實驗一常用玻璃器皿的清洗及包扎

實驗一慣用玻璃器皿的清洗及包扎一.目的與規(guī)定熟悉微生物實驗所需多種慣用器皿的名稱和規(guī)格。學(xué)會對的的清洗玻璃器皿的辦法和包扎辦法二.原理為了包裝實驗順利進行，規(guī)定把實驗用器皿清洗干凈，保持滅菌后無菌狀態(tài)，需要對培養(yǎng)皿、吸管等進行妥善包扎，試管和三角瓶要做棉塞。清洗辦法根據(jù)實驗?zāi)康?、器皿的種類、所盛放的物品、洗凈劑的類別和沾污程度等的不同而有所不同，不同的器皿包扎辦法也不同。三.材料與儀器（一）慣用的多種玻璃器皿。（二）洗滌工具和去污粉、肥皂、洗滌液。四.操作環(huán)節(jié)（一）清洗1.新玻璃器皿的清洗新購置的玻璃器皿均含有游離堿，故應(yīng)先將其浸于洗液或2%的鹽酸溶液中數(shù)小時，再用自來水沖洗干凈。2.用過的玻璃器皿的清洗（1）試管、培養(yǎng)皿、三角燒瓶、燒杯可用瓶刷或海綿沾上肥皂、洗衣粉或去污粉等洗滌劑刷洗，然后在用自來水充足沖洗干凈。經(jīng)洗滌后，若內(nèi)壁的水均勻分布在一薄層，表達油垢完全洗凈，若掛有水珠，則需用洗滌液（或洗液）浸泡數(shù)小時，再用自來水充足沖洗，洗滌干凈的器皿倒置與鐵絲框內(nèi)或有空心格子木架上，室內(nèi)晾干。（2）玻璃吸管、滴管普通用完后應(yīng)立刻用清水和蒸餾水浸泡（或沖洗），免得干燥后難以沖洗干凈，如附有污物可用洗液浸泡。（3）載玻片與蓋玻片帶有油污的應(yīng)擦去有無后用熱乙醇、丙酮、二甲苯等溶液浸泡10~15min，溶液油垢然后用水沖洗，再用洗滌液浸泡、沖洗，干后置于95%乙醇中保存?zhèn)溆谩＃ǘ┎Ａ髅蟮陌?.培養(yǎng)皿慣用舊報紙或牛皮紙包緊，普通以5~10套培養(yǎng)皿作一包。包好后進行干熱或濕熱滅菌，如將培養(yǎng)皿放入金屬（不銹鋼）筒內(nèi)進行熱滅，則不必用紙包。2.試管和三角瓶試管管口和三角瓶都需要塞以棉花塞（或泡膜塑料塞），棉花塞的作用是起過濾作用，避免空氣中的微生物進入試管或三角瓶。棉花塞的制作規(guī)定使用棉花塞緊貼玻璃壁，沒有皺紋和縫隙，不能過緊也不能過松，長度不少于管口直徑的二倍，約2/3塞進管口。若干支試管用繩扎在一起，在棉塞部分外包裹牛皮紙或2層舊報紙，再扎好。三角瓶每個單獨用牛皮紙或舊報紙包扎棉塞。3.吸管洗凈烘干后的吸管，在口吸的一端月0.5cm處，用尖頭鑷子或針塞入少量脫脂棉，以免使用時將雜菌吹入其中，或不慎將微生物吸出管外，棉花要塞得松緊恰當。然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報紙的近左端，以45度左右的角度螺旋形卷起來，右端多出的報紙大一小結(jié)，不使散開。五、實驗報告（一）成果檢查實驗效果（二）思考題1.能否用橡皮塞、木塞來替代棉塞，為什么？2.玻璃器皿清洗時應(yīng)注意什么？實驗二普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和使用一、 目的與規(guī)定（一） 學(xué)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造、部分功效及使用辦法。（二） 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理的使用辦法。二、 原理普通光學(xué)顯微鏡由機械裝置和光學(xué)系統(tǒng)2大部分構(gòu)成。在光學(xué)系統(tǒng)中物鏡的性能最為核心，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學(xué)顯微鏡中配備的幾個物鏡以油鏡的放大倍數(shù)最大，與其它物鏡相比，使用較特殊，需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，以增加照明亮度和提高分辨率。三、 材料與儀器（一）菌種金黃色葡萄球菌及枯草桿菌染色玻片標本，啤酒酵母水浸片。（二）其它香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。四、操作環(huán)節(jié)（一）顯微鏡的安置置顯微鏡于平整的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿3~4cm，鏡檢時姿勢要端正。（二）調(diào)節(jié)光源安裝在鏡座內(nèi)的光源燈可通過調(diào)節(jié)電壓以獲得適宜的照明亮度，而使用反光鏡采集自然光或燈光作為照明光源時，應(yīng)根據(jù)光源的強度及所用物鏡的放大倍數(shù)選用凹面或平面反光鏡并調(diào)節(jié)其角度，使視野內(nèi)的光線均勻，亮度適宜。（三）低倍鏡觀察將標本玻片置于載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器使觀察對象處在物鏡的正下方，下降10×物鏡，使其靠近標本，用粗調(diào)節(jié)器（粗調(diào)螺旋）慢慢升起鏡筒，出現(xiàn)圖像后，再用細調(diào)節(jié)器（細調(diào)螺旋）調(diào)節(jié)圖像至清晰。通過標本夾推動器慢慢移動玻片，認真觀察標本各部位，找到適宜目的物，認真觀察。（四）高倍鏡觀察在低倍鏡下找到適宜的觀察目的并將其移至視野中心后，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移至工作位置，對聚光器光圈及視野亮度進行適宜調(diào)節(jié)后微調(diào)細調(diào)節(jié)器使物象清晰，運用推動器移動標本認真觀察并統(tǒng)計。