福建蛋白山核桃病菌的菌種分離與鑒定

福建蛋白山核桃病菌的菌種分離與鑒定

優(yōu)果堅(jiān)果種植是優(yōu)果縣的主要產(chǎn)業(yè)之一，也是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增加收入和富裕的主要形式之一。近年來隨著漾濞核桃種植規(guī)模的擴(kuò)大,其核桃病害有發(fā)展的趨勢。為消除這一潛在危險(xiǎn),對引起漾濞核桃病害的病原菌有所認(rèn)識,進(jìn)而施行有效的防治措施極為重要。本項(xiàng)研究從漾濞核桃感病的枝、葉上分離并鑒定其病原菌,通過室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)篩選出防治效果較強(qiáng)且又經(jīng)濟(jì)安全的藥劑,以期能防治漾濞核桃發(fā)生的病害。1材料和方法1.1pda培養(yǎng)基的制備從漾濞核桃植株新發(fā)生病害的核桃樹枝、樹葉上采集材料,在其病斑處取邊長約5mm的小塊材料4～5塊。先用75%酒精浸5min,再在4%的次氯酸鈉水溶液中浸5min,然后用75%的酒精浸30s進(jìn)行表面消毒,最后用無菌水洗3至5次,放到PDA培養(yǎng)基中,在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)3～4天進(jìn)行觀察。將材料邊緣長出的形態(tài)和顏色不同的細(xì)菌和真菌分別挑到新的PDA培養(yǎng)基上,培養(yǎng)、純化、鑒定。1.2抑菌圈半徑測定本實(shí)驗(yàn)的供試藥劑為金雷、茂生、甲基托布津、農(nóng)用鏈霉素和波爾多液,每種藥品分別稀釋400倍、600倍、800倍、1000倍、1200倍5個(gè)濃度梯度,培養(yǎng)時(shí)間分3個(gè)階段:即48h、72h、96h,不同藥品不同濃度分別在每個(gè)時(shí)段對YB001、YB005、YB009、YB016、YB017五個(gè)菌株進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的抑菌試驗(yàn),分別測定不同藥劑、不同稀釋倍數(shù)及不同時(shí)間段的抑菌圈半徑并取其平均值,以確定不同藥劑的抑菌效果。2藥劑抑菌實(shí)驗(yàn)對漾濞核桃病害的枝、葉共分離得到17個(gè)純培養(yǎng)菌株,其中有4個(gè)菌株被鑒定到屬。并對5個(gè)菌株(其中3株鑒定到屬)做了室內(nèi)藥劑抑菌實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:甲基托布津?qū)B001和YB009抑制效果最強(qiáng),而且稀釋倍數(shù)對抑菌效果影響很小,茂生次之;金雷和茂生在稀釋1000～1200倍時(shí)對YB017抑制效果較好,甲基托布津?qū)B016和YB017基本無抑制效果,農(nóng)用鏈霉素對YB001和YB017抑制效果較明顯,波爾多液各個(gè)濃度對以上5個(gè)菌株均無抑制效果。病原菌鑒定分述如下。2.1抗病性的鑒定(1)黑盤孢科的檢測YB001和YB009被鑒定為擬盤多毛孢屬(Pestalotiotiopsistey)的真菌,其屬半知菌類腔孢綱黑盤孢目黑盤孢科。此兩種真菌菌落呈圓形生長,菌絲白色棉狀突起,有同心圓(圖1),室內(nèi)培養(yǎng)5天后在菌絲上產(chǎn)生黑色粘性小點(diǎn),即分生孢子。分生孢子盤黑色粒點(diǎn)狀,散生,較明顯,初埋于基質(zhì)內(nèi),后外露,分生孢子長菱形,5胞,兩端細(xì)胞近三角形,薄壁,無色;中部細(xì)胞橄欖褐色,大小為18～25μm×5～8μm,分生孢子各細(xì)胞之間均有真隔膜;圓錐形頂部有3根附著絲,基部有小柄(圖2)。(2)分生孢子型YB005被鑒定為單端孢屬(Trichthecium)的真菌,屬半知菌類絲孢綱絲孢目淡色菌科。其菌落呈輻射狀生長,菌絲稀少、無突起。室內(nèi)培養(yǎng)3天后表面產(chǎn)生一層干性粉質(zhì)物質(zhì),即分生孢子。分生孢子梗直立,無屈曲,不分枝,頂生孢子一至多個(gè),分生孢子長圓形或梨形,雙細(xì)胞,無色或淺色,大小14～24μm×7～14μm(圖3)。