生物技術(shù) 酶工程

第五章酶工程酶工程概況一、酶工程定義二、發(fā)展概況三、酶工程的技術(shù)范圍四、酶工程的應(yīng)用領(lǐng)域一、酶工程定義酶是由細(xì)胞所產(chǎn)生具有催化能力的蛋白質(zhì)。它具有以下四個(gè)特點(diǎn)：專一性強(qiáng)、催化效率高反應(yīng)條件溫和反應(yīng)產(chǎn)物易純化反應(yīng)產(chǎn)物污染小、能耗低和反應(yīng)易控制一、酶工程定義酶工程的定義：

利用酶催化的作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品，它是酶學(xué)理論與化工技術(shù)相結(jié)合而形成的一種新技術(shù)，也是利用酶或者微生物細(xì)胞、動(dòng)植物細(xì)胞、細(xì)胞器的特定功能，借助于工程學(xué)手段來(lái)為我們提供產(chǎn)品的一門科學(xué)。優(yōu)點(diǎn)：快速；高效；產(chǎn)品回收和提純工藝簡(jiǎn)便。二、酶工程發(fā)展概況四個(gè)過(guò)程1.自然酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用2.固定化酶和固定化細(xì)胞3.多酶發(fā)應(yīng)器4.仿生技術(shù)自然酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用從動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞和組織中提取酶并加以利用的階段。1894年，日本的高峰讓吉首先從米曲霉中制得了淀粉酶，用作消化劑1908年，德國(guó)的羅姆(Rohm)制得胰酶，用于皮革的軟化1908年，法國(guó)的波伊登(Boidin)制得細(xì)菌淀粉酶，用于于紡織品的退漿1911年，美國(guó)的華勒斯坦(Wallerstein)制得木瓜蛋白酶，用于除去啤酒中蛋白質(zhì)渾濁自然酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用大規(guī)模生產(chǎn)階段1949年，用液體深層培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)菌a-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)50年代以后，酶制劑的生產(chǎn)轉(zhuǎn)向微生物液體深層發(fā)酵的方法1960年，法國(guó)的雅各(Jacob)和莫諾德(Monod)提出了操縱子學(xué)說(shuō)，闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制固定化酶和固定化細(xì)胞固定化酶階段酶的不足之處：酶的穩(wěn)定性差；只能使用一次1916年，美國(guó)的奈爾森(Nelson)和格里芬(Griffin)發(fā)現(xiàn)吸附在骨炭上的酶仍具有催化活性1953年，德國(guó)的格魯布霍費(fèi)(Grubhofer)和施來(lái)斯(Schleith)首先將淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等與重氮化聚氨基苯乙烯樹(shù)脂結(jié)合，制成固定化酶1969年，日本的千畑一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸固定化酶和固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞階段

固定化菌體(固定化死細(xì)胞)技術(shù)(70年代初)

1973年，日本在工業(yè)上成功的利用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天門冬氨酸固定化細(xì)胞(固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞技術(shù)(70年代末)1978年，日本的鈴木等人用固定化細(xì)胞生產(chǎn)a-淀粉酶研究成功固定化原生質(zhì)體技術(shù)(80年代中期)1986年開(kāi)始，用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、谷氨酸脫氫酶等的研究相繼取得成功多酶反應(yīng)器酶反應(yīng)器：

以酶作為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需的設(shè)備多酶反應(yīng)器：多種酶固定化后，制成多酶反應(yīng)器，模擬微生物細(xì)胞的多酶系統(tǒng)，進(jìn)行多種酶的順序反應(yīng)，來(lái)合成各種產(chǎn)物此技術(shù)還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段仿生技術(shù)定義：模仿生物系統(tǒng)的原理以建造技術(shù)系統(tǒng)，或者使人造技術(shù)系統(tǒng)具有生物系統(tǒng)特征或類似特征的技術(shù)。如:模擬酶根據(jù)酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物。三、酶工程的技術(shù)范圍各類自然酶的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)酶的分離、純化及鑒定技術(shù)固定化技術(shù)多酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用酶的修飾與改造四、酶的主要應(yīng)用領(lǐng)域食品工業(yè)：

