第1章 發(fā)酵工程（答案版） 【清單挖空】 高考生物 核心知識(shí)必背

第一章發(fā)酵工程第1節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用發(fā)酵工程：是指利用微生物的特定功能，通過(guò)現(xiàn)代工程技術(shù)，規(guī)?；a(chǎn)對(duì)人類有用的產(chǎn)品，它涉及菌種的選育和培養(yǎng)、產(chǎn)物的分離和提純等方面。一、發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)1．發(fā)酵的歷史：約9000年前，我們的祖先就會(huì)利用微生物將谷物、水果等發(fā)酵成含酒精的飲料。2.1857年，法國(guó)微生物學(xué)家巴斯德通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，酒精發(fā)酵是由活的酵母菌引起的。3.由于不同的微生物具有產(chǎn)生不同代謝物的能力，因此利用不同微生物，通過(guò)發(fā)酵就可以生產(chǎn)出人們所需要的多種產(chǎn)物。（1）發(fā)酵的概念：人們利用微生物，在適宜的條件下，將原料通過(guò)微生物的代謝轉(zhuǎn)化為人類所需要的產(chǎn)物的過(guò)程。（2）發(fā)酵類型好氧發(fā)酵：醋酸發(fā)酵厭氧發(fā)酵：酒精發(fā)酵、乳酸發(fā)酵4.發(fā)酵原理：不同的微生物具有產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物的能力，因此利用它們既可以生產(chǎn)出人們所需要的多種產(chǎn)物。5.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發(fā)酵保存下來(lái)的發(fā)酵物中的微生物進(jìn)行發(fā)酵、制作食品的技術(shù)一般稱為傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)。6.腐乳的制作(1)參與的微生物：多種微生物參與了豆腐的發(fā)酵，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。(2)腐乳的特點(diǎn)：經(jīng)過(guò)微生物的發(fā)酵，豆腐中的蛋白質(zhì)被分解成小分子的肽和氨基酸，味道鮮美，易于消化吸收，便于保存。7.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)(1)概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發(fā)酵保存下來(lái)的面團(tuán)、鹵汁等發(fā)酵物中的微生物進(jìn)行發(fā)酵、制作食品的技術(shù)。(2)特點(diǎn):：傳統(tǒng)發(fā)酵以混合菌種的固體發(fā)酵及半固體發(fā)酵為主，通常是家庭式或作坊式的。(3)發(fā)酵產(chǎn)品：利用傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)制作的食品有腐乳、醬、醬油、醋、泡菜和豆豉等，它們是我國(guó)傳統(tǒng)飲食文化的重要組成部分。8.使用酵母制作饅頭屬于傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)嗎？不屬于，使用前一次發(fā)酵保存下來(lái)的面團(tuán)進(jìn)行的才算；例如直接利用空氣中毛霉孢子制作腐乳屬于傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)，若直接接種毛霉，則不屬于。二、嘗試制作傳統(tǒng)發(fā)酵食品1.相關(guān)菌種（1）乳酸菌①分布及常見菌種：乳酸菌種類很多，在自然界中分布廣泛。常見的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。②代謝及反應(yīng)式：乳酸菌是厭氧（需氧、厭氧、兼性厭氧）細(xì)菌，在無(wú)氧的情況下能將葡萄糖分解成乳酸，反應(yīng)簡(jiǎn)式為：C6H12O6eq\o(→,\s\up7(酶))2C3H6O3（乳酸）＋能量。③生產(chǎn)應(yīng)用可用于_乳制品的發(fā)酵_、_泡菜的腌制_等④分布_空氣_、_土壤_、植物體表_、_人或動(dòng)物的腸道內(nèi)_（2）酵母菌①分布：酵母菌是一類單細(xì)胞真菌，在一些含糖量較高的水果、蔬菜表面經(jīng)?？梢园l(fā)現(xiàn)酵母菌的存在。②代謝及反應(yīng)式：酵母菌能以多種糖類作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量的來(lái)源，酵母菌是兼性厭氧微生物,在有氧條件下，酵母菌進(jìn)行有氧呼吸，大量繁殖，反應(yīng)式為：C6H12O6＋6O2＋6H2Oeq\o(→,\s\up7(酶))6CO2＋12H2O＋能量；在無(wú)氧條件下，酵母菌能進(jìn)行酒精發(fā)酵，反應(yīng)式為：C6H12O6eq\o(→,\s\up7(酶))2C2H5OH（酒精）＋2CO2＋能量。③應(yīng)用及影響因素：酵母菌可用于釀酒、制作饅頭和面包等。溫度是影響酵母菌生長(zhǎng)的重要因素，釀酒酵母的最適生長(zhǎng)溫度約為28℃。（3）醋酸菌①代謝及反應(yīng)式：醋酸菌是好氧細(xì)菌，當(dāng)氧氣、糖源都充足時(shí)能將糖分解成醋酸，反應(yīng)式為：C6H12O6＋2O2eq\o(→,\s\up7(酶))2CH3COOH（醋酸）＋2H2O＋2CO2＋能量；當(dāng)缺少糖源時(shí)則將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，再將乙醛變?yōu)榇姿?，反?yīng)式為：C2H5OH＋O2eq\o(→,\s\up7(酶))CH3COOH（醋酸）＋H2O＋能量。②應(yīng)用及影響因素：醋酸菌可用于制作各種風(fēng)味的醋。多數(shù)醋酸菌的最適生長(zhǎng)溫度為30～35℃。三、探究.實(shí)踐一：泡菜的制作1.制作泡菜菌種的來(lái)源:制作傳統(tǒng)泡菜是利用植物體表面天然的乳酸菌來(lái)進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵期間，乳酸會(huì)不斷積累，當(dāng)它的質(zhì)量百分比為0.4%-0.8%時(shí)，泡菜的口味、品質(zhì)最佳。（2）制作泡菜發(fā)酵條件:適宜的溫度、嚴(yán)格控制厭氧條件。（3）制作泡菜方法步驟:配制鹽水→蔬菜裝壇→加鹽水→封壇發(fā)酵①配制鹽水:用清水和食鹽配制質(zhì)量百分比為5%-20%的鹽水,并將鹽水煮沸,冷卻待用。②蔬菜裝壇:將新鮮蔬菜洗凈,切成塊狀或條狀,混合均勻,晾干后裝壇,裝至半壇時(shí),放入蒜瓣、生姜、及ITA香辛料,繼續(xù)裝至八成滿。③加鹽水:將冷卻好的鹽水緩緩倒入壇中,使鹽水沒過(guò)全部菜料。④封壇發(fā)酵:蓋好壇蓋,向壇蓋邊沿的水槽中注滿水,發(fā)酵過(guò)程中注意補(bǔ)充水,根據(jù)室內(nèi)溫度控制發(fā)酵時(shí)間。2.制作泡菜實(shí)驗(yàn)分析（1）鹽的相關(guān)分析①鹽的作用：調(diào)味，抑制其他微生物生長(zhǎng)及調(diào)味。②鹽水濃度為質(zhì)量百分比為5%-20%。③鹽水濃度要適宜的原因：鹽水濃度太高會(huì)引起乳酸菌細(xì)胞滲透失水，影響乳酸菌生長(zhǎng)繁殖，甚至導(dǎo)致乳酸菌死亡；過(guò)低，雜菌易繁殖，導(dǎo)致泡菜變質(zhì)。④鹽水煮沸的目的：殺菌，去除水中的溶解氧。⑤鹽水冷卻后使用的目的：為了不影響乳酸菌的生命活動(dòng)（為了保證乳酸菌等微生物的生命活動(dòng)不受影響）。（2）相關(guān)氣密性的分析①泡菜壇子使用之前要檢查密封性的目的：給泡菜壇內(nèi)創(chuàng)造無(wú)氧環(huán)境，嚴(yán)格控制厭氧條件，利于乳酸菌發(fā)酵。②用水密封泡菜壇的目的：給泡菜壇內(nèi)創(chuàng)造無(wú)氧環(huán)境，嚴(yán)格控制厭氧條件。③泡菜壇應(yīng)裝至八成滿？為什么？防止由于產(chǎn)生CO2而導(dǎo)致發(fā)酵液溢出壇外（初期大腸桿菌、酵母菌會(huì)產(chǎn)生）防止因裝太滿使鹽水未完全淹沒菜料而導(dǎo)致菜料變質(zhì)腐爛。