(3)ybo16的識別分生孢子暗褐色,單孢,不光滑,直徑為25～30μm(圖4)。(4)酵母菌種或稱菌氣YBO18被鑒定為枝孢屬(Cladosporium)的真菌,屬半知菌類絲孢綱叢梗孢目暗色孢科。其分生孢子梗高,暗色直立,頂部附近各種分枝成簇生或單生;分生孢子暗色,具1或2個(gè)橫隔,形狀和大小不一,卵圓形、圓柱形或檸檬狀等(圖5)。2.2藥物的抑制效果(1)各濃度梯度抑菌效果金雷對YB001菌株在400倍48h抑菌圈半徑達(dá)到最大,為0.54cm;隨著稀釋倍數(shù)的增大抑菌圈半徑逐漸變小,1200倍時(shí)抑菌圈半徑最小,為0.22cm,藥效不持久;72h和96h各濃度梯度抑菌效果均為零。金雷對YB005在稀釋400倍、600倍48h抑菌圈半徑分別為0.75cm、0.60cm,其他各濃度和時(shí)間段抑菌圈半徑均為零。金雷對YB009抑制效果較好,400～1200倍5個(gè)濃度在48h的抑菌圈半徑分別為1.28cm、1.26cm、0.89cm、0.85cm、0.55cm,且藥效持久,72h仍有明顯的抑制作用。金雷對YB016的抑制效果與YB001的相似。金雷對YB017的抑制效果與YB009的相似,對應(yīng)的濃度和時(shí)間段內(nèi)比YB009的抑菌圈略小。(2)抑菌圈半徑的影響農(nóng)用鏈霉素對5個(gè)菌株的抑制效果相差較大,對YB001的抑制效果最好,稀釋倍數(shù)從400～1200倍5個(gè)梯度在48h的抑菌圈半徑分別為1.38cm、1.15cm、1.15cm、1.02cm、0.54cm,72h仍有明顯效果。對YB017的抑制效果與YB001的相似,但抑菌圈半徑都小于對應(yīng)濃度和時(shí)間段的半徑。對其他菌株抑制效果較小,多數(shù)無抑制效果。(3)抑菌半徑的測定茂生對本試驗(yàn)的5個(gè)菌株在稀釋倍數(shù)較大和較長時(shí)間段內(nèi)都有較強(qiáng)的抑制效果,如對YB016在96h從400～1200倍不同稀釋倍數(shù)時(shí)的抑菌半徑分別為1.48cm、1.14cm、1.13cm、0.91cm、0.66cm,48h和72h的抑菌半徑略大于對應(yīng)各數(shù)字。對其他各菌株抑制效果與YB016的很相似,其抑菌半徑略小于YB016的。(4)抑菌圈半徑對yb010菌株抑菌效果的影響甲基托布津?qū)B001和YB009的抑制效果最強(qiáng),如400～1200各稀釋倍數(shù)在48h的抑菌圈半徑分別為1.86cm、1.44cm、1.49cm、1.50cm、1.45cm,72h和96h抑菌圈半徑略微減小,對YB009菌株與YB001的抑制效果相似、略小。對YB016和YB017菌株沒有任何抑制作用。3不同藥劑的抑菌效果(1)擬盤多毛孢屬和枝孢屬真菌能使多種植物致病,多例植物病害中已報(bào)道過,但是在核桃病害中發(fā)現(xiàn)擬盤多毛孢屬真菌尚屬首次。(Pestalotiotiopsistey)真菌有性世代,故其的發(fā)現(xiàn)可能跟采集時(shí)間有關(guān)。YBOO5為單端孢屬的真菌,據(jù)資料顯示該菌是有益真菌。有的種是樹棲真菌,有利于植物的物質(zhì)循環(huán),有的種食線蟲,對植物起到保護(hù)作用。(2)由于真菌的鑒定大部分根據(jù)孢子的形態(tài)、大小、顏色等作出。本實(shí)驗(yàn)雖然分離到17種菌株,但其中大多數(shù)在正常培養(yǎng)條件下不產(chǎn)孢,因此無法鑒定。盡管我們在室內(nèi)培養(yǎng)菌種時(shí)采用了降低營養(yǎng)、變溫、光照等措施促使其產(chǎn)孢,但結(jié)果均不能產(chǎn)孢,培養(yǎng)條件有待于進(jìn)一步的改進(jìn)。(3)在作不同藥劑的抑菌試驗(yàn)中,參試的金雷、茂生、甲基托布津、農(nóng)用鏈霉素4種藥劑一般稀釋400倍液時(shí)抑菌效果最好,但在進(jìn)行漾濞核桃病害的實(shí)際防治時(shí),為做到既經(jīng)濟(jì)又安全,并考慮到高濃度農(nóng)藥的危害和殘留問題等綜合因素,一般采用600～1000倍稀釋液,其抑菌效果也好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲基