亞甲基藍(lán)與蛋白質(zhì)分子間的結(jié)合反應(yīng)

亞甲基藍(lán)與蛋白質(zhì)分子間的結(jié)合反應(yīng)

亞甲基藍(lán)的應(yīng)用光譜法是研究生物聚合物與小分子和離子相互作用的重要手段。熒光測試中的發(fā)射峰特征、熒光偏振、能量轉(zhuǎn)移及熒光壽命等指標(biāo)可以對蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)及其所處的微環(huán)境提供有用的信息。在生物體中,蛋白質(zhì)是必不可少的生命物質(zhì),有關(guān)蛋白質(zhì)的各類研究,是目前生命科學(xué)、化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中共同關(guān)注和感興趣的課題。亞甲基藍(lán)(Methyleneblue,MB)是一種具有平面結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)式見圖1)的堿性生物染色劑,在醫(yī)學(xué)臨床診斷及化學(xué)分析中已有較長的應(yīng)用歷史,且可用于亞硝酸鹽、磺氨類、氰化物及一氧化碳等中毒的解毒藥。近年來又發(fā)現(xiàn)MB對DNA具有插入作用,MB可被用于抗癌藥物的體外篩選;此外MB的光化學(xué)性質(zhì)及作用機(jī)理與血卟啉很相似,被認(rèn)為可能成為一種新型光敏劑而用于癌癥的光化學(xué)治療。新近的研究還表明MB在溶液中分子的聚集狀態(tài)與溶劑及介質(zhì)有關(guān)。本文應(yīng)用熒光光譜法研究了人體生理pH值條件下,亞甲基藍(lán)與牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin,BSA)間的相互作用,測定了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及結(jié)合距離,從而由分子水平的角度認(rèn)識蛋白質(zhì)分子與小分子之間相互作用的機(jī)理,為生命科學(xué)研究提供有用的信息和數(shù)據(jù)。[(CΗ3)2ΝΝS+Ν(CΗ3)2]Cl-[(CH3)2NNS+N(CH3)2]Cl?Fig.1MolecularstructureofMB1實驗部分1.1dza-400型分光光度計Hitachi-M850型熒光分光光度計,ShimadzuUV-260型分光光度計。牛血清白蛋白(99%,華美生物工程公司產(chǎn)品),亞甲基藍(lán)、Tris、鹽酸、氯化鈉均為分析純試劑,實驗用水為亞沸蒸餾去離子水。1.2緩沖溶液配制配制0.05mol·L-1的Tris-HCl并含0.10mol·L-1NaCl的緩沖溶液(pH=7.0),恒定體系pH值和離子強(qiáng)度,以此緩沖溶液分別配制MB溶液和BSA貯備液。測定方法:在10mL的容量瓶中,依此加入一定量的BSA,MB溶液,以緩沖溶液稀釋至刻度,混勻后室溫下測定熒光光譜、同步熒光光譜及與蛋白質(zhì)分子比為1∶1的MB吸收光譜,測定中固定BSA的濃度而改變MB濃度。2結(jié)果與討論2.1stern-微織構(gòu)符合動態(tài)符合外加分子與熒光體分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅,并有動態(tài)和靜態(tài)猝滅之分。通過觀察MB對BSA猝滅曲線(圖2)可知,對于MB從低到高整個濃度范圍內(nèi)曲線都呈現(xiàn)出良好的線性,表明室溫下MB對BSA的熒光猝滅為靜態(tài)過程。為進(jìn)一步證實此猝滅特征,把此過程按動態(tài)猝滅處理,即F0/F=1+Κqτ0[Dt]=1+ΚSV[Dt](1)F0/F=1+Kqτ0[Dt]=1+KSV[Dt](1)式(1)稱為Stern-Volmer猝滅方程,Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù),KSV為動態(tài)猝滅常數(shù),τ0為猝滅劑不存在時熒光體分子平均壽命,[Dt]猝滅劑的濃度。而KSV=Kqτ0,Kq=KSV/τ0,由于生物大分子熒光平均壽命約為10-8s,故可由猝滅曲線的斜率求得猝滅常數(shù)。由圖2實驗數(shù)據(jù),按式(1)可以求得MB對BSA猝滅的KSV=2.50×105L·mol-1,Kq=2.50×1013L·(mol·s)-1,而各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010L·(mol·s)-1,顯然MB對BSA熒光的猝滅過程速率常數(shù)遠(yuǎn)大于擴(kuò)散控制的Kq,可見其猝滅過程確為形成化合物所引起的靜態(tài)猝滅,而不是由于動態(tài)碰撞引起的動態(tài)猝滅。2.2熒光發(fā)射譜計算在靜態(tài)猝滅作用中,靜態(tài)猝滅熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系可由熒光體-猝滅劑分子間的結(jié)合常數(shù)表達(dá)式推導(dǎo)求出。