干燥等。4、沉淀分離沉淀分離就是通過改變某些條件或添加某些物質(zhì)，使酶的溶解度降低，從溶液中沉淀析出而與其他溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。包括：鹽析沉淀法、等電點沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法。沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用酶（蛋白質(zhì)）在不同鹽濃度下的溶解度不同的原理，使酶或者雜質(zhì)析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點的特性，調(diào)節(jié)溶液的pH，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些性質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離5、離心分離離心分離就是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使大小不同、密度不同的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。離心機(jī)：低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)。5、離心分離低速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速8000r/min。主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速（1～2.5）×104r/min。用于細(xì)胞碎片和細(xì)胞器的分離超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速（2.5～12）×104r/min。主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器和病毒的分離純化、沉淀系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。6、過濾分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將大小不同、形狀不同的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)：濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷和各種高分子膜等。過濾類型：膜過濾（微濾以及超濾、反滲透、透析、電滲析等采用各種高分子膜作為過濾介質(zhì)），非膜過濾（將粗濾及部分微濾采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)）。過濾的種類及特性類別截留的顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾＞2μm酵母、霉菌、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微過濾、微孔陶瓷超濾20A至2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透＜20A生物小分子、鹽、離子等反滲透膜7、層析分離層析分離是利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)）的不同，使各組分以不同比例分配在兩相中。其中一個相為固定相，另一個相為流動相，當(dāng)流動相流經(jīng)固定相時，各組分以不同發(fā)速度移動，從而使不同的組分分離純化。層析分離方法層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中各組分的相對分子質(zhì)量不同而使各組分分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離8、電泳分離帶電離子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。物質(zhì)顆粒在電場中的移動方向：帶正電荷的顆粒向電場的陰極移動；帶負(fù)電荷的顆粒向陽極移動；凈電荷為零的顆粒在電場中不移動。顆粒在電場中的移動速度主要取決于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀、大小、電場強(qiáng)度、溶液的pH、離子強(qiáng)度、支持體的特性等外界條件的影響。8、電泳分離電泳的方法：紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、自由電泳、等電聚焦電泳等。在酶學(xué)研究中，電泳技術(shù)主要用于酶的純度鑒定、酶的分子質(zhì)量測定、酶等電點測定以及少量酶的分離純化。9、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。兩相指的是互不相溶的兩個液相或其他液體。按照兩相的組成不同，萃取可分為有機(jī)溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃取等。10、結(jié)晶結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。結(jié)晶的方法：鹽析結(jié)晶法、有機(jī)溶劑結(jié)晶法、透析平衡結(jié)晶法、等電點結(jié)晶法等。11、干燥干燥是將固體、半固體或濃縮液中的水分或其他溶劑除去一部分，以獲得含水分較少的固體物質(zhì)的過程。酶經(jīng)過干燥后，可以提高酶的穩(wěn)定性，利于產(chǎn)品保存、運輸和使用。常用的干燥方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥和吸附干燥等。3、在酶的分離純化工業(yè)中必須注意的問題（1）要注意防止酶變性失活除少數(shù)情況外，所有操作必須在低溫下進(jìn)行，特別是有機(jī)溶劑存在時更要特別小心；大多數(shù)酶在pH＜4或pH＞10的條件下不穩(wěn)定，故不能過酸過堿；酶溶液常易在表面上形成泡沫而變性，故應(yīng)防止泡沫的形成；重金屬能引起酶失效，有機(jī)溶液能使酶變性，微生物污染、蛋白酶能使酶分解，都必須予以防止。（2）酶的分離純化的目的是將酶以外的所有雜質(zhì)盡可能除去，因此在不破壞酶所需的條件下，可使用各種“激烈”的手段，此外，由于酶和它的底物、抑制劑等具有親和性，當(dāng)這些物質(zhì)存在時，酶的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性又會發(fā)生一定的變化，從而提供了更多可供采用的條件和方法。（3）通過檢測酶活性，跟蹤酶的來龍去脈，為選擇適當(dāng)方法和條件提供了直接依據(jù)。在工作過程中從原材料開始每步都必須檢測酶活性，一個好的方法和措施是使酶的純度提高倍數(shù)大，活力回收高，同時重復(fù)性好。

二、化學(xué)人工酶根據(jù)酶的催化原理，模擬酶的生物催化功能，用有機(jī)化學(xué)和生物學(xué)的方法合成具有專一催化功能的酶的模擬物——人工酶（arti-ficialenzyme）。人工酶的制作有兩種：半合成酶和全合成酶。

二、化學(xué)人工酶1.半合成酶將具有一定結(jié)構(gòu)和功能的物質(zhì)與特異的蛋白質(zhì)結(jié)合，使可形成新的生物催化劑——半合成酶(Semisyhtetieemyme)。①與金屬或金屬有機(jī)物的結(jié)合。有的半合成酶是與具有催化活性的金屬或金屬有機(jī)物結(jié)合形成的。②與特異性的物質(zhì)結(jié)合。有的半合成酶是與具有特異性的物質(zhì)相結(jié)合而形成的。

二、化學(xué)人工酶2.全合成酶這類人工酶不是蛋白質(zhì)，而是有機(jī)物，通過加入酶的催化基團(tuán)與控制空間的構(gòu)象，像自然酶那樣能選擇性地催化化學(xué)反應(yīng)，包括小分子有機(jī)物(大多為金屬絡(luò)合物)、抗體酶(催化抗體)和人工聚合物酶。①小分子有機(jī)物全合成酶。氨肽酶全合成酶、轉(zhuǎn)氨全合成酶、ATP水解全合成酶。②人工聚合物酶。

一、固定化酶的特點優(yōu)點：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復(fù)使用；可連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好；酶