（3）在冷卻后的鹽水中可加入少量“陳菜泡液”，目的是增加乳酸菌數(shù)量，縮短泡菜制作時(shí)間。（4）泡菜制作過(guò)程中，是否只有乳酸菌起作用？不是，還有一些酵母菌和大腸桿菌。（5）蔬菜應(yīng)新鮮的原因：若不新鮮，蔬菜中的亞硝酸鹽含量會(huì)升高。（6）為什么含有抗生素的牛奶不易發(fā)酵為酸奶？牛奶發(fā)酵為酸奶主要依靠乳酸菌的作用，而抗生素能夠殺死或抑制乳酸菌。（7）泡菜壇的發(fā)酵液表面會(huì)長(zhǎng)出一層白膜，這層白膜是乳酸菌嗎？不是，是酵母菌繁殖形成的，因?yàn)楸砻嫜鯕夂控S富，不適于乳酸菌生長(zhǎng)。（8）制作泡菜過(guò)程中，保證壇內(nèi)乳酸菌發(fā)酵所需無(wú)氧環(huán)境的操作是：裝壇時(shí)鹽水沒過(guò)全部菜料，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水，并在發(fā)酵過(guò)程中注意經(jīng)常向水槽中補(bǔ)充水。四、探究.實(shí)踐二：制作果酒和果醋（一）制作果酒：1.參與發(fā)酵的主要微生物及來(lái)源：_新鮮水果的果皮表面附著的野生酵母菌；2.發(fā)酵原理①許多_新鮮水果的果皮表面__附著有大量的不同種類的__野生酵母菌_；②在這些酵母菌的作用下，水果可以發(fā)酵成果酒（通過(guò)有氧呼吸大量繁殖，通過(guò)無(wú)氧呼吸產(chǎn)酒精）；③相關(guān)反應(yīng)式3.發(fā)酵條件：①溫度：將溫度控制在_18-30℃_進(jìn)行發(fā)酵；②氧氣含量：氧氣充足的情況下，_大量繁殖_；無(wú)氧條件下，進(jìn)行_酒精發(fā)酵_；4.制作流程:將發(fā)酵瓶、榨汁機(jī)等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒，晾干備用將發(fā)酵瓶、榨汁機(jī)等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒，晾干備用器具消毒取新鮮葡萄，用清水沖洗1-2取新鮮葡萄，用清水沖洗1-2次，再去除枝梗和腐爛的籽粒，瀝干沖洗葡萄榨汁裝瓶用榨汁機(jī)榨取葡萄汁，將葡萄汁裝入發(fā)酵瓶（注意：榨汁裝瓶用榨汁機(jī)榨取葡萄汁，將葡萄汁裝入發(fā)酵瓶（注意：要留有大約1/3的空間），蓋好瓶蓋將溫度控制在18-30℃將溫度控制在18-30℃進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中，每隔12h左右將瓶蓋擰松一點(diǎn)（注意：不是打開瓶蓋），此后再擰緊瓶蓋。發(fā)酵時(shí)間為10-12d.酒精發(fā)酵酒精發(fā)酵可通過(guò)可通過(guò)從發(fā)酵瓶口取樣來(lái)對(duì)發(fā)酵的情況進(jìn)行檢測(cè)果酒檢測(cè)果酒檢測(cè)（二）制作果醋：參與發(fā)酵的主要微生物及來(lái)源：_空氣中的醋酸菌或人工接種的醋酸菌_；制作果醋所利用的菌種屬于原核生物，與釀造果酒所需菌種相比較，該菌種在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的主要特點(diǎn)是沒有以核膜為界限的細(xì)胞核(沒有成形的細(xì)胞核)。發(fā)酵原理①在_有氧_的條件下，果酒經(jīng)醋酸菌的作用可以進(jìn)一步發(fā)酵成果醋；②當(dāng)糖源充足時(shí)，醋酸菌還可以直接將糖分解為醋酸；③相關(guān)反應(yīng)式發(fā)酵條件：①溫度：發(fā)酵溫度為_30-35℃_；②氧氣含量：氧氣供應(yīng)_充足_果酒制作制作流程（以乙醇為底物的類型為例）果酒制作打開瓶蓋，蓋上紗布當(dāng)葡萄酒制作完成后，打開瓶蓋，蓋上紗布當(dāng)葡萄酒制作完成后，打開瓶蓋，蓋上一層紗布，進(jìn)行葡萄醋的發(fā)酵。發(fā)酵溫度為30-35℃，時(shí)間為7-8d。果醋檢測(cè)果醋檢測(cè)5.制作果酒實(shí)驗(yàn)分析:(1)用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精給發(fā)酵瓶、榨汁機(jī)消毒。(2)沖洗葡萄的目的：去除表面灰塵、污物。(3)沖洗1-2次即可，能否連續(xù)沖洗？為什么？不能，防止果皮表面的野生菌種數(shù)量減少。(4)去梗之前沖洗還是去梗之后沖洗？之前。為什么？避免葡萄破損，減少被雜菌污染的機(jī)會(huì)。(5)葡萄汁裝入發(fā)酵瓶時(shí)，能裝滿嗎？不能，要留約1/3的空間。為什么？a.先讓酵母菌進(jìn)行有氧呼吸，快速繁殖，耗盡O2后，再進(jìn)行酒精發(fā)酵；b.防止發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CO2造成發(fā)酵液溢出。(6)每隔12h左右將瓶蓋擰松一點(diǎn)這樣做的目的是的目的：排出氣體（CO2）。但又不打開，此后再擰緊目的是防止氧氣和有害雜菌進(jìn)入。(8)果酒制作過(guò)程中，在不滅菌的情況下，酵母菌是如何成為優(yōu)勢(shì)菌種的？發(fā)酵后期在缺氧和酸性發(fā)酵液中，絕大多數(shù)微生物的生命活動(dòng)受到抑制，而酵母菌可以適應(yīng)這一環(huán)境成為優(yōu)勢(shì)菌種。(9)在制作果酒過(guò)程中，除了酵母菌，是否還有其他微生物生長(zhǎng)？它們會(huì)對(duì)果酒發(fā)酵產(chǎn)生影響嗎？如果有，如何避免這種影響？還有一些乳酸菌和醋酸菌；乳酸菌能將糖分解為甘油、酒石酸等，從而使果酒變質(zhì)，而在有氧的情況下，醋酸菌能把糖分解成醋酸或者把乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛進(jìn)而轉(zhuǎn)化為醋酸?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵的溫度、pH等來(lái)控制乳酸菌含量；可以通過(guò)減少O2含量、調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度、pH來(lái)控制醋酸菌含量。（10）如何檢測(cè)果酒的發(fā)酵情況:聞、品嘗、用酸性重鉻酸鉀溶液檢測(cè)（橙色→灰綠色）。（11）葡萄酒呈現(xiàn)深紅色的原因：在發(fā)酵過(guò)程中，紅葡萄皮的色素進(jìn)入發(fā)酵液中，使葡萄酒呈現(xiàn)深紅色。（12）果酒制作中，酒精含量達(dá)一定程度后不變，CO2也不產(chǎn)生，原因可能是原料耗盡或高濃度的酒精抑制了酵母菌細(xì)胞呼吸。6.制作果醋的實(shí)驗(yàn)分析（1）在制作果醋的過(guò)程中，酵母菌是否還會(huì)繼續(xù)發(fā)酵？隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液的pH、發(fā)酵溫度等均不利于酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，因此酵母菌活性很低，不會(huì)繼續(xù)發(fā)酵。（2）醋酸菌從何而來(lái)？打開瓶蓋后，空氣中的醋酸菌會(huì)進(jìn)入果酒發(fā)酵液中大量繁殖，其他的菌因不適應(yīng)環(huán)境條件（不能利用乙醇）而不能繁殖。（3）采用什么措施可以加快果醋的制作？在工業(yè)上，后期醋的發(fā)酵需要人工接種醋酸菌；或者買一瓶醋，將其打開暴露于空氣中，一段時(shí)間后在醋的表面會(huì)有一層薄膜（即醋酸菌膜），用這層薄膜進(jìn)行接種亦可。（4）在果酒和果醋制作中，哪些做法可防止發(fā)酵液被污染？a.發(fā)酵瓶、榨汁機(jī)等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒，晾干備用；b.處理葡萄時(shí)應(yīng)先沖洗再去除枝梗；c.排氣時(shí)只需擰松瓶蓋，不要打開瓶蓋。（6）如何檢測(cè)果醋的發(fā)酵情況？聞、品嘗、使用pH試紙檢測(cè)檢測(cè)和比較發(fā)酵前后的pH值、觀察醋酸菌膜是否形成。第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章中提及的微生物主要指用于發(fā)酵的細(xì)菌和真菌。一、微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)1.