第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則

第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)通用技術(shù)指導(dǎo)原則前言本指導(dǎo)原則重要針對(duì)第二代測(cè)序（nextgenerationsequencing，NGS）技術(shù)檢測(cè)試劑（下列簡(jiǎn)稱“NGS檢測(cè)試劑”）產(chǎn)品質(zhì)量提出指導(dǎo)性規(guī)定，涉及基本原則、重要原材料、檢測(cè)流程及性能評(píng)價(jià)等方面。本指導(dǎo)原則是對(duì)公司和檢查人員的指導(dǎo)性文獻(xiàn)，但不涉及注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足有關(guān)法規(guī)規(guī)定的其它辦法，也能夠采用，但是需要提供具體的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵照有關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和原則體系以及現(xiàn)在認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和原則的不停完善、科學(xué)技術(shù)的不停發(fā)展，其有關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)節(jié)。合用范疇本指導(dǎo)原則合用于基于NGS技術(shù)的檢測(cè)試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。NGS檢測(cè)試劑的預(yù)期用途涉及但不限于下列內(nèi)容：腫瘤有關(guān)基因異常、遺傳疾病有關(guān)基因異常、胚胎植入前染色體非整倍體、胎兒染色體非整倍體及病原微生物等臨床檢測(cè)應(yīng)用。這類檢測(cè)試劑涉及的NGS技術(shù)涉及靶向性測(cè)序和非靶向性測(cè)序：靶向性測(cè)序法是指對(duì)樣本中的基因組進(jìn)行部分測(cè)序，如靶基因測(cè)序、外顯子（組）測(cè)序等；非靶向性測(cè)序是指對(duì)樣本中潛在生物體的基因組進(jìn)行測(cè)序。原則上不建議公司應(yīng)用全基因組測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)，如果公司應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)，應(yīng)進(jìn)行充足的技術(shù)合用性驗(yàn)證并提交報(bào)告。待測(cè)樣本能夠是人源樣本（如體液、組織、排泄物等）或病原微生物分離培養(yǎng)物（如血培養(yǎng)物、痰培養(yǎng)物等），檢測(cè)對(duì)象能夠是脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或兩者的混合物。本指導(dǎo)原則盡量覆蓋全部的NGS技術(shù)原理和測(cè)序平臺(tái)，所討論和描述的內(nèi)容不限于某個(gè)特定的NGS檢測(cè)試劑。但鑒于NGS技術(shù)始終在不停升級(jí)和更新，可能會(huì)有本指導(dǎo)原則未能涉及的新技術(shù)?；疽?guī)定基本原則NGS檢測(cè)試劑的生產(chǎn)公司應(yīng)獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》。研制、生產(chǎn)用的多個(gè)原料、輔料等應(yīng)制訂其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量原則，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的規(guī)定。試劑生產(chǎn)公司生產(chǎn)質(zhì)量管理體系應(yīng)符合《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》及《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診療試劑》的規(guī)定，并應(yīng)通過(guò)《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診療試劑現(xiàn)場(chǎng)檢查指導(dǎo)原則》的核查。