液相色譜方法開(kāi)發(fā)0603

液相色譜的應(yīng)用以及方法開(kāi)發(fā)提綱：一.HPLC的應(yīng)用二.方法開(kāi)發(fā)過(guò)程1）選擇HPLC檢測(cè)器2）方法開(kāi)發(fā)的具體步驟3）梯度洗脫方法一.HPLC的廣泛應(yīng)用據(jù)2008年統(tǒng)計(jì)，世界上化合物總數(shù)多達(dá)5000多萬(wàn)種在全部有機(jī)化合物中僅有20％左右的樣品適用于GC分析而HPLC可對(duì)80％左右的有機(jī)化合物進(jìn)行分離和分析HPLC的廣泛應(yīng)用

HPLC特別適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質(zhì)的分離和分析并且可以做制備

在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用潛力。HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域在食品研究中的分析應(yīng)用食品中的天然成分碳水化合物類(lèi)脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機(jī)酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素〕維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素〕農(nóng)藥殘留和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS〕和亞硝酸HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域

在醫(yī)藥研究中分析應(yīng)用藥物分析有USP、BP、CP等標(biāo)準(zhǔn)

常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類(lèi)消炎藥等。甾體藥物研究中的應(yīng)用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等?？咕仡?lèi)藥物研究中的應(yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(lèi)(皂甙、強(qiáng)心甙、黃酮甙等)、萜類(lèi)手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強(qiáng))醫(yī)療藥物的檢測(cè)、新藥研究、藥物代謝、藥代動(dòng)力學(xué)研究。

在獸藥研究中分析應(yīng)用

HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域在生物化學(xué)和生物工程中的應(yīng)用氨基酸、多肽合成和蛋白質(zhì)的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類(lèi))

在精細(xì)化工分析中的應(yīng)用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析研究藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域化妝品行業(yè)要控制和分析：防腐劑、防曬劑、性激素以及維生素等；在公安、刑警破案工作需要投毒藥物、毒品分析等在環(huán)境污染分析中的應(yīng)用廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農(nóng)藥殘留、酚類(lèi)和胺類(lèi)的檢測(cè)

在無(wú)機(jī)離子分析中應(yīng)用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽(yáng)離子分析

二.方法開(kāi)發(fā)的過(guò)程Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.21.得到樣品信息，確定分離目標(biāo)2.確定特定HPLC過(guò)程、樣品預(yù)處理等的需求3.選擇合適的檢測(cè)器4.選擇HPLC方法；初步分離；建立最佳分離條件5.優(yōu)化分離條件6.檢查特定過(guò)程的問(wèn)題及需要7.定量校正8.日常使用的確認(rèn)第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過(guò)此類(lèi)樣品，或有否類(lèi)似樣品的分析方法查文獻(xiàn)和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---儀器制造商的文獻(xiàn)，如Dionex,Waters對(duì)色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開(kāi)發(fā)方法充分了解您自己的樣品分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對(duì)分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求?是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用?分離(制備)時(shí)要了解哪方面的情況？要分離（即制備）的樣品量有多大?要分離的組份在樣品中的含量很高?還是微量?是否需要保持生物活性?對(duì)分離產(chǎn)物純度的要求有多高?純度或活性的鑒定如何完成?使用文獻(xiàn)方法注意點(diǎn)色譜柱填料的種類(lèi)、品牌是否相同?注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長(zhǎng)需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）1）選擇HPLC檢測(cè)器對(duì)樣品有響應(yīng)并有一個(gè)輸出信號(hào)應(yīng)該提供在檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系；并且所設(shè)計(jì)的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系但是：由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線(xiàn)性偏離現(xiàn)象并不是所有的檢測(cè)器是線(xiàn)性的受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測(cè)器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距2）方法開(kāi)發(fā)一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對(duì)較高的流速使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)k’值改變保留值調(diào)節(jié)a值改變選擇性通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)度改變柱效及分離速度反相色譜的方法開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)過(guò)程實(shí)例色譜條件∶色譜柱：C18，4.6mm×15mm流動(dòng)相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度）舉例中用不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：1ml/min方法開(kāi)發(fā)的其他因素流速對(duì)柱效的影響不同內(nèi)徑的色譜柱有自己的最佳流速樣品的進(jìn)樣量(濃度)對(duì)柱效的影響樣品的進(jìn)樣體積對(duì)柱效的影響溶劑粘度對(duì)柱效的影響 以上因素均影響分離度3）液相色譜的方法開(kāi)發(fā)梯度洗脫法液相色譜泵穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速可靠且充分的溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的自動(dòng)溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的梯度形成有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜要考慮滯后體積梯度分析更為關(guān)注目的：在任何情況下保持最高精度梯度的洗脫方式高壓梯度及低壓梯度梯度：高壓混合高壓梯度使用多臺(tái)色譜泵，在泵后混合配置靈活、簡(jiǎn)單，脫氣簡(jiǎn)單易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對(duì)脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計(jì)不當(dāng)，梯度的