（五）油鏡觀察在低倍鏡或高倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升高約2cm，然后在待觀察區(qū)域滴加1~2滴香柏油，將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接，將聚光器升至最高位置并開足光圈，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒漸漸上升，直至視野中出現(xiàn)物象并用細調(diào)節(jié)器使其清晰為止。（六）顯微鏡用后解決1.上升鏡筒，取下載玻片。2.用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后擦鏡紙蘸少量二甲苯擦去鏡頭上的殘留的油跡，然后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。3.用擦鏡紙清潔其它物鏡和目鏡，用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。4.將各部分還原，反光鏡垂于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八字形“再向下旋，同時把聚光鏡降下，以免物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。五、實驗報告（一）成果分別繪出在不同物鏡下觀察到的不同菌種的形態(tài)，同時注明放大倍數(shù)。（二）思考題1.油鏡與普通物鏡在使用辦法上有何不同？應(yīng)特別注意什么？2.顯微鏡中調(diào)節(jié)光線強弱的裝置有哪些？實驗三酵母菌形態(tài)觀察一、 目的與規(guī)定觀察酵母菌的形態(tài)及出芽繁殖方式。二、 原理大小普通比細菌大幾倍甚至于十幾倍，大多數(shù)的酵母以出芽方式進行無性繁殖，有的二分裂繁殖。用美蘭支制成的水浸片，可觀察酵母的形態(tài)和出芽繁殖方式以及進行死活細胞的鑒別（染成藍色的為死細胞，無色的為活細胞）、三、 材料與儀器（一） 啤酒酵母，假絲酵母，漢遜酵母。（二） 顯微鏡，載玻片，蓋玻片，接種針，酒精燈。（三） 呂氏美藍染液。四、 操作環(huán)節(jié)（一） 在干凈載玻片中央加一滴呂氏美藍染色液，以無菌操作接種環(huán)挑取少量酵母菌體放于美藍液中，混合均勻。（二） 取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下（以免產(chǎn)憤怒泡），使其蓋在菌液上，將多出菌液用吸水紙吸干。（三） 將蓋玻片置于載物臺上，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽狀況，并根據(jù)顏色來區(qū)別死活細胞。（四） 染色約0.5h后再進行觀察，注意四細胞數(shù)量與否增加。五、 實驗報告(一) 成果繪圖闡明你所觀察到的酵母形態(tài)特性。(二) 思考題1. 在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特性區(qū)別于普通細菌？2. 酵母水浸片制作室應(yīng)注意什么？實驗十三培養(yǎng)基的制備一、 目的與規(guī)定(一) 學(xué)習(xí)制備培養(yǎng)基的基本技術(shù)。(二) 制備牛肉膏蛋白瓊脂培養(yǎng)基。二、 原理牛肉膏蛋白培養(yǎng)基時一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基中含有普通細菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，可供繁殖之用。制作固體培養(yǎng)基時須加2%瓊脂，培養(yǎng)細菌時，應(yīng)用烯酸或稀堿將PH調(diào)至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養(yǎng)基的配方：牛肉膏0.%5蛋白胨1%NaCL0.5%pH7.4~7.6.三、 材料與儀器（一） 試劑牛肉膏，蛋白胨，Nacl，瓊脂1mol/L;NaoH1mol/LHCL（二） 其它試管，三角燒杯，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花，牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺秤。四、 操作環(huán)節(jié)(一) 稱量根據(jù)用量按比例依次稱取多種成分，牛肉膏慣用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要快速。(二) 溶解在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，逐個加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需要不停攪拌。加熱時應(yīng)注意火力，勿使培養(yǎng)基燒焦或溢出。溶好后，局限性所需水分。(三) 調(diào)PH用1mol/LNaoH把pH調(diào)至所需范疇。