試劑生產(chǎn)公司應(yīng)含有與其技術(shù)規(guī)定相適應(yīng)的人員、廠房、設(shè)施和儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境。建立專用實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格分區(qū)，人員和物品應(yīng)當(dāng)單向流動(dòng)，以最大程度地避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣本之間的污染和避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。生產(chǎn)用于病原微生物核酸檢測(cè)的生產(chǎn)公司應(yīng)建立符合生物安全規(guī)定的設(shè)施和方法。重要原材料NGS檢測(cè)試劑的重要原材料涉及實(shí)驗(yàn)原材料和數(shù)據(jù)分析原材料。實(shí)驗(yàn)原材料涉及引物、探針、酶、參考品或原則品等，公司應(yīng)提供盡量完整的研究資料，如選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)量原則等；數(shù)據(jù)分析原材料涉及數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）、生物信息學(xué)分析軟件及數(shù)據(jù)儲(chǔ)存中心等。數(shù)據(jù)分析原材料能影響檢測(cè)成果，公司應(yīng)提供盡量完整的研究資料，如數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）的溯源性、生物信息學(xué)分析軟件的算法以及數(shù)據(jù)儲(chǔ)存中心的安全性與穩(wěn)定性等。對(duì)于實(shí)驗(yàn)原材料，若公司自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；若來(lái)自市場(chǎng)（從其它單位購(gòu)置），應(yīng)提供的資料涉及：對(duì)供應(yīng)商審核的有關(guān)資料、購(gòu)置合同、供貨方提供的質(zhì)量原則、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢查資料。原材料或其供應(yīng)商發(fā)生變更，應(yīng)根據(jù)國(guó)家有關(guān)法規(guī)的規(guī)定進(jìn)行變更申請(qǐng)，并重新對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行性能驗(yàn)證。對(duì)于數(shù)據(jù)分析原材料，若公司自己提供，應(yīng)含有完整的生物信息學(xué)分析軟、硬件能力，制訂對(duì)應(yīng)的開(kāi)發(fā)、維護(hù)及升級(jí)等方案；若來(lái)自市場(chǎng)（購(gòu)置服務(wù)或產(chǎn)品），應(yīng)提供對(duì)應(yīng)的驗(yàn)證資料及后續(xù)的維護(hù)、升級(jí)等方案資料。如材料發(fā)生變更，應(yīng)重新對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行性能驗(yàn)證，并根據(jù)國(guó)家有關(guān)法規(guī)的規(guī)定進(jìn)行變更申請(qǐng)。建議公司提供的具體資料涉及但不限于下列內(nèi)容：核酸提取、分離及純化組分的重要構(gòu)成、原理介紹及有關(guān)的驗(yàn)證資料，需覆蓋產(chǎn)品檢測(cè)涉及的各樣本類型。測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建組分的重要構(gòu)成、原理介紹及有關(guān)的驗(yàn)證資料構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的重要原料（脫氧三磷酸核苷、接頭序列、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、引物、探針、接頭及其它重要原料）的選擇、制備、質(zhì)量原則及研究資料。如以上原材料來(lái)自市場(chǎng)，公司可提供供應(yīng)商出具的質(zhì)檢報(bào)告。如供應(yīng)商提供的原材料為混合體系，可提供針對(duì)混合體系的質(zhì)檢報(bào)告。脫氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的構(gòu)成成分，涉及：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；建議提交對(duì)純度、濃度及保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。