松針對(duì)雛雞免疫功能和血清膽固醇的影響

松針對(duì)雛雞免疫功能和血清膽固醇的影響

高膽固醇是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因。膽固醇主要來(lái)源于動(dòng)物食品，尤其是雞和家禽。雞肉產(chǎn)品在中國(guó)肉類消費(fèi)中占據(jù)第2位,降低雞肉產(chǎn)品中的膽固醇含量,對(duì)維護(hù)人類健康有重要意義。松針(pineneedle)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物的葉(李萍等,2001),別名豬鬃松葉、松毛、山松須,用藥歷史悠久,《本草綱目》記載“松針,氣味苦、溫、無(wú)毒,久服令人不老,輕身益氣,主治風(fēng)濕瘡,生毛發(fā),安五臟,守中,不饑延年”?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),松針富含胡蘿卜素、多種維生素、大量的蛋白質(zhì)及豐富的微量元素(熊春梅等,2010)。松針提取物(原花青素、多糖部位等)還具有降低試驗(yàn)性高脂血癥大鼠血脂的作用(盧劍濤等,2013)。松針粉作為飼料添加劑可明顯提高畜禽生長(zhǎng)速度及抗病力(熊春梅等,2011),但能否降低雞血清膽固醇含量鮮有報(bào)道。鑒于此,本試驗(yàn)將松針粉及松針?biāo)逡鹤鳛轱暳咸砑觿?按一定比例飼喂雛雞,通過(guò)定期測(cè)定免疫雛雞T淋巴細(xì)胞亞群、新城疫抗體效價(jià)水平和血清膽固醇含量的變化,探討松針對(duì)雛雞免疫功能和血清膽固醇的影響,以期為松針在養(yǎng)禽業(yè)中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1基礎(chǔ)日糧及種子種雞場(chǎng)1日齡經(jīng)馬立克疫苗免疫后的羅曼公雞240只購(gòu)自河南省鄭州市瑞祥孵化廠?；A(chǔ)日糧購(gòu)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞場(chǎng)。新支二聯(lián)凍干苗(批號(hào):2011315)和新支二聯(lián)油苗(批號(hào):2011016)均購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司;新城疫檢測(cè)抗原由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。1.2松針的制備手工采摘新鮮的油松(PinustabulaeformisCarr.)松針,將采摘的松針葉攤放在遮陰通風(fēng)的地方,自然干燥,把干燥的部分松針葉用粉碎機(jī)研磨粉碎,用塑料袋密封包裝,避光、通風(fēng)、干燥貯藏待用。1.3術(shù)后實(shí)際日糧將240只健康羅曼公雞隨機(jī)分為4組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20只雞。全部試驗(yàn)雞飼養(yǎng)至14日齡時(shí),用新支二聯(lián)凍干苗(0.2mL/只)滴鼻點(diǎn)眼進(jìn)行首免,28日齡時(shí)用新支二聯(lián)油苗(0.3mL/只)肌肉注射進(jìn)行二免。在首次免疫的同時(shí),對(duì)照組每天3次正常飲水和飼喂基礎(chǔ)日糧;Ⅰ、Ⅱ組分別在基礎(chǔ)日糧中以0.5、1.0g/只劑量的松針粉在每天早晨拌料飼喂并正常飲水,其余2次正常飲水喂料;Ⅲ組按0.5g/只的劑量做煎劑于每天早晨飲水的同時(shí)飲服并飼喂基礎(chǔ)日糧,其余2次正常飲水喂料。飼喂期60d。1.4飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)試驗(yàn)于2012年3月至2012年6月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,全部試驗(yàn)雞采用統(tǒng)一的飼養(yǎng)管理,環(huán)境條件相同。1.5指標(biāo)和方法的測(cè)量1.5.1免疫指標(biāo)1.5.1.facscarlibur型檢測(cè)cd3、cd3、cd3、cd8+t細(xì)胞百分?jǐn)?shù)t于首免后第15、30、45和60天,每組隨機(jī)抽取4只試驗(yàn)雞,每只無(wú)菌心臟采血5mL,3.8%檸檬酸鈉抗凝,分離淋巴細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur型)測(cè)定CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。1.5.1.雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)分別于首免后第7、14、21、28和35天,每組隨機(jī)抽取4只試驗(yàn)雞,每只無(wú)菌心臟采血0.2mL,分離血清,用β-微量法(崔治中等,2008)測(cè)定雞新城疫血凝抑制(HI)抗體效價(jià),結(jié)果以-log2表示(Kong等,2004;Thekisoe等,2004)。1.5.2血清總膽固醇、血脂和高密度脂質(zhì)蛋白于首免后第56天,各組隨機(jī)選取4只試驗(yàn)雞,每只無(wú)菌心臟采血5mL,分離血清,送鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院進(jìn)行血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)含量測(cè)定。