防止雜菌污染，獲得純凈的微生物培養(yǎng)物是研究和應(yīng)用微生物的前提（即發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)）。2.在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物：一方面：為微生物提供合適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件（培養(yǎng)基）。另一方面：要確保其他微生物無(wú)法混入，并將需要的微生物分離出來(lái)（無(wú)菌技術(shù)）。（一）培養(yǎng)基的配制1．培養(yǎng)基概念：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。2.培養(yǎng)基作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。3．培養(yǎng)基的分類（按照物理性質(zhì)分類）（1）液體培養(yǎng)基：不含凝固劑（如瓊脂），呈液體狀態(tài)。用途：擴(kuò)大培養(yǎng)獲得大量菌種、常用于工業(yè)生產(chǎn)。目的是增加目的菌的數(shù)量。（2）固體培養(yǎng)基：含凝固劑（如瓊脂），呈固體狀態(tài)。用途：分離、計(jì)數(shù)、鑒定等。培養(yǎng)基的基本成分：成份：各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及O2的需求。如培養(yǎng)乳酸菌時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌(真菌)時(shí)需將培養(yǎng)基調(diào)至酸性，培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)需將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性，培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)則需要提供無(wú)氧的條件。（2）微生物培養(yǎng)基需要氮源，這是因?yàn)椋旱厥俏⑸锖铣傻鞍踪|(zhì)、核酸等物質(zhì)所必需的。下表是某微生物培養(yǎng)基的成分，該培養(yǎng)基可用來(lái)培養(yǎng)自養(yǎng)（自養(yǎng)、異養(yǎng)）型微生物。若除去①，此培養(yǎng)基不能（能、不能）培養(yǎng)圓褐固氮菌，原因是：圓褐固氮菌雖可以固氮，但其同化作用類型為異養(yǎng)型，培養(yǎng)基中必須提供含碳有機(jī)物，所以該培養(yǎng)基不能用來(lái)培養(yǎng)圓褐固氮菌。編號(hào)①②③④⑤成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量/g0.44.00.50.5100mL4.如何將液體培養(yǎng)基制成固體培養(yǎng)基？加入適量瓊脂。6.實(shí)驗(yàn)室中最常用的培養(yǎng)基之一：瓊脂固體培養(yǎng)基。7.微生物在瓊脂固體培養(yǎng)基的表面或內(nèi)部生長(zhǎng)，可以形成菌落。9.牛肉膏和蛋白胨來(lái)源于動(dòng)物原料，含有糖、維生素和有機(jī)氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，蛋白胨提供的主要營(yíng)養(yǎng)為氮源、維生素。牛肉膏提供的主要營(yíng)養(yǎng)為碳源、磷酸鹽、維生素。10.含C、H、O、N的有機(jī)物可作為異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源。11.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物培養(yǎng)基的主要差別在于碳源。12.能否根據(jù)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類型？理由？可以，例如自養(yǎng)型微生物所需的碳源來(lái)自無(wú)機(jī)碳源，異養(yǎng)型微生物所需的碳源來(lái)自有機(jī)碳源。12.無(wú)機(jī)氮源能給自養(yǎng)型微生物提供能源嗎？理由？可以，例如NH3既作為硝化細(xì)菌的氮源，也作為能源（NH3氧化釋放的化學(xué)能）。13.無(wú)機(jī)鹽除了可以調(diào)節(jié)酸堿平衡、維持一定的滲透壓之外，還能有什么功能？有些無(wú)機(jī)鹽離子可以作為化能合成菌的能源（如鐵細(xì)菌）。有些無(wú)機(jī)鹽離子可以激活某些酶（如Mg2+激活DNA聚合酶）14.是否所有培養(yǎng)基中都必須添加碳源、氮源？不是，例如分離固氮菌不需要額外添加氮源，其可以直接利用空氣中的氮?dú)?。二、無(wú)菌技術(shù)1．獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵：防止雜菌污染。無(wú)菌技術(shù)應(yīng)圍繞如何避免雜菌的污染展開。無(wú)菌技術(shù)主要包括消毒和滅菌。2.無(wú)菌技術(shù)（消毒和滅菌）工作主要包括兩個(gè)方面：(1)對(duì)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒。(2)對(duì)用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。3.做好消毒滅菌工作后，要注意：實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。4.為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，應(yīng)如何操作？在超凈工作臺(tái)并在酒精燈火焰附近進(jìn)行。5.無(wú)菌技術(shù)除用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者被微生物感染。為達(dá)到后一目的，操作者在實(shí)驗(yàn)室中不可吃東西、喝水，離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)一定要洗手。另外，為避免污染環(huán)境，我們對(duì)使用后的培養(yǎng)基丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理。6.消毒:(1)概念：是指使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。(2)方法:煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學(xué)藥物。a.日常生活中經(jīng)常用到煮沸消毒法，操作方法：100℃煮沸5～6min；b.對(duì)于一些不耐高溫的液體如牛奶，可使用巴氏消毒法，操作方法：62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s-1min；c.生物活體、水源等還可使用化學(xué)藥物進(jìn)行消毒，操作方法：用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等；d.接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)在使用前，可以用紫外線照射，操作方法：紫外線照射30min。7.滅菌:（1）概念：是指使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。（2）方法:濕熱滅菌法、干熱滅菌法、灼燒滅菌。a.培養(yǎng)基等一般用濕熱滅菌法，濕熱滅菌是一種利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進(jìn)行滅菌的方法，其中高壓蒸汽滅菌的效果最好，操作方法：高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100kPa，溫度121℃,15～30min。b.耐高溫的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)、金屬用具等，可以用干熱滅菌法，操作方法：物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h。c.接種過(guò)程中，微生物的涂布器、接種環(huán)、接種針或其他金屬用具、試管口、瓶口通過(guò)灼燒滅菌法來(lái)滅菌，操作方法：直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒。9.酒精消毒的最適范圍是體積分?jǐn)?shù)為70%-75%的酒精。原因：酒精濃度過(guò)高時(shí)，菌體表面蛋白質(zhì)變性過(guò)快，從而凝固形成一層保護(hù)膜，乙醇分子不能滲入其中，酒精濃度過(guò)低時(shí)，殺菌能力減弱。11.用紫外線進(jìn)行消毒時(shí)，可以怎么做來(lái)加強(qiáng)消毒效果？照射前，適當(dāng)噴灑酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。12.灼燒滅菌是將需滅菌的用具直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，優(yōu)點(diǎn)是可以迅速?gòu)氐椎販缇?3.培養(yǎng)基的滅菌方法高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌法）；培養(yǎng)皿的滅菌方法干熱滅菌（也可用濕熱滅菌法）。14.下圖表示對(duì)接種環(huán)的灼燒滅菌，其正確的操作順序應(yīng)是②①③。（P11“教材圖”）三、微生物的純培養(yǎng)1．純培養(yǎng)概念：在微生物學(xué)中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養(yǎng)物。2.純培養(yǎng)物概念：由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過(guò)程就是純培養(yǎng)。單菌落一般是由單個(gè)微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。3.微生物純培養(yǎng)的步驟：微生物的純培養(yǎng)包括配制培養(yǎng)基、滅菌、接種、分離和培養(yǎng)等步驟。5.微生物純培養(yǎng)的原理：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法將單個(gè)微生物分散。6.在固體培養(yǎng)基上，之后得到的單菌落一般是由單個(gè)微生物形成的純培養(yǎng)物。四、酵母菌的純培養(yǎng)（以酵母菌的純培養(yǎng)為例）1.酵母菌的純培養(yǎng):用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌。菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。一個(gè)單菌落即一個(gè)種群。菌落通?？梢杂脕?lái)作為鑒定菌種的重要依據(jù)。獲得單菌落的方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法。2.酵母菌的純培養(yǎng):制備培養(yǎng)基、接種和分離酵母菌、培養(yǎng)酵母菌。(1)制備培養(yǎng)基：制備馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基的正確順序?yàn)椋号渲婆囵B(yǎng)基→滅菌→倒平板（用文字、“→”表示）。(2)接種和分離酵母菌：通過(guò)接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)過(guò)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落。(3)培養(yǎng)酵母菌：完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板（一般做三組，目的：平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)）和一個(gè)未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。制備培養(yǎng)基的步驟：①配制培養(yǎng)基：稱取去皮的馬鈴薯200g,切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過(guò)濾。向?yàn)V液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15-20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml。②滅菌：將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。在滅菌前,用牛皮紙、舊報(bào)紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是滅菌時(shí)能避免水蒸汽凝結(jié)時(shí)浸濕棉塞；取出培養(yǎng)基錐形瓶時(shí)也能起到隔絕空氣中雜菌污染的作用。③倒平板：使培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。3.制備培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（1）培養(yǎng)基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時(shí)開始倒平板？瓊脂是一種多糖，在44℃以下凝固，倒平板時(shí)，溫度過(guò)高，太燙，不易操作；若低于50℃不及時(shí)操作，瓊脂會(huì)凝固。（2）為什么倒平板和接種整個(gè)過(guò)程要在酒精燈火焰旁進(jìn)行？因?yàn)榫凭珶艋鹧娓浇嬖谥鵁o(wú)菌區(qū)域,避免避免周圍環(huán)境中微生物的污染。拔掉瓶塞后為什么要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。（3）在倒平板的過(guò)程中，若不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？不能。為什么？因?yàn)榭諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。（4）倒平板時(shí)，能將培養(yǎng)皿的皿蓋拿下來(lái)放在一邊嗎？不能。應(yīng)如何做？用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙。為什么？防止雜菌污染培養(yǎng)基。（5）剛倒完平板，可以直接倒置嗎？不能，應(yīng)等培養(yǎng)基冷卻凝固。（6）培養(yǎng)基冷凝后，為什么要將培養(yǎng)皿倒過(guò)來(lái)放置（倒置）？既可防止皿蓋上冷凝的水滴滴人培養(yǎng)基造成污染;又可避免培養(yǎng)基表面的水分過(guò)快蒸發(fā)。（4）接種和分離酵母菌驗(yàn)注意事項(xiàng)①微生物接種中的平板劃線法接種是指通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單個(gè)菌落。②連續(xù)劃線的目的：將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，經(jīng)過(guò)數(shù)次劃線后培養(yǎng)可以分離得到單菌落。③平板劃線法過(guò)程中，接種環(huán)蘸了1次菌液；若分五個(gè)區(qū)劃線，則接種環(huán)共需灼燒6次；灼燒次數(shù)＝劃線次數(shù)＋1。⑤灼燒后的接種環(huán)可以直接劃線嗎？不可以。應(yīng)如何操作？待接種環(huán)冷卻后再劃線。目的？避免溫度過(guò)高殺死菌種。⑥從第二次劃線開始，都應(yīng)從上一次劃線的末端開始往下一區(qū)域劃線。⑦整個(gè)操作中灼燒接種環(huán)的不同目的：第一次灼燒（取菌種前）：殺死接種環(huán)上原有微生物，避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染菌種。以后每次劃線前灼燒：殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上一次劃線的末端。