引物、探針及接頭引物、探針及接頭均是由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列。探針帶有特定的標(biāo)記物，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)和捕獲。接頭涉及條碼（barcode）或標(biāo)簽（index），用于將待測(cè)核酸與測(cè)序載體連接、分辨不同來(lái)源的樣本等。建議公司提交序列選擇、制備辦法、質(zhì)量原則，以及對(duì)分子量、純度、保存穩(wěn)定性、功效性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如果為外購(gòu)，需提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及限制性內(nèi)切酶連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及限制性內(nèi)切酶應(yīng)含有對(duì)應(yīng)的酶活性。建議提交酶活性、熱穩(wěn)定性及工作效率等驗(yàn)證資料。參考品或原則品原料選擇、制備、定值過(guò)程、穩(wěn)定性研究及性能驗(yàn)證等資料。核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染，建議提交對(duì)應(yīng)檢測(cè)報(bào)告。數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）用于NGS檢測(cè)試劑的生物信息學(xué)分析，輔助測(cè)序比對(duì)拼接和測(cè)序成果確認(rèn)。建議公司提交數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）的溯源信息、數(shù)據(jù)庫(kù)類型（本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)、在線數(shù)據(jù)庫(kù)）、完整性、實(shí)時(shí)性、維護(hù)以及升級(jí)方案等資料。生物信息學(xué)分析軟件用于對(duì)原始測(cè)序成果進(jìn)行分析并報(bào)告最后檢測(cè)成果。建議公司提交分析軟件的版本、算法、性能驗(yàn)證以及升級(jí)方案等資料。數(shù)據(jù)存儲(chǔ)中心用于儲(chǔ)存原始和通過(guò)分析后的檢測(cè)成果，能夠是本地或云儲(chǔ)存中心。建議公司提交數(shù)據(jù)存儲(chǔ)中心的安全性、穩(wěn)定性、維護(hù)與升級(jí)方案以及異常狀況處置方案等資料。檢測(cè)流程N(yùn)GS檢測(cè)試劑的檢測(cè)流程能夠分為樣本收集、樣本制備、測(cè)序、生物信息學(xué)分析及報(bào)告和數(shù)據(jù)庫(kù)管理等五個(gè)環(huán)節(jié)。公司在設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)充足考慮每個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，并進(jìn)行驗(yàn)證。樣本收集樣本可覺(jué)得人體樣本（如體液、組織、排泄物等）或病原微生物分離培養(yǎng)物（如血培養(yǎng)物、痰培養(yǎng)物等）。樣本的獲取及預(yù)解決方式、保存條件及期限（短期、長(zhǎng)久）、運(yùn)輸條件等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵照，并引用；若沒(méi)有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則公司應(yīng)當(dāng)設(shè)立自己內(nèi)部的原則操作流程，以確保樣本的質(zhì)量，并且避免樣本間的混淆與交叉污染。不同類型的樣本所抽提的核酸的質(zhì)量可能有所差別，對(duì)于每一種類型的樣本，應(yīng)當(dāng)明確檢測(cè)所需樣本的用量。如樣本不符合規(guī)定，應(yīng)重新取樣。公司需明確標(biāo)記出下列內(nèi)容，涉及產(chǎn)品合用的樣本類型、采集時(shí)間、采集部位、采集方式、采集量及保存和運(yùn)輸條件等內(nèi)容。樣本的采集時(shí)間的選擇需考慮與否受臨床癥狀、用藥狀況等因素的影響；采集部位應(yīng)考慮樣本的代表性、操作的難易程度及安全性等因素；采集方式應(yīng)詳述具體的操作辦法或列出有關(guān)操作指南文獻(xiàn)以指導(dǎo)使用者（含圖示）；公司根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期用途，設(shè)計(jì)具體的采集量原則，公司應(yīng)明確采集量判斷原則及辦法；保存和運(yùn)輸條件應(yīng)保護(hù)樣本中的核酸，公司應(yīng)明確樣本的保存條件（溫度、濕度等）及期限（短期、長(zhǎng)久）、運(yùn)輸條件（溫度、濕度等）及重復(fù)凍融限制等。樣本制備核酸提取、分離及純化樣本中核酸的提取、分離及純化的重要目的是為了富集核酸濃度并確保核酸序列的完整性。公司應(yīng)在NGS檢測(cè)試劑的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)過(guò)程中對(duì)配套使用的核酸提取、分離及純化試劑進(jìn)行匹配性驗(yàn)證，以確保其性能滿足檢查的需要。公司應(yīng)明確檢測(cè)所需核酸的最小用量。公司應(yīng)當(dāng)設(shè)立核酸抽提及抽提后質(zhì)量控制的書(shū)面原則操作流程，并根據(jù)性能驗(yàn)證成果在此給出用于擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的核酸溶液濃度范疇規(guī)定，以確保核酸樣本的質(zhì)量與濃度符合規(guī)定，并且避免樣本間的混淆與交叉污染。公司應(yīng)當(dāng)對(duì)抽提的每一次核酸樣本的多個(gè)質(zhì)控參數(shù)有具體的統(tǒng)計(jì)，建議涉及但不限于核酸體積、質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測(cè)辦法涉及但不限于分光光度法、熒光法等；核酸完整性檢測(cè)辦法涉及但不限于瓊脂糖凝膠法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。如果提取、分離及純化的核酸樣本質(zhì)量不符合規(guī)定，應(yīng)重新取樣或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/純化。靶向序列富集及測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建靶向序列富集是指靶向性擴(kuò)增一定大小的核酸片段，公司應(yīng)對(duì)富集原理及辦法進(jìn)行具體描述。公司應(yīng)制訂原則操作流程及質(zhì)量控制方案，統(tǒng)計(jì)涉及靶向序列片段的濃度、純度及大小等參數(shù)。公司根據(jù)具體的測(cè)序平臺(tái)的性能特點(diǎn)，對(duì)核酸序列進(jìn)行片段化解決，片段的長(zhǎng)短應(yīng)符合后續(xù)測(cè)序的規(guī)定，片段化辦法涉及但不限于超聲法、酶切法等。公司應(yīng)制訂核酸序列片段化操作流程及質(zhì)量控制方案，對(duì)通過(guò)片段化的核酸短序列的濃度、純度及大小等參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)并具體統(tǒng)計(jì)。添加接頭（條碼或標(biāo)簽）測(cè)序文庫(kù)中的短核酸片段需要與測(cè)序載體連接后才干進(jìn)行測(cè)序反映，這一連接過(guò)程需要先給短核酸片段添加接頭。NGS技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)將多個(gè)來(lái)源不同的樣本混合后在一種測(cè)序反映中同時(shí)檢測(cè)，為了分辨這些樣本，普通采用在每一種原始樣本的測(cè)序文庫(kù)中加上唯一的寡核苷酸標(biāo)簽的辦法進(jìn)行標(biāo)記，這些寡核苷酸標(biāo)簽被稱為條碼或標(biāo)簽。條碼和標(biāo)簽?zāi)軌虬诮宇^序列內(nèi)，也能夠獨(dú)立于接頭序列。添加接頭能夠是獨(dú)立的環(huán)節(jié)，也能夠在靶向序列富集過(guò)程添加。公司使用條碼或標(biāo)簽時(shí)，需充足驗(yàn)證并滿足測(cè)序所需的質(zhì)量規(guī)定，如測(cè)序深度、覆蓋度等條件。同時(shí)，公司應(yīng)對(duì)潛在的問(wèn)題進(jìn)行充足研究，涉及但不限于：條碼檢出率的均勻性、條碼交換比率以及條碼間互相污染或干擾等因素。公司應(yīng)報(bào)告有效的條碼或標(biāo)簽數(shù)量，并對(duì)每個(gè)條碼或標(biāo)簽的序列及其位置有具體、清晰的統(tǒng)計(jì)。測(cè)序測(cè)序平臺(tái)現(xiàn)在商業(yè)上慣用的第二代測(cè)序平臺(tái)根據(jù)測(cè)序原理可分為光學(xué)技術(shù)(Illumina公司、華大基因公司為代表）和半導(dǎo)體技術(shù)（Thermo公司為代表）。每個(gè)測(cè)序平臺(tái)都有各自的特異性參數(shù)，涉及儀器大小、通量、讀長(zhǎng)、運(yùn)行時(shí)間及測(cè)序成本等，公司應(yīng)結(jié)合具體的臨床應(yīng)用需求選擇適宜的測(cè)序平臺(tái)。測(cè)序及堿基讀取公司應(yīng)根據(jù)所選用的測(cè)序平臺(tái)，選擇適宜的參數(shù)指標(biāo)對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，制訂對(duì)應(yīng)的管理制度及質(zhì)量原則，并明確失控狀況下的糾正方法。公司應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用狀況，如測(cè)序區(qū)域的大小及序列特性等因素?cái)M定測(cè)序所需要的覆蓋度及深度。在測(cè)序過(guò)程中，公司應(yīng)建立原則操作流程及質(zhì)量控制方案監(jiān)控整個(gè)測(cè)序過(guò)程當(dāng)中的測(cè)序質(zhì)量。公司應(yīng)根據(jù)具體的預(yù)期用途，制訂產(chǎn)品的測(cè)序覆蓋度和深度，并提供充足的理論根據(jù)及驗(yàn)證成果。堿基讀取是指識(shí)別一段基因序列片段每一種位點(diǎn)的核苷酸的過(guò)程。不同測(cè)序平臺(tái)含有不同的測(cè)序偏好性，可影響堿基讀取過(guò)程中的錯(cuò)誤類型與比率。應(yīng)用軟件能夠消除或部分抵消測(cè)序偏好性的影響，提高堿基讀取的精確性。堿基讀取后，公司應(yīng)對(duì)每個(gè)堿基讀取的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)定。若堿基讀取質(zhì)量有通用原則，則應(yīng)遵照并引用；若沒(méi)有通用原則，可根據(jù)具體應(yīng)用狀況制訂堿基讀取質(zhì)量評(píng)價(jià)原則及分析辦法，并提供充足的理論根據(jù)及驗(yàn)證成果。生物信息學(xué)分析及報(bào)告公司應(yīng)對(duì)生物信息學(xué)分析流程有完整的統(tǒng)計(jì)，建立完善的生物信息學(xué)分析軟件的版本控制方案。公司應(yīng)建立生物信息學(xué)分析流程原則操作流程及質(zhì)量控制方案，確保測(cè)序數(shù)據(jù)的分析、解讀及報(bào)告的精確性與嚴(yán)謹(jǐn)性。生物信息學(xué)分析應(yīng)報(bào)告含有明確臨床指導(dǎo)意義的成果。序列比對(duì)拼接序列比對(duì)是指運(yùn)用生物信息學(xué)軟件，將短的測(cè)序片段與參考序列進(jìn)行比對(duì)后完畢拼接的過(guò)程。參考序列應(yīng)含有明確溯源性，能夠是全基因組序列或基因片段序列。若預(yù)期用途為檢測(cè)未知病原微生物，難以提前擬定參考序列，能夠?qū)y(cè)序成果進(jìn)行互相比對(duì)，在此基礎(chǔ)上完畢長(zhǎng)序列的拼接。不同的序列比對(duì)軟件的精確性、特異性及比對(duì)速度等方面都有差別，公司需根據(jù)具體需要進(jìn)行選擇。公司需要評(píng)定序列比對(duì)的質(zhì)量，若比對(duì)質(zhì)量有通用的原則，則應(yīng)遵照，并引用；若沒(méi)有通用的原則，則公司應(yīng)當(dāng)設(shè)立自己內(nèi)部的原則，以確保比對(duì)成果的精確性。待測(cè)基因序列確實(shí)認(rèn)決定檢測(cè)成果精確性的因素涉及但不限于測(cè)序均勻度、覆蓋度和測(cè)序深度等。普通地，測(cè)序均勻度越好，覆蓋度越廣，深度越深，待測(cè)基因序列的拼接成果越精確。待測(cè)基因序列中某些特殊區(qū)域的測(cè)序深度可能很低，可據(jù)此設(shè)立產(chǎn)品的最低檢出限。公司需要對(duì)樣本測(cè)序成果各個(gè)位點(diǎn)的測(cè)序覆蓋度和深度有明確的計(jì)算辦法和具體的描述。文獻(xiàn)格式生物信息學(xué)分析成果的輸出格式有諸多個(gè)，但是無(wú)論何種格式的文獻(xiàn)必須包含文獻(xiàn)構(gòu)造和數(shù)據(jù)組織形式的闡明，以及其它格式文獻(xiàn)和生物信息學(xué)分析軟件的兼容性闡明。