佐料、香味劑等食品組分的生產(chǎn)及改良外觀顏色和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值去污劑：堿性絲氨酸蛋白酶，這類酶的特點(diǎn)：在PH9.0~10.5是穩(wěn)定且有活性在55～100°C范圍是耐熱的可與過(guò)硼酸鹽、表面活性劑、鰲合劑等共存如加酶洗衣粉醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：助消化，如多酶片抗腫瘤或抗菌試劑，如半合成青霉素血液凝塊的處理分析應(yīng)用：診斷領(lǐng)域監(jiān)測(cè)各種工業(yè)過(guò)程殺蟲(chóng)劑的分析化學(xué)藥物的生產(chǎn)：通過(guò)固定化酶或固定化細(xì)胞完成廢物處理：降解正常的底物：碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和油將廢物“再循環(huán)”，以便再利用纖維素的回收和利用酶底物用途氨基?；窵-氨基酸L-氨基酸的生產(chǎn)A-淀粉酶淀粉紡織品防縮，牙科消毒葡聚糖酶葡聚糖牙科保健葡萄糖氧化酶葡聚糖牙科保健木瓜蛋白酶蛋白質(zhì)牙科保健果膠酶果膠木材防腐，紡織纖維的浸濕青霉素酰胺酶青霉素抗菌素的合成蛋白酶蛋白質(zhì)牙科保健，鞣制皮革，底片上銀的回收其它應(yīng)用主要內(nèi)容第一節(jié)酶的發(fā)酵生產(chǎn)第二節(jié)酶的分離純化第三節(jié)酶分子改造第四節(jié)生物催化劑的固定化第五節(jié)酶反應(yīng)器第六節(jié)生物傳感器第一節(jié)酶的發(fā)酵生產(chǎn)一、酶的來(lái)源二、優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選三、基因工程菌(細(xì)胞)的構(gòu)建四、微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)一、酶的來(lái)源一切生物體都可作為酶的來(lái)源酶的早期來(lái)源：動(dòng)物臟器和植物種子主要來(lái)源：微生物一、酶的來(lái)源微生物作為酶源的優(yōu)越性：容易得到所需的酶類容易獲得高產(chǎn)菌株生長(zhǎng)周期短生產(chǎn)成本低生產(chǎn)易管理二、優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選菌種篩選的一般程序:1.樣品的采集

采樣的目的、采樣地點(diǎn)、采樣方法及采樣的數(shù)量2.菌種的分離

培養(yǎng)基的確定、培養(yǎng)條件的確定。二、優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選菌種篩選的一般程序:3.菌種的初篩

(1)用簡(jiǎn)單的定性反應(yīng)進(jìn)行初篩；(2)在最初分離階段就給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進(jìn)而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株或只將其最適菌株的一株純化分離。4.菌種的復(fù)篩