劃線結(jié)束灼燒：及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免菌種污染環(huán)境和感染操作者。⑧除第一次劃線外，每次劃線都從上一次劃線的末端開始，目的是什么？將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面，經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落（使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落）。⑨為什么劃線時(shí)要注意不能劃破培養(yǎng)基？a.一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；b.存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。=10\*GB3⑩用平板劃線法接種劃線某個(gè)平板培養(yǎng)后，第一區(qū)域的劃線上都不間斷地長(zhǎng)滿了菌，第二劃線區(qū)域所劃的第一條線上無(wú)菌落，其他環(huán)線有菌落。造成劃線無(wú)菌落的原因：a.接種環(huán)未冷卻。b.劃線未從第一區(qū)域末端開始劃線（第二區(qū)域的第一條線未接到第一區(qū)域末端）。7.如何確定所倒平板未被雜菌（主要是細(xì)菌）污染？將未接種的空白培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底(該操作也可確定培養(yǎng)基滅菌是否徹底）。8.未接種的培養(yǎng)基直接培養(yǎng)起什么作用？做空白對(duì)照，判斷培養(yǎng)基是否被污染，判斷培養(yǎng)基滅菌是否徹底；若培養(yǎng)后培養(yǎng)基表面無(wú)菌落，則說(shuō)明培養(yǎng)基沒有污染。9.若未接種的培養(yǎng)基表面出現(xiàn)菌落，說(shuō)明了什么？說(shuō)明培養(yǎng)基被污染，實(shí)驗(yàn)組的菌落中可能存在雜菌。10.注意：（1）在實(shí)驗(yàn)室中，切不可飲食，離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)一定要洗手，以防止被微生物感染；（2）使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。11.下圖①～⑥為平板劃線法接種圖示，①操作是將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)的金屬絲燒紅。②操作是在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開盛有菌液的試管的棉塞。③操作是將試管口通過(guò)火焰。④操作是在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液。⑤操作是將試管口通過(guò)火焰，并塞上棉塞。⑥操作是：在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，用接種環(huán)在培養(yǎng)基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。然后再灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線即可得到圖⑦培養(yǎng)皿。在重復(fù)劃線時(shí)，注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。二、微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)（一）選擇培養(yǎng)基1.實(shí)驗(yàn)室篩選原理：人為提供有利于目的菌生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度和pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)。2.實(shí)例：水生棲熱菌能在70～80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。據(jù)此，科學(xué)家從美國(guó)黃石國(guó)家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌,進(jìn)而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于體外擴(kuò)增DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。3.選擇培養(yǎng)基定義：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。4.尋找耐高溫DNA聚合酶的思路是什么？根據(jù)微生物對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。5.從環(huán)境中獲得某種特定種類的微生物的原理：某些微生物適應(yīng)某些特定的環(huán)境條件，而絕大多數(shù)微生物在這種條件下不能生存，就可以從特定的環(huán)境中篩選得到特定種類的微生物。（1）在被石油污染的土壤中可以篩選石油分解微生物。（2）在冰川凍土層可以篩選耐寒微生物。（3）漆酶屬于木質(zhì)降解酶類，分離產(chǎn)漆酶菌株的首選樣品是生活污水嗎？不是。6.選擇培養(yǎng)基三種篩選方法：（1）利用營(yíng)養(yǎng)缺陷進(jìn)行選擇培養(yǎng)。某種營(yíng)養(yǎng)缺陷的微生物不能正常生長(zhǎng)（2）利用添加某種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行選擇培養(yǎng)。*添加殺傷性物質(zhì)，有抗性的可以生長(zhǎng)，無(wú)抗性的死亡（3）利用改變培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇培養(yǎng)。*調(diào)節(jié)溫度、pH等生長(zhǎng)條件，只有適應(yīng)的可以生長(zhǎng)8.選擇培養(yǎng)基的制備原理：根據(jù)不同微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或?qū)ζ淠骋换瘜W(xué)、物理因素的抗性不同而制備選擇培養(yǎng)基。（二）微生物的選擇培養(yǎng)（以培養(yǎng)土壤中分解尿素的細(xì)菌為例）1.稀釋涂布平板法（活菌計(jì)數(shù)法），稀釋涂布平板法基礎(chǔ)操作包括：梯度稀釋和涂布平板。2.稀釋涂布平板法方法概述：由于土壤細(xì)菌的數(shù)量龐大，要想得到特定微生物的純培養(yǎng)物，必須要對(duì)土壤進(jìn)行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上。3.平板劃線法的作用：分離純化微生物。稀釋涂布平板法的作用：分離純化微生物、統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。4.分離純化微生物具體含義：將單個(gè)微生物分散在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)得到單菌落（即純培養(yǎng)物）。5．稀釋涂布平板法分離分解尿素的細(xì)菌操作過(guò)程如下：（1）系列稀釋操作：如下圖所示，在編號(hào)為1×102～1×107試管中分別盛有9mL無(wú)菌水；將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻；取1mL上清液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次等比稀釋。（2）涂布平板操作：第1步：取菌液——取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面；第2步：涂布器消毒——將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中；第3步：涂布器滅菌——將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布；第4步：涂布平板：用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。