建議使用通用的文獻(xiàn)格式，如比對(duì)成果使用“.bam”文獻(xiàn)或其它，測(cè)序成果使用“.fastq”文獻(xiàn)或其它。如果公司采用自己內(nèi)部的原則格式文獻(xiàn)，應(yīng)建立該原則格式的具體闡明，并注明該文獻(xiàn)格式與其它格式的兼容性及互相轉(zhuǎn)換的辦法。檢測(cè)成果解讀與報(bào)告若預(yù)期用途為檢測(cè)人源基因，報(bào)告中應(yīng)明確報(bào)告闡明書(shū)中預(yù)期用途與檢測(cè)范疇涵蓋的變異位點(diǎn)與變異類型以及對(duì)應(yīng)的遺傳注釋。建議基因名字應(yīng)當(dāng)與國(guó)際上通用的HUGO基因命名委員會(huì)命名規(guī)則()一致。若預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物，檢測(cè)成果應(yīng)明確測(cè)序樣本中與否含有待測(cè)病原微生物。如果是分型檢測(cè)試劑和耐藥突變檢測(cè)試劑還要明確報(bào)告病原微生物的型別及耐藥突變位點(diǎn)信息。報(bào)告中建議涉及但不限于明確的檢測(cè)成果，檢測(cè)辦法及局限性等內(nèi)容。原則上嚴(yán)禁報(bào)告中出現(xiàn)超出產(chǎn)品預(yù)期用途的檢測(cè)項(xiàng)目及成果。公司應(yīng)制訂明確的檢測(cè)成果解讀與報(bào)告的原則操作流程，對(duì)不明確的檢測(cè)成果以及非預(yù)期檢測(cè)成果應(yīng)有具體明確的處置方案。數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）及數(shù)據(jù)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）的易用性、精確性及全方面性等因素對(duì)于檢測(cè)成果的對(duì)的解讀極為重要。公司應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的具體使用狀況選擇數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）并明確其溯源性。無(wú)論選擇何種類型的數(shù)據(jù)庫(kù)，公司應(yīng)對(duì)最后的檢測(cè)成果負(fù)責(zé)。若公司使用自建的數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)制訂完整的維護(hù)方案（實(shí)時(shí)和定時(shí)維護(hù)方案）對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容進(jìn)行增補(bǔ)或剔除，從而確保數(shù)據(jù)庫(kù)的精確性及全方面性。NGS檢測(cè)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量巨大，公司應(yīng)當(dāng)制訂適宜的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方案。數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方式可為本地或云存儲(chǔ)，無(wú)論選擇哪種方式，公司應(yīng)充足考慮數(shù)據(jù)存儲(chǔ)的時(shí)限性、安全性及穩(wěn)定性等因素。對(duì)于已儲(chǔ)存數(shù)據(jù)的重新訪問(wèn)與分析，公司應(yīng)進(jìn)行具體統(tǒng)計(jì)（如訪問(wèn)時(shí)間，訪問(wèn)人員、訪問(wèn)內(nèi)容及訪問(wèn)目的等信息）。對(duì)于已存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)，原則上允許對(duì)其進(jìn)行基于新預(yù)期用途的重復(fù)分析，但嚴(yán)禁出具新的檢測(cè)報(bào)告。性能評(píng)價(jià)核酸提取、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建核酸提取的完整性和純度以及測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的質(zhì)量都能影響檢測(cè)成果，因此應(yīng)對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制。建議的質(zhì)量控制因素涉及但不限于下列各項(xiàng)：用于核酸提取的樣本質(zhì)量、體積；核酸濃度及核酸定量辦法；核酸純化的質(zhì)量及檢測(cè)辦法；測(cè)序文庫(kù)的核酸質(zhì)量、濃度及片段大小等。