設(shè)生物大分子P與藥物D成鍵時有n個等同且獨立的結(jié)合位置,則有下述反應(yīng):Ρ+nD→DnΡ(2)P+nD→DnP(2)其中QnP為生成物,相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)KA為ΚA=[nDnΡ]/[D][nΡ](3)KA=[nDnP]/[D][nP](3)設(shè)生物大分子的總濃度為[Pt],藥物的總濃度為[Dt],則由反應(yīng)(2)的計量關(guān)系可得:[Pt]=[P]+[DnP],[D]=[Dt]-n[DnP]。當(dāng)反應(yīng)體系中僅有生物大分子P為熒光體時,則有F0/F=[Pt]/[P],這里F,F0分別為加入和不加入藥物D時濃度為[Pt]的生物大分子溶液的熒光強(qiáng)度。將這些濃度關(guān)系代入式(3)可得F0/F=ΚA[Qt]F0/(F0-F)-nΚA[Ρt](4)F0/F=KA[Qt]F0/(F0?F)?nKA[Pt](4)固定濃度[Pt]而改變[Dt],按式(4)的線性關(guān)系可以確定KA與n。根據(jù)圖2的MB對BSA熒光發(fā)射譜的猝滅關(guān)系,將343nm處的相對熒光強(qiáng)度實驗數(shù)據(jù)按式(4)以F0/F對[Qt]F0/(F0-F)做一元線性回歸,由回歸系數(shù)可進(jìn)一步求出MB與BSA反應(yīng)時的結(jié)合常數(shù)KA=3.44×105L·mol-1,結(jié)合位點數(shù)n=1.03,相應(yīng)的線性相關(guān)系數(shù)為0.9988。這一結(jié)果表明MB與BSA有較強(qiáng)的結(jié)合作用,且可形成一個結(jié)合位點,并服從獨立等同的位點結(jié)合模型。2.3bsa熒光光譜的重疊積分若小分子化合物與血清白蛋白的結(jié)合為順序結(jié)合,則依據(jù)F?rester非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)制可以求出小分子的結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中產(chǎn)生熒光的殘基間的距離。按F?rester能量轉(zhuǎn)移理論,轉(zhuǎn)移效率E與授體-受體間距離r及臨界能量距離R0相關(guān),E=R60/(R60+r6)(5)E=R60/(R60+r6)(5)這里R0是E=50%時的臨界距離R60=8.8×10-25Κ2Ν4ΦJ(6)R60=8.8×10?25K2N4ΦJ(6)式中,K2為偶極空間取向因子,N為介質(zhì)的折射指數(shù),Φ為授體的光量子效率,J為授體(蛋白質(zhì))熒光發(fā)射光譜與受體(藥物)吸收光譜間的光譜重疊積分,可表示為J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ(7)J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ(7)其中F(λ)為授體在波長λ處的熒光強(qiáng)度,ε(λ)則為受體在波長λ處的摩爾消光系數(shù),能量轉(zhuǎn)移效率E可按下式確定:E=1-F/F0(8)圖3為MB與BSA分子比為1∶1時的吸收光譜及BSA熒光光譜的重疊光譜圖。將圖中光譜重疊部分(300～500nm的波長范圍)分割成極小的矩形面積求和,得重疊積分J=1.27×10-15cm3·(mol·L)-1。BSA有兩個色氨酸殘基,分別位于第134位和212位,而BSA的熒光(λex=280nm,λem=335nm)主要來自于第212位的色氨酸殘基。在上述實驗條件下,取色氨酸殘基量子效率?=0.118,N取水和有機(jī)物的平均值1.366,取向因子取授體-受體各向隨機(jī)分布的平均值2/3,將以上各量代入式(6),求得臨界距離R0=1.72nm,由式(8)及圖2熒光強(qiáng)度(分子比1∶1)得能量轉(zhuǎn)移效率E=0.54,進(jìn)而按式(5)得BSA中第212位色氨酸殘基與MB分子間的距離r=1.67nm。2.4實時熒光光譜固定激發(fā)波長與發(fā)射波長的間距Δλ,同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器即得同步熒光光譜。這種光譜已被用于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的分析,由Δλ=15nm所得的同步熒光只顯示蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的光譜特性,而Δλ=60nm同步熒光僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光。因殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境之極性有關(guān),故由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)