（3）培養(yǎng)：待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d。在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。6.注意：①在涂布平板時(shí)，滴加到培養(yǎng)基表面的菌懸液量不宜過(guò)多（0.1ml）的原因是培養(yǎng)基表面的菌菌懸液會(huì)出現(xiàn)積液，導(dǎo)致菌體堆積，影響分離效果。梯度稀釋原因：培養(yǎng)液中菌體濃度高，直接培養(yǎng)很難分離得到單菌落；目的：將聚集的菌體分散開，以便獲得單菌落。②梯度稀釋中，每次取樣前需用手指輕壓移液管橡皮頭，吹吸三次，目的是使微生物和無(wú)菌水混合均勻。③涂布器浸在酒精中的主要目的是為涂布器的灼燒滅菌做準(zhǔn)備；為保證菌液均勻分布，應(yīng)在涂布時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿。④將涂布器從酒精中取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。不要將過(guò)熱的涂布器放到盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。⑤a.以上操作均在酒精燈火焰旁進(jìn)行，防止雜菌污染。b.若要分離并統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)，應(yīng)選用稀釋涂布平板法。c.平板劃線法不能用于活菌計(jì)數(shù)的原因是菌落連成片，無(wú)法計(jì)數(shù)。7.③號(hào)試管稀釋倍數(shù)為104。（三）微生物的數(shù)量測(cè)定微生物的數(shù)量測(cè)定方法：間接計(jì)數(shù)法——稀釋涂布平板法直接計(jì)數(shù)法——顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、濾膜法。1.稀釋涂布平板法（1）原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。（2）計(jì)數(shù)原則：一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。樣品的稀釋度將直接影響平板上的菌落數(shù)目，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)。在同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值。樣品的稀釋度將直接影響平板上的菌落數(shù)目。（3）注意事項(xiàng)：用稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)目時(shí)，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少，這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來(lái)表示。2.顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：該方法利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，然后再計(jì)算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。3.稀釋涂布平板法結(jié)果分析：（1）統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少；這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。（2）統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來(lái)表示。4.C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)菌落數(shù)的平均值；V代表涂布平板時(shí)吸取的稀釋液體積數(shù)值(mL)；M代表稀釋倍數(shù)；則每g樣品中的細(xì)菌數(shù)=（C÷V）×M。5.將1ml水樣稀釋100倍，在三個(gè)平板上用涂布法分別接入0.1ml稀釋液；經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個(gè)平板上的菌落數(shù)分別為39、38和37。據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。6.恰當(dāng)?shù)南♂尪取⑼坎际欠窬鶆蚴浅晒y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。7．顯微鏡直接計(jì)數(shù)法原理：利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，然后再計(jì)算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量。8.顯微直接計(jì)數(shù)法優(yōu)點(diǎn)：快速直觀。9.顯微直接計(jì)數(shù)法缺點(diǎn)：（1）統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。原因：不能區(qū)分死菌與活菌。（2）個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。（四）土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1.實(shí)驗(yàn)原理：絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。2.實(shí)驗(yàn)步驟：土壤取樣→制備培養(yǎng)基→樣品的稀釋與涂布平板→微生物的培養(yǎng)與觀察。（1）土壤取樣：①取樣地點(diǎn)要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。原因：細(xì)菌適宜在該環(huán)境中生長(zhǎng)。②取樣過(guò)程：取樣時(shí)一般要鏟去表層土。原因：細(xì)菌絕大部分分布在距地表3-8cm的土壤層。③注意事項(xiàng)：取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。（2）制備培養(yǎng)基:①作對(duì)照：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。作用：作為對(duì)照組，來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。②實(shí)驗(yàn)組：選擇培養(yǎng)基。特點(diǎn)：以尿素為唯一氮源。培養(yǎng)基中KH2PO4和Na2HPO4的作用：提供無(wú)機(jī)鹽、調(diào)節(jié)pH。尿素作用：氮源。葡萄糖作用：碳源。（3）樣品的稀釋與涂布平板:①1g土的體積約為_1_ml，10g土加入到90ml無(wú)菌水，相當(dāng)于稀釋了10倍。假如104稀釋度下涂布的3個(gè)平板的菌落數(shù)分別為42、40和38，則1ml稀釋液中的菌株數(shù)為400，104稀釋度的試管中的菌株數(shù)為4×103，102稀釋度的試管中的菌株數(shù)為4×105，101稀釋度的錐形瓶中的菌株數(shù)為4×107。101稀釋度的錐形瓶中的菌株來(lái)自于10g土，所以1g土中的菌株數(shù)為4×106。②每個(gè)濃度至少設(shè)置4個(gè)平板。1.2.3平板是實(shí)驗(yàn)組，為選擇培養(yǎng)基，做3組的目的平行重復(fù)。4是對(duì)照組，為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。③整個(gè)實(shí)驗(yàn)還需要設(shè)置2個(gè)平板，是哪兩個(gè)？不涂布稀釋液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。