(四) 過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗成果的觀察，如無特殊規(guī)定時可省去此環(huán)節(jié)。(五) 分裝按實驗規(guī)定，可將配備的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，分裝裝置如實驗圖-8所示：分裝時注意，勿使培養(yǎng)基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引發(fā)污染。1．液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，普通以不超出三角瓶容積的1/2為宜。2．固體分裝分裝試管，其裝量不超出量筒的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超出管長的1/2。分裝三角瓶，以不超出容積的1/2為宜。3.半固體分裝裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝（六）加棉塞分裝完畢后，在試管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），以制止外界微生物進入培養(yǎng)基而造成污染，并確保有良好的通氣性能。（七）包扎棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。（八）保存滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以檢查滅菌的效果，無污染方可使用。五、實驗報告（一）成果闡明你配備培養(yǎng)基過程中的狀況。（思考題）1. 培養(yǎng)基配備時應(yīng)注意什么問題？為什么？2. 分裝培養(yǎng)基時為什么要使用彈簧夾？3. 培養(yǎng)基配好后，為什么要立刻滅菌？實驗四干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌一、 目的與規(guī)定二、 原理干熱滅菌時運用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白凝固變形而達成滅菌的目的，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其我省的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固越塊，反之含水量越小，則凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160~170℃），時間長（1~2h）.高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一種密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋內(nèi)水沸騰產(chǎn)生蒸汽，水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)溫度，造成菌體蛋白質(zhì)凝固變形而達成滅菌的目的。普通培養(yǎng)及用0.1MPa(相稱于15Ib/In2或1.05kg/cm2)121.5℃。15~30min可達成徹底滅菌，滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體狀況而有所變化。三、 材料與儀器吸管，培養(yǎng)皿，試管，電熱干燥箱，手提式高壓滅菌蒸汽滅菌鍋，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、蒸餾水。四、 操作環(huán)節(jié)（一） 干熱滅菌法，合用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養(yǎng)基不合用。1. 將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留一定間隙），管好箱門。2. 接通電源，打開排氣孔，使箱內(nèi)濕空氣能逸出，旋動恒溫調(diào)節(jié)器，保持加熱升溫狀態(tài)，至箱內(nèi)達成100℃時關(guān)閉排氣孔。3. 當溫度升到160~170℃時，借恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制，保持此溫度2h。4. 切斷電源，冷卻至70℃時，打開箱門，取出滅菌物品（未將至70℃以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降造成玻璃器皿炸裂）、（二） 高壓蒸汽滅菌1. 首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。2. 放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品（內(nèi)裝培養(yǎng)基或小的三角瓶），不要裝的太擠，以免妨礙蒸汽流通過影響滅菌效果，三角瓶口部要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，旋緊。3. 