1.6兩個(gè)單因子方差分析應(yīng)用SPSS軟件中的One-WayANONA程序進(jìn)行單因子方差分析,用Duncan’s法進(jìn)行多重比較,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果與分析2.1放松對(duì)雞免疫功能的影響2.1.1cd3+cd8-t細(xì)胞變化由表1可知,CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞變化情況:首免后第15天,與對(duì)照組相比,Ⅰ、Ⅱ組顯著升高(P<0.05),且Ⅰ、Ⅱ組間差異顯著(P<0.05),Ⅲ組高于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05);第30天,Ⅲ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05),其他組間差異均不顯著(P>0.05);第45天,對(duì)照組和Ⅲ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05),且對(duì)照組與Ⅲ組、Ⅰ組與Ⅱ組間差異均不顯著(P>0.05);第60天,對(duì)照組和Ⅲ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05),Ⅲ組顯著高于Ⅰ組(P<0.05),其他組間差異均不顯著(P>0.05)。CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞變化情況:首免后第15天,Ⅰ組顯著高于對(duì)照組和Ⅱ組(P<0.05),其他組間差異均不顯著(P>0.05);第30天,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),其中Ⅲ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05),Ⅰ組與Ⅱ組間差異不顯著(P>0.05);第45天,Ⅰ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),其他組間差異均不顯著(P>0.05);第60天,各組間差異均不顯著(P>0.05)。2.1.2和組新城疫抗體效價(jià)比較由表2可知,首免后的第7天,對(duì)照組新城疫抗體效價(jià)顯著高于Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05),其他組間差異均不顯著(P>0.05);第14天,Ⅲ組新城疫抗體效價(jià)顯著高于Ⅰ組(P<0.05),其他組間差異均不顯著(P>0.05);第21和35天,各組間新城疫抗體效價(jià)差異均不顯著(P>0.05);第28天,Ⅱ組新城疫抗體效價(jià)顯著高于對(duì)照組和Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05),其他組間差異均不顯著(P>0.05)。2.2、、組血清中糖代謝及低密度膽固醇水平比較由表3可知,與對(duì)照組相比,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清總膽固醇水平分別降低3.43%、9.66%、9.97%,但差異均不顯著(P>0.05);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清甘油三酯水平較對(duì)照組分別降低56.31%、58.25%、12.62%,其中Ⅰ、Ⅱ組差異顯著(P<0.05),Ⅲ組差異不顯著(P>0.05);Ⅱ、Ⅲ組血清低密度脂蛋白水平較對(duì)照組分別降低7.37%、11.98%,Ⅰ組血清低密度脂蛋白水平較對(duì)照組升高6.91%,但差異均不顯著(P>0.05);Ⅱ組血清高密度脂蛋白水平較對(duì)照組升高19.30%,差異不顯著(P>0.05)。3討論3.1放松對(duì)雞免疫功能的影響3.1.1cd8+分子CD3+幾乎存在于所有成熟T淋巴細(xì)胞表面,是鑒定和區(qū)別T淋巴細(xì)胞的主要表面標(biāo)志,它代表著整個(gè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的狀態(tài)(Ashwood等,2006)。CD4+細(xì)胞是MHCⅡ類抗原限制性細(xì)胞群,一般認(rèn)為其屬于輔助性T細(xì)胞,CD4+的功能主要表現(xiàn)在:(1)作為黏附分子發(fā)揮作用;(2)作為傳遞信號(hào)的分子,促使T細(xì)胞激活(孫慶申等,2002;胡青海等,2005)。CD8+分子表達(dá)在MHCⅠ類限制性T細(xì)胞上,是重要的細(xì)胞毒性T細(xì)胞亞群,主要功能是細(xì)胞免疫。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加0.5、1.0g/只松針粉組或0.5g/只水煎劑組CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分率在15d時(shí)均高于對(duì)照組,且添加0.5g/只松針粉組的T淋巴細(xì)胞百分率在15d時(shí)均顯著高于1.0g/只松針粉組,說(shuō)明松針在一定程度上可促進(jìn)CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖,從而增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫,且以低劑量(0.5g/只)松針粉拌料飼喂效果較好。唐勝球等(2009)、亢娟娟等(2009)試驗(yàn)結(jié)果也表明,松針粉添加劑能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和分化,對(duì)雞的免疫器官指數(shù)有一定促進(jìn)作用。另外,CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分率整體上在首免后30d呈下降趨勢(shì),而黃鵬等(2012)研究糖萜素對(duì)固始雞免疫器官發(fā)育及T淋巴細(xì)胞亞群的影響,結(jié)果表明其各T細(xì)胞值在21d后呈下降趨勢(shì),這與本試驗(yàn)結(jié)果不太一致,可能與機(jī)體內(nèi)免疫器官、淋巴細(xì)胞的形成分化規(guī)律有關(guān),也可能與糖萜素與松針作用機(jī)理不同、試驗(yàn)條件及動(dòng)物不同有關(guān),還有待進(jìn)一步驗(yàn)證及討論。