目的：用來(lái)判斷培養(yǎng)基中是否含有雜菌（培養(yǎng)基滅菌是否合格）。④為獲得菌落數(shù)在30-300之間適于計(jì)數(shù)的平板，測(cè)細(xì)菌時(shí)，一般選用104、105、106倍稀釋的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。⑤在初次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，怎樣才能保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？選用稀釋范圍更大的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)（例如可以將1×103-1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布平板上培養(yǎng)）。⑥本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標(biāo)記，例如，在標(biāo)記培養(yǎng)皿時(shí)應(yīng)該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。⑦標(biāo)記時(shí)注意標(biāo)記在皿底，不能標(biāo)記在皿蓋。（3）微生物的培養(yǎng)與觀察（1）培養(yǎng)條件：細(xì)菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d。（2）觀察：每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。（3）為什么選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果？防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。（4）一般來(lái)說(shuō)，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。（4）結(jié)果分析①說(shuō)出下列各組培養(yǎng)基的目的：3組接種的選擇培養(yǎng)基：對(duì)土壤中分解尿素的細(xì)菌分離和計(jì)。1組接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。不接種的選擇培養(yǎng)基：驗(yàn)證選擇培養(yǎng)基中是否含有雜菌。不接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：驗(yàn)證牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中是否含有雜菌。②說(shuō)出以下現(xiàn)象對(duì)應(yīng)的結(jié)果分析：現(xiàn)象分析未涂布培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)培養(yǎng)基未被雜菌污染未涂布培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng)培養(yǎng)基被雜菌污染牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目選擇培養(yǎng)基具有選擇作用③樣品稀釋操作成功的標(biāo)志是什么？得到2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)在30-300的平板。④得到的菌落一定是分解尿素的細(xì)菌嗎？不一定，還需要進(jìn)一步的鑒定。注意：1.如何設(shè)計(jì)培養(yǎng)基篩選分解尿素的細(xì)菌？以尿素作為唯一氮源設(shè)計(jì)選擇培養(yǎng)基，只有能合成脲酶的細(xì)菌才能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖。2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？除以尿素作為唯一氮源外，該培養(yǎng)基的其他營(yíng)養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同。3.在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的一定是所選擇的目的菌嗎？不一定，有些微生物可以利用目的菌的代謝產(chǎn)物來(lái)生長(zhǎng)繁殖，所以還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。4.怎么證明一個(gè)選擇培養(yǎng)基具有選擇性？應(yīng)該設(shè)置基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）或完全培養(yǎng)基作為對(duì)照，若基礎(chǔ)培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落數(shù)菌多于該選擇培養(yǎng)基，則該選擇培養(yǎng)基具有選擇性。5.尿素可為尿素分解菌提供氮源的原因？尿素可為尿素分解菌提供碳源嗎？為什么？尿素分解菌能合成脲酶，脲酶能催化分解尿素產(chǎn)生NH3和CO2，NH3可作為尿素分解菌的氮源。但不能作為碳源，因?yàn)槟蛩胤纸饩皇亲责B(yǎng)生物，不能利用CO2作為氮源。（五）進(jìn)一步探究——分解尿素細(xì)菌的進(jìn)一步鑒定（自選）1.原理:分解尿素細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為CO2和NH3，NH3溶于水會(huì)電離出NH4+和OH-，使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，因此可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基pH的變化來(lái)判斷是否發(fā)生了該化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而判斷該菌是否為尿素分解細(xì)菌；2.方法:在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅。液體培養(yǎng)基可以直接看液體的變色情況；固體培養(yǎng)基上可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶；紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說(shuō)明分解能力越強(qiáng)。第3節(jié)發(fā)酵工程及其應(yīng)用一、發(fā)酵工程的基本環(huán)節(jié)1.發(fā)酵工程的基本環(huán)節(jié)：下圖為發(fā)酵工程的基本環(huán)節(jié)圖，圖中①～⑤處所填寫的內(nèi)容依次是：①選育菌種；②滅菌；③接種；④發(fā)酵；⑤分離、提純產(chǎn)物。(1)選育菌種①選育菌種目的：獲得性狀優(yōu)良的菌種。②選育方法（菌種來(lái)源）：可以從自然界中篩選出來(lái)，也可以通過(guò)誘變育種或基因工程育種獲得。③)菌種選育的重要性（意義）:優(yōu)良的菌種不僅具有健壯，不易退化，其發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，它往往還會(huì)賦予發(fā)酵產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味，因此菌種選育環(huán)節(jié)在很大程度上決定了生物發(fā)酵產(chǎn)物的成敗。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)：①目的：獲得更多的菌種。②原因：工業(yè)發(fā)酵罐的體積一般較大，因此，需要接入的菌種總體積大（數(shù)目多）。③擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基：一般為液體培養(yǎng)基。（3）配制培養(yǎng)基的要求：①在菌種確定之后，（結(jié)合菌種代謝特點(diǎn)）選擇原料制備培養(yǎng)基。