打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋的冷空氣，待冷空氣排盡后，關(guān)上排氣閥讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐步上升，當鍋內(nèi)達成所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。普通滅菌采用121攝氏度保存20-30分鐘。4. 停止加熱，待壓力表的壓力至零位時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。注意，當壓力不為零時，不能開蓋取物，否則由于壓力忽然下降，容器內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。5. 高壓滅菌鍋上的安全閥，是保障安全使用的重要機構(gòu)，不得隨意調(diào)節(jié)。五、 實驗報告（一） 成果檢查滅菌與否徹底。（二） 思考題1. 干熱滅菌操作過程中應(yīng)注意哪些問題，為什么？2. 為什么干熱滅菌所需溫度要比濕熱滅菌高?3. 高壓蒸汽滅菌時，為什么要排盡鍋內(nèi)的冷空氣？實驗十七微生物的平板菌落基數(shù)法一， 目的與規(guī)定掌握用平板菌落計數(shù)法來測定一定數(shù)量樣品中微生物細胞數(shù)目。二， 原理平板菌落計數(shù)法是通過將樣品制成一系列不同的稀釋液，使樣品中微生物個體分散成當個細胞狀態(tài)。再取一定量的稀釋液接種，使其均勻分部于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后統(tǒng)計菌落數(shù)目，普通認為每一種菌落是由一種細胞增殖后形成，因此可計算出樣品的含菌量。三， 材料與儀器（一） 樣品，無菌水。（二） 培養(yǎng)基普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。（三） 培養(yǎng)皿，恒溫培養(yǎng)箱等。四， 實驗環(huán)節(jié)（一） 樣品解決1，在無菌的條件下，精確稱取10g固體樣品或量取10mL 液體樣品。2將10g固體樣品快速倒入已滅菌的裝有玻璃珠和90mL無菌水的三角瓶中，充足振蕩15—30min,制成稀釋10倍的菌懸液，10ml液體樣品依稀釋10倍。3，用1支試管吸取1mL稀釋10倍的菌液，加入第一支有9ml無菌水的試管中，搖勻后得稀釋100倍的菌液。換用一支試管依次稀釋到103、10……10、10倍，稀釋程度以樣品中可能含有的活菌數(shù)多少而定。（制平板）1.混合平板培養(yǎng)計數(shù)法上述樣品稀釋好后，用吸管取適宜稀釋倍數(shù)的樣品稀釋液1mL,放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，再快速倒入約15mL融化而冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿按順、反時針方向旋轉(zhuǎn)搖動，使樣品稀釋液和培養(yǎng)基混勻，放平，冷卻凝固后倒轉(zhuǎn)放置，在被測微生物最適溫度下培養(yǎng)（每一種稀釋樣品各做三個培養(yǎng)皿），當出現(xiàn)菌落后，用計數(shù)器進行計數(shù)。2.涂抹平板培養(yǎng)計數(shù)法先將融化并冷卻至50℃左右的15ML瓊脂培養(yǎng)基注入已滅菌的培養(yǎng)皿中。放平冷卻凝固后，將不同稀釋度的樣品液0.2mL于培養(yǎng)皿中央，并用玻璃棒均勻地涂抹在平板表面，同意濃度可用一種玻璃棒持續(xù)涂抹。否則，需滅菌后再用。涂抹后的培養(yǎng)皿，暫放幾小時，待稀釋液中的水分干后將培養(yǎng)皿倒置保溫培養(yǎng)，菌落長出后，用計數(shù)器進行計數(shù)。五、實驗報告（一）成果2.計算混合平板培養(yǎng)計算公式：每克樣品菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù)涂抹平板培養(yǎng)計算公式：每克樣品菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù)X5（思考題）平板技術(shù)法的優(yōu)缺點是什么？AYUI;09RAqweLO6EZSGD3A5RTG實驗五酵母菌形態(tài)觀察目的與規(guī)定觀察酵母菌的形態(tài)及出芽繁殖方式。原理大小普通比細菌大幾倍甚至于十幾倍，大多數(shù)的酵母以出芽方式進行無性繁殖，有的二分裂繁殖。用美蘭支制成的水浸片，可觀察酵母的形態(tài)和出芽繁殖方式以及進行死活細胞的鑒別（染成藍色的為死細胞，無色的為活細胞）、材料與儀器啤酒酵母，假絲酵母，漢遜酵母。顯微鏡，載玻片，蓋玻片，接種針，酒精燈。呂氏美藍染液。操作環(huán)節(jié)在干凈載玻片中央加一滴呂氏美藍染色液，以無菌操作接種環(huán)挑取少量酵母菌體放于美藍液中，混合均勻。取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下（以免產(chǎn)憤怒泡），使其蓋在菌液上，將多出菌液用吸水紙吸干。將蓋玻片置于載物臺上，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽狀況，并根據(jù)顏色來區(qū)別死活細胞。染色約0.5h后再進行觀察，注意四細胞數(shù)量與否增加。實驗報告成果繪圖闡明你所觀察到的酵母形態(tài)特性。思考題在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特性區(qū)別于普通細菌？