3.1.2松針粉對(duì)雞血清學(xué)抗體水平的影響體液免疫是機(jī)體抗御傳染病的主要因素之一,抗體效價(jià)的高低直接反映機(jī)體的體液免疫狀態(tài)。本試驗(yàn)中,0.5、1.0g/只松針粉組在首免后28d抗體效價(jià)高于對(duì)照組峰值,此時(shí)對(duì)照組抗體效價(jià)已經(jīng)處于下降狀態(tài),到35d時(shí)兩組抗體水平繼續(xù)維持在較高水平,其中1.0g/只劑量的松針粉組比0.5g/只劑量的松針粉組抗體水平更高,在28d時(shí)差異顯著(P<0.05),說(shuō)明松針粉能延長(zhǎng)機(jī)體處于高抗體水平的時(shí)間。陳寶江等(2000)研究結(jié)果表明,雛雞日糧中添加3%松針粉組新城疫抗體水平較對(duì)照組平均增加了24.30%,差異極顯著(P<0.01),且新城疫抗體峰值高,高峰維持時(shí)間為12d,極顯著高于對(duì)照組的3d(P<0.01),這與本試驗(yàn)結(jié)果一致,原因可能是由于松針粉中的VC可羥化分解家禽應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的皮質(zhì)酮,進(jìn)而提高血清新城疫抗體水平(張履忠,2007)。此外,本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),0.5g/只水煎劑組抗體水平峰值僅略高于對(duì)照組,但0.5g/只水煎劑組從首免后7~14d抗體水平上升了2.89倍,而對(duì)照組只上升了1倍,0.5g/只松針粉組和1.0g/只松針粉組上升了2.45和1.88倍,表明松針?biāo)逡耗芸焖偌ぐl(fā)機(jī)體的抗體水平,其抗體產(chǎn)生速度高于各粉劑組,也進(jìn)一步說(shuō)明松針?biāo)逡河锌赡芨跈C(jī)體吸收,進(jìn)而使抗體上升速度更快。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在免疫初期(7~14d),多數(shù)試驗(yàn)組的新城疫抗體水平低于對(duì)照組,可能是由于松針具有抗病毒作用(陳英等,2012),而初次免疫使用的是弱毒疫苗,這與試驗(yàn)中檢測(cè)的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分率在15d時(shí)均高于對(duì)照組結(jié)果相一致,是否因?yàn)檩^高的細(xì)胞免疫水平清除了部分疫苗病毒而導(dǎo)致免疫初期產(chǎn)生的抗體水平低下還有待進(jìn)一步研究。但本研究結(jié)果提示,使用弱毒疫苗初期不應(yīng)同時(shí)飼喂松針粉或水煎液。3.2降低總膽固醇和降低脂酶血清總膽固醇是指血液中所有脂蛋白所含膽固醇之總和,分為低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇。低密度脂蛋白膽固醇通俗地被理解為“壞”膽固醇,因?yàn)榈兔芏戎鞍啄懝檀妓缴邥?huì)增加患冠狀動(dòng)脈心臟病的危險(xiǎn)性(廖曉陽(yáng),2004),而高密度脂蛋白膽固醇通俗地被理解為“好”膽固醇,是脂質(zhì)的清道夫,可將血液中多余的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟,處理分解成膽酸鹽,通過(guò)膽道排泄出去,從而形成一條血脂代謝的專門途徑,也稱“逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑”(姚武位等,2009;陳國(guó)良等,2010)。本試驗(yàn)中,各組總膽固醇和甘油三脂水平均低于對(duì)照組,其中0.5、1.0g/只松針粉組的甘油三酯水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05),1.0g/只松針粉組和0.5g/只水煎劑組的低密度脂蛋白水平低于對(duì)照組,1.0g/只松針粉組的高密度脂蛋白水平高于其他各組,表明松針粉和水煎液均能降低血清總膽固醇和甘油三酯水平,而只有一定劑量的松針粉或水煎液才能降低低密度脂蛋白水平或升高高密度脂蛋白水平,其中以1.0g/只劑量的松針粉每天飼喂效果最好。胡鈞等(1992)研究表明,馬尾松松針?biāo)嵋簩?duì)誘發(fā)的小鼠高脂血癥有顯著降血脂作用,可明顯降低總膽固醇和低密度脂蛋白水平,相對(duì)升高高密度脂蛋白水平;鄭曉珂等(2008)研究表明,松針提取物有降低大鼠總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的作用,這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。此外,本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),水煎液組總膽固醇和低密度脂蛋白下降最多,可能是由于水煎液中松針多糖濃度較大且更易吸收,而多糖可通過(guò)細(xì)胞膜上的多糖受體途徑激活肝臟和腎臟腺細(xì)胞膜上脂蛋白脂酶受體,使脂蛋白脂酶進(jìn)入組織的量發(fā)生變化,間接地降低血中脂蛋白脂酶;或通過(guò)增強(qiáng)膽固醇代謝關(guān)鍵卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的活性使膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯(CE);或通過(guò)提高脂蛋白脂酶的活性催化甘油三酰(TG)水解成甘油和脂肪酸,從而降低血清總膽固醇和甘油三酯。另外,較多的多糖可增加飽腹感而影響食物的攝入、胃的排空,