準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)

體積）設(shè)計(jì)合理梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無(wú)色譜柱時(shí))滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測(cè)器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意∶滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼器、混合器及其管路比例閥檢測(cè)器進(jìn)樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器梯度滯后大小的影響滯后體積太大會(huì)引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒(méi)有問(wèn)題對(duì)微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會(huì)使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會(huì)使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會(huì)導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為1~4ml（4元泵<400μl，高壓泵<150μl

）滯后體積變化的影響設(shè)計(jì)不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時(shí)間梯度曲線(xiàn)好的梯度滯后曲線(xiàn)保留時(shí)間梯度百分比不好的梯度滯后曲線(xiàn)固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)色譜柱反壓變化對(duì)梯度實(shí)驗(yàn)的影響withoutpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:<1%5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabene5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabenePumpwithpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:>2%Acclaim120,C18,5μm,4.6x100mm;0.5mL/min;25°C;5μLinjectionvolume;UVdetectionat256nm;Eluent(A)Waterand(B)Acetonitril;Gradient:30%bto100%Bin10min;Methyl-,Ethyl-,Propyl-andButylparabene,10mg/Leach梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分離能力增加檢測(cè)靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復(fù)性較低？一般流出問(wèn)題早流出峰的分離度差.遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.由于k’范圍寬，所以分析時(shí)間長(zhǎng).強(qiáng)保留組分造成柱污染.等梯度洗脫-在洗脫樣品的整個(gè)過(guò)程中，流動(dòng)相的組成保持不變.AnalyticalEducationCenterH5929A11-09梯度洗脫-一個(gè)解決方案優(yōu)點(diǎn)

改善分離度

提高檢測(cè)性能

能夠分離復(fù)雜樣品

縮短分析時(shí)間

降低由于強(qiáng)保留組分而使色譜柱性能變差的可能性其他應(yīng)用

柱清洗

方法開(kāi)發(fā)中的嘗試運(yùn)行

梯度洗脫-在分離過(guò)程中改變流動(dòng)相組成.梯度平衡時(shí)間的影響（一）10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)梯度平衡時(shí)間的影響（二）平衡時(shí)間∶6分鐘平衡時(shí)間∶7分鐘平衡時(shí)間∶8分鐘平衡時(shí)間∶9分鐘

平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說(shuō)明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足。高效液相經(jīng)常使用粒徑5um的色譜柱，用過(guò)一段時(shí)間后，柱壓會(huì)略有升高，尤其是做中藥。常用來(lái)洗色譜柱的溶劑為甲醇，當(dāng)色譜柱用甲醇洗過(guò)之后，再用含乙腈的流動(dòng)相平衡，會(huì)使柱壓迅速升高，色譜柱滲漏，這是由于甲醇和乙腈匯合產(chǎn)生局部高壓。因此，這種情況下，應(yīng)慢慢升高流速，可以從0.6ml/min開(kāi)始，一步步的平穩(wěn)柱壓，防止色譜柱漏液。梯度洗脫裝置分兩種：

高壓梯度：用兩臺(tái)高壓輸液泵將兩種溶劑分別輸入，

低壓梯度：在常壓下將兩種或多種溶劑先混合，然后用高壓泵將流動(dòng)相輸入到色譜柱中。梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)：提高分