陰性、陽(yáng)性參考品預(yù)期用途為檢測(cè)人源基因陰性參考品應(yīng)涵蓋產(chǎn)品闡明書(shū)中的預(yù)期用途與檢測(cè)范疇的野生型樣本，檢測(cè)成果應(yīng)為陰性；陽(yáng)性參考品應(yīng)涵蓋產(chǎn)品闡明書(shū)中的預(yù)期用途與檢測(cè)范疇的變異型樣本，檢測(cè)成果應(yīng)為陽(yáng)性；預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物陰性參考品應(yīng)涉及與待檢病原微生物種屬相近、臨床癥狀相似的病原微生物，且應(yīng)混入適量（參考臨床水平）的人源基因組。對(duì)應(yīng)檢測(cè)成果應(yīng)為陰性；陽(yáng)性參考品應(yīng)涉及產(chǎn)品闡明書(shū)中預(yù)期用途與檢測(cè)范疇待檢病原微生物，且應(yīng)混入適量（參考臨床水平）的人源基因組。對(duì)應(yīng)檢測(cè)成果應(yīng)為陽(yáng)性。最低檢出限建議能夠從擴(kuò)增反映終體系核酸濃度或基因變異序列所占百分率兩方面對(duì)最低檢出限進(jìn)行評(píng)價(jià)。NGS檢測(cè)試劑含有同時(shí)檢測(cè)多個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)或靶點(diǎn)的能力，可將多個(gè)最低檢出限參考品混合進(jìn)行檢測(cè)，但應(yīng)分別報(bào)告各個(gè)位點(diǎn)或靶點(diǎn)的最低檢出限成果。若預(yù)期用途為檢測(cè)人源基因，最低檢出限參考品應(yīng)覆蓋全部基因變異類型；若預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物，最低檢出限參考品應(yīng)覆蓋全部待測(cè)病原微生物。建議最低檢出限參考品優(yōu)先使用臨床獲得的生物樣本（細(xì)胞系、病原微生物等）；對(duì)于某些難以獲得的樣本（如罕見(jiàn)基因類型、難以分離培養(yǎng)的病原微生物等），能夠使用核酸模擬樣本（如假病毒、核酸片段、質(zhì)粒等）。使用病原微生物或核酸模擬樣本作為參考品時(shí)，應(yīng)混入適量（參考臨床水平）的人源基因組。精密性對(duì)于定量檢測(cè)試劑，建議考察試劑的原則差或變異系數(shù)；若為定性檢測(cè)試劑，可不進(jìn)行考察。建議從下列方面對(duì)NGS檢測(cè)試劑的精密性進(jìn)行評(píng)價(jià)：對(duì)可能影響檢測(cè)精密性的重要變量進(jìn)行驗(yàn)證，還應(yīng)對(duì)第二代測(cè)序儀、操作者及地點(diǎn)等因素進(jìn)行有關(guān)的驗(yàn)證；建議精密性評(píng)價(jià)辦法考慮下列檢測(cè)因素，涉及檢測(cè)周期、檢測(cè)次數(shù)、檢測(cè)方式（批內(nèi)、批間）以及檢測(cè)人員數(shù)量等；若預(yù)期用途為檢測(cè)人源基因，用于精密性評(píng)價(jià)的參考品建議覆蓋低頻率樣本；若預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物，用于精密性評(píng)價(jià)的參考品建議覆蓋弱陽(yáng)性樣本。干擾物質(zhì)公司根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型，擬定潛在的干擾物質(zhì)，并進(jìn)行充足驗(yàn)證。驗(yàn)證干擾物質(zhì)時(shí)，建議驗(yàn)證的項(xiàng)目涉及但不限于下列項(xiàng)目：引物之間的互相干擾對(duì)檢測(cè)成果的影響；潛在的PCR干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)成果的影響；若預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物，應(yīng)分別檢測(cè)目的病原微生物存在和不存在的狀況下，非目的病原微生物（種屬相近、臨床癥狀相似）對(duì)檢測(cè)成果的影響，以及人源基因組對(duì)檢測(cè)成果的影響。其它問(wèn)題若產(chǎn)品合用的樣本類型不止一種，應(yīng)對(duì)所涉及的樣本類型的合用性進(jìn)行評(píng)定；為確保檢測(cè)成果的精確性，公司應(yīng)根據(jù)不同測(cè)序平臺(tái)的特性擬定適宜的測(cè)序覆蓋度及深度，并進(jìn)行充足驗(yàn)證；生物信息學(xué)分析軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)能直接影響檢測(cè)成果，因此應(yīng)明確版本信息或最后維護(hù)日期。