酵母水浸片制作室應(yīng)注意什么？實驗十三培養(yǎng)基的制備目的與規(guī)定學(xué)習(xí)制備培養(yǎng)基的基本技術(shù)。制備牛肉膏蛋白瓊脂培養(yǎng)基。原理牛肉膏蛋白培養(yǎng)基時一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基中含有普通細菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，可供繁殖之用。制作固體培養(yǎng)基時須加2%瓊脂，培養(yǎng)細菌時，應(yīng)用烯酸或稀堿將PH調(diào)至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養(yǎng)基的配方：牛肉膏0.%5蛋白胨1%NaCL0.5%pH7.4~7.6.材料與儀器試劑牛肉膏，蛋白胨，Nacl，瓊脂1mol/L;NaoH1mol/LHCL其它試管，三角燒杯，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花，牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺秤。操作環(huán)節(jié)稱量根據(jù)用量按比例依次稱取多種成分，牛肉膏慣用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要快速。溶解在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，逐個加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需要不停攪拌。加熱時應(yīng)注意火力，勿使培養(yǎng)基燒焦或溢出。溶好后，局限性所需水分。調(diào)PH用1mol/LNaoH把pH調(diào)至所需范疇。過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗成果的觀察，如無特殊規(guī)定時可省去此環(huán)節(jié)。分裝按實驗規(guī)定，可將配備的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，分裝裝置如實驗圖-8所示：分裝時注意，勿使培養(yǎng)基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引發(fā)污染。1．液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，普通以不超出三角瓶容積的1/2為宜。2．固體分裝分裝試管，其裝量不超出量筒的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超出管長的1/2。分裝三角瓶，以不超出容積的1/2為宜。3.半固體分裝裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝（六）加棉塞分裝完畢后，在試管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），以制止外界微生物進入培養(yǎng)基而造成污染，并確保有良好的通氣性能。（七）包扎棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。（八）保存滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以檢查滅菌的效果，無污染方可使用。五、實驗報告（一）成果闡明你配備培養(yǎng)基過程中的狀況。（思考題）培養(yǎng)基配備時應(yīng)注意什么問題？為什么？分裝培養(yǎng)基時為什么要使用彈簧夾？培養(yǎng)基配好后，為什么要立刻滅菌？實驗十三干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌目的與規(guī)定原理干熱滅菌時運用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白凝固變形而達成滅菌的目的，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其我省的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固越塊，反之含水量越小，則凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160~170℃），時間長（1~2h）.高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一種密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋內(nèi)水沸騰產(chǎn)生蒸汽，水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)溫度，造成菌體蛋白質(zhì)凝固變形而達成滅菌的目的。普通培養(yǎng)及用0.1MPa(相稱于15Ib/In2或1.05kg/cm2)121.5℃。15~30min可達成徹底滅菌，滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體狀況而有所變化。材