②在生產(chǎn)實(shí)踐中，培養(yǎng)基的配方要經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)才能確定。（即不斷優(yōu)化培養(yǎng)基）滅菌目的：避免因雜菌污染而影響產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量。②培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌原因：發(fā)酵工程中所用的菌種大多是單一菌種。一旦有雜菌污染，可能導(dǎo)致產(chǎn)量大大下降。（4）接種：擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種和滅菌后的培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中。大型發(fā)酵罐有計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)，能對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH、溶解氧、罐壓、通氣量、攪拌、泡沫和營(yíng)養(yǎng)等進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制。（5）發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵下圖為發(fā)酵罐示意圖，圖中①～⑤處所填寫內(nèi)容依次為：①排氣管；②排出口；③溫度；④進(jìn)入口；⑤空氣。①發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵是發(fā)酵工程的中心環(huán)節(jié)。②發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵嚴(yán)格控制發(fā)酵條件的原因：a.環(huán)境條件不僅會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，而且影響微生物代謝物的形成；b.嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，有利于使發(fā)酵全過(guò)程處于最佳狀態(tài)。③發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵要求：在發(fā)酵過(guò)程中，要隨時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)液中的微生物數(shù)量、產(chǎn)物濃度等，以了解發(fā)酵進(jìn)程。還要及時(shí)添加必需的營(yíng)養(yǎng)組分，要嚴(yán)格控制溫度、pH和溶解氧等發(fā)酵條件。④不同發(fā)酵條件的影響實(shí)例——谷氨酸發(fā)酵a.在中性和弱堿性條件下會(huì)積累谷氨酸。b.在酸性條件下則容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺。⑤現(xiàn)代發(fā)酵工程使用的發(fā)酵罐的優(yōu)點(diǎn)：均有計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)，能對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH、溶氧量、罐壓、通氣量、攪拌、泡沫和營(yíng)養(yǎng)等進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制，還可以進(jìn)行反饋控制，使發(fā)酵全過(guò)程處于最佳狀態(tài)。(6)產(chǎn)品的分離、提純①產(chǎn)品的分離、提純目的：獲得產(chǎn)品。②產(chǎn)品的兩種形式：微生物細(xì)胞本身、代謝物。③分離、提純產(chǎn)物采取手段：如果發(fā)酵產(chǎn)品是微生物細(xì)胞本身，可在發(fā)酵結(jié)束之后，采用過(guò)濾、沉淀等方法將菌體分離和干燥得到產(chǎn)品。如果產(chǎn)品是代謝物，可根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)采取適當(dāng)?shù)奶崛?、分離和純化措施來(lái)獲得產(chǎn)品。2.微生物菌種資源豐富，選擇發(fā)酵工程用菌時(shí)，需要考慮哪些因素？（1）在低成本的培養(yǎng)基上能迅速生長(zhǎng)繁殖。（2）生產(chǎn)所需代謝物的產(chǎn)量高。（3）發(fā)酵條件易控制。（4）菌種不易變異，退化等。3.怎樣對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)控以滿足微生物的生長(zhǎng)需要？（1）反復(fù)試驗(yàn)確定培養(yǎng)基的配方；（2）對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌；（3）隨時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)液中微生物的數(shù)量、產(chǎn)物濃度等；（4）及時(shí)添加必需的營(yíng)養(yǎng)組分；（5）嚴(yán)格控制溫度、pH和溶氧量等發(fā)酵條件，使用計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)對(duì)各種條件進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制，以及反饋控制。4與傳統(tǒng)的手工發(fā)酵相比，在啤酒的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，能明顯提高啤酒的產(chǎn)量和質(zhì)量的工程手段有：菌種的選育、對(duì)原材料的處理、發(fā)酵過(guò)程的控制、產(chǎn)品的消毒等。5.在進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí),排出的氣體和廢棄培養(yǎng)液等能直接排放到外界環(huán)境中嗎?為什么？不能；因?yàn)樵谶M(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，微生物及其代謝物中都可能含有危害環(huán)境的物質(zhì)。為了減少或避免污染物的產(chǎn)生和排放，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，應(yīng)該對(duì)排出的氣體和廢氣培養(yǎng)液進(jìn)行二次清潔或滅菌處理。6.注意：（1）谷氨酸發(fā)酵常用菌種為谷氨酸棒狀桿菌；（2）谷氨酸棒狀桿菌的代謝類型為異養(yǎng)需氧型，其與有氧呼吸有關(guān)的酶主要存在于細(xì)胞膜上；（3）C:N的數(shù)值也會(huì)影響谷氨酸發(fā)酵過(guò)程：C:N=4:1時(shí)，菌體大量繁殖，谷氨酸產(chǎn)生量較少；C:N=3:1時(shí)，菌體繁殖受抑制，谷氨酸產(chǎn)生量較多。發(fā)酵工程的應(yīng)用1.發(fā)酵工程以其生產(chǎn)條件溫和、原料來(lái)源豐富且價(jià)格低廉、產(chǎn)物專一、廢棄物對(duì)環(huán)境的污染小和容易處理等特點(diǎn)，在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)等等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。2.食品工業(yè)是微生物最早開發(fā)和應(yīng)用的領(lǐng)域。一直以來(lái)，與發(fā)酵有關(guān)的食品工業(yè)的產(chǎn)量和產(chǎn)值都居于發(fā)酵工業(yè)的首位。3.發(fā)酵工程與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)相比，在產(chǎn)物分離和提純方面有較大改進(jìn)。主要體現(xiàn)在：傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)獲得