初篩之后，還要進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩的目的是在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。復(fù)篩。酶活的測(cè)定方法的建立尤其重要。優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備以下特點(diǎn)：(1)不是致病菌；(2)菌株不易變易和退化；(3)不易感染噬菌體；(4)微生物產(chǎn)酶量高；(5)酶的性質(zhì)符合應(yīng)用的需要，而且最好是胞外酶；(6)產(chǎn)生的酶便于分離和提取，得率高；(7)微生物培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求低。菌種篩選的一般程序:含菌樣品的采集，菌種分離，產(chǎn)酶性能測(cè)定及復(fù)篩等。5.最佳產(chǎn)酶條件的初步確定(1)培養(yǎng)方式的確定；(2)最佳培養(yǎng)條件組合；(3)微生物產(chǎn)酶的特性(胞內(nèi)酶、胞外酶)；(4)微生物酶收集的時(shí)間順序；三、基因工程菌(細(xì)胞)的構(gòu)建運(yùn)用基因工程的手段將原有菌株中的目的基因轉(zhuǎn)移到另外一些對(duì)生產(chǎn)環(huán)境更適應(yīng)性的微生物細(xì)胞之內(nèi)，使其高效表達(dá)四、微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基的選擇發(fā)酵生產(chǎn)方式發(fā)酵條件控制提高酶的產(chǎn)量培養(yǎng)基的選擇酶的合成受底物的誘導(dǎo)和分解代謝物的阻遏的雙重調(diào)節(jié)作用，為提高酶產(chǎn)量，應(yīng)向培養(yǎng)基中添加適量的誘導(dǎo)物，并盡量減少阻遏物的濃度。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基的PH發(fā)酵生產(chǎn)方式固體發(fā)酵液體深層發(fā)酵發(fā)酵條件控制溫度：產(chǎn)酶溫度低于生長(zhǎng)溫度通氣合攪拌pH的控制提高酶的產(chǎn)量添加誘導(dǎo)物：酶的作用底物、酶的反應(yīng)產(chǎn)物、酶的底物類似物降低阻遏物濃度：添加難于利用的碳源；分批加碳源；控制末端產(chǎn)物的濃度表面活性劑添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑第二節(jié)酶的提取和分離技術(shù)酶的提取和分離技術(shù)是指從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開(kāi)，而獲得所需酶的過(guò)程。內(nèi)容包括：細(xì)胞破碎、酶的提取、離心分離、過(guò)濾與膜分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離、濃縮、干燥、結(jié)晶。一、酶提取時(shí)注意的問(wèn)題1.溫度，盡可能在低溫下（0-4度）進(jìn)行。2.PH值，以緩沖液做溶劑，維持酶的穩(wěn)定性和溶解度。3.鹽濃度，鹽溶和鹽析。4.攪拌，避免劇烈攪拌和產(chǎn)生泡沫。5.微生物污染二、細(xì)胞破碎由于除了胞外酶之外，大多數(shù)酶存在細(xì)胞內(nèi)部，為得到細(xì)胞內(nèi)部的酶，首先要收集細(xì)胞、破碎細(xì)胞，讓酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)，然后進(jìn)行酶的提取和分離純化。方法有：1、機(jī)械破碎法2、物理破碎法3、酶促破碎法4、化學(xué)破碎法三、酶的提取酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜芤夯蛉軇┨幚砗冈?，使酶溶解到溶劑中?lái)，實(shí)際上是酶的抽取過(guò)程。方法有：1、酸溶液提取2、堿溶液提取3、鹽溶液提取4、有機(jī)溶劑提取各種方法詳見(jiàn)表5-2。為提高酶的提取效率并防止酶的變性失活，在提取過(guò)程中要注意控制溫度、PH值等提取條件。四、沉淀分離沉淀分離是通過(guò)改變某些條件或添加某些物質(zhì)，使酶的溶解度降低，從溶液中沉淀析出而與其他溶質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。方法有：1、鹽析沉淀法2、等電點(diǎn)沉淀法3、有機(jī)溶劑沉淀法4、復(fù)合沉淀法方法及原理詳見(jiàn)表5-3五、離心分離離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使大小不同、密度不同的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。方法有：1、低速離心(<8000r/min)，離心酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離2、高速離心(1-2.5)*104r/min，主要用于細(xì)胞碎片和細(xì)胞器的分離3、超速離心(2.5-4)*104r/min，主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子及細(xì)胞器等六、過(guò)濾與膜分離過(guò)濾是借助于過(guò)濾介質(zhì)將大小不同、形狀不同的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。方法有：1、粗濾>2μm2、微濾0.2-2μm3、超濾20?-2μm4、反滲透<20?(埃米，光波長(zhǎng)度和分子直徑的常用計(jì)量單位)看表5-4七、層析分離層析分離是利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)）的不同，使各組分以不同比例分配在兩相中（固定相和流動(dòng)相）。方法有：1、吸附層析2、分配層析3、離子交換層析4、凝膠層析5、親和層析6、層析聚焦具體方法看表5-5八、電泳分離方法有：1、紙電泳2、薄層電泳3、薄膜電泳4、凝膠電泳5、自由電泳6、等電聚焦電泳九、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取中的兩相一般為互不相溶的兩個(gè)液相或其他液體。方法有：1、有機(jī)溶劑萃取2、雙水相萃取3、超臨界萃取十、結(jié)晶結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過(guò)程。方法有：1、鹽析結(jié)晶法2、有機(jī)溶劑結(jié)晶法3、透析平衡結(jié)晶法4、等電點(diǎn)結(jié)晶法，原理與沉淀分離的原理類似十一、干燥干燥是將固體、半固體或濃縮液中的水分或其他溶劑除去一部分，以獲得含水分較少的固體物質(zhì)的過(guò)程。酶經(jīng)干燥以后，可以提高酶的穩(wěn)定性、利于產(chǎn)品保存、運(yùn)輸和使用。方法有：1、真空干燥2、冷凍干燥3、噴霧干燥4、氣流干燥5、吸附干燥十二、酶的純度與酶活力酶的純度可用酶的比活力來(lái)衡量，酶的比活力是以每毫克蛋白所具有的酶活力單位來(lái)表示。一般情況下，酶的比活力隨酶純度的提高而提高。五、酶制劑的保存酶的保存條件的選擇必須有利于維護(hù)酶天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，應(yīng)注意： （1）溫度一般在0~4℃。 （2）緩沖液 （3）氧防護(hù) （4）蛋白質(zhì)的濃度與純度第三節(jié)酶分子改造酶分子是具有完整的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。酶的結(jié)構(gòu)決定了酶的性質(zhì)和功能。當(dāng)酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，將引起酶的性質(zhì)和功能的改變。酶分子完整的空間結(jié)構(gòu)給予了酶分子的生物催化功能，使其具有催化高效性、作用專一性和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)。但也其相應(yīng)的弱點(diǎn)。限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因：