公司進(jìn)行軟件或數(shù)據(jù)庫(kù)升級(jí)后，應(yīng)評(píng)定對(duì)測(cè)序成果的潛在影響，以及與否需要對(duì)既往測(cè)序成果重新分析；對(duì)于合用多個(gè)儀器的產(chǎn)品，應(yīng)提供全部合用型號(hào)儀器的性能評(píng)定資料。不同型號(hào)儀器配套的測(cè)序試劑可能不同，且測(cè)序試劑的性能直接影響檢測(cè)試劑的整體質(zhì)量，建議提供測(cè)序試劑的質(zhì)量控制規(guī)定。起草單位本指導(dǎo)原則由中國(guó)食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所體外診療試劑二室起草完畢。參考文獻(xiàn)1.《體外診療試劑注冊(cè)管理方法》,（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)），07月30日。2.《中國(guó)生物制品規(guī)程》（），化學(xué)工業(yè)出版社。3.GuidelinesforDiagnosticNext-GenerationSequencing.EuropeanJournalofHumanGenetics,,24(1):1584-1589。4.Next-GenerationSequencingforInfectiousDiseaseDiagnosisandManagement:AReportoftheAssociationforMolecularPathology.TheJournalofMolecularDiagnostics,,17(6):623-634。5.ACMGClinicalLaboratoryStandardsforNext-GenerationSequencing.GeneticsinMedicine,,15(9)。6.CollegeofAmericanPathologists'LaboratoryStandardsforNext-GenerationSequencingClinicalTests.ArchivesofPathology&LaboratoryMedicine,,139(4)。7.MolecularDiagnosticMethodsforInfectiousDiseases;ApprovedGuideline—SecondEdition.ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.NCCLS,MM3-A2,Vol26No.8,ISBN1-56238-596-8。8.QuantitativeMolecularMethodsforInfectiousDiseases;ApprovedGuideline.NCCLS,MM6-A,Vol.23No.28.ISBN1-56238-508-9。9.VerificationandValidationofMultiplexNucleicAcidAssays;ApprovedGuideline.ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.NCCLS,MM17-A,Vol.28No.9,ISBN1-56238-661-1。10.TranslatingCancerGenomesandTranscriptomesforPrecisionOncology.CA:ACancerJournalforClinicians,,66:75-88.

附錄名詞解釋脫氧核糖核酸（DNA）核酸的一種。是由特殊序列的脫氧核糖核苷酸單元（dNTP）構(gòu)成的多聚核苷酸，起攜帶遺傳信息的功效。DNA為一種雙鏈分子，通過(guò)核苷酸堿基對(duì)間較弱的氫鍵維系。DNA包含的4中核苷酸涉及：腺嘌呤（A）、鳥(niǎo)嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（G）。人類存在兩種類型的DNA：來(lái)自細(xì)胞何種染色體的基因組DNA（gDNA）和線粒體DNA。核糖核酸（RNA）核酸的一種。是與DNA類似的單鏈核酸，由核糖核苷酸按照一定的次序排列而成，含尿嘧啶而不含胸腺嘧啶，存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在細(xì)胞的蛋白質(zhì)的合成和其它化學(xué)活動(dòng)中起重要的作用。RNA分子包含信使RNA（mRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）和其它小RNA等多個(gè)類型，分