1.細(xì)胞外穩(wěn)定性差； 2.偏離最佳PH值時(shí)，酶活性低； 3.具有抗原性。改變酶特性有兩種主要的方法：

1.通過(guò)分子修飾的方法來(lái)改變以分離出來(lái)的天然酶的活性。 2.通過(guò)基因工程方法改變編碼酶分子的基因從而達(dá)到改造酶的目的。一、酶分子修飾酶分子修飾

指通過(guò)主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)酶分子進(jìn)行改造改變酶的一些性質(zhì)：

提高酶活力、改進(jìn)酶的穩(wěn)定性、改變最適PH值或溫度、提高反應(yīng)效率、改變抗原性等。一、酶分子修飾酶分子常見(jiàn)的修飾方法有：1.金屬離子置換修飾；2.大分子結(jié)合修飾；（1）通過(guò)修飾提高酶的活力（2）通過(guò)修飾增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（3）消除酶蛋白的抗原性3.側(cè)鏈基團(tuán)修飾氨基修飾、羧基修飾、酚基修飾等二、生物酶工程主要包括三方面的內(nèi)容： 1.利用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶； 2.修飾酶基因，生產(chǎn)遺傳修飾的酶； 3.設(shè)計(jì)出新酶基因，合成自然界從未有過(guò)的酶。第四節(jié)生物催化劑的固定化一、概念二、酶的固定化方法三、細(xì)胞固定化方法四、固定化酶(細(xì)胞)的性質(zhì)五、固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)一、概念固定化技術(shù)：通過(guò)化學(xué)或物理方法將酶束縛在一定的區(qū)域內(nèi)，將酶固定再進(jìn)行催化的技術(shù)。固定化酶：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化酶的特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復(fù)使用；可連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：

固定化過(guò)程中往往會(huì)引起酶的失活二、酶的固定化方法吸附固定化包埋固定化共價(jià)固定化交聯(lián)固定化微囊固定化熱處理吸附固定化物理吸附固定化法優(yōu)點(diǎn)： 固定化時(shí)酶分子的構(gòu)象很少 或基本不發(fā)生變化。缺點(diǎn)： 結(jié)合力弱，易解吸附。載體： 纖維素、瓊脂糖、活性炭、 沸石及硅膠等包埋固定化定義：將酶或含酶菌體(細(xì)胞)包埋在各種多孔載體，使酶固體化的方法。常用的多孔載體瓊脂糖、瓊脂、海藻酸鈉就、明膠、聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹(shù)脂、聚酰胺、膠囊、脂質(zhì)體、中空纖維包埋方法：凝膠包埋和微囊法包埋法適用于底物和產(chǎn)物都是小分子物質(zhì)酶的固定化共價(jià)固定化定義：選擇適宜的載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定方法根據(jù)化學(xué)鍵的不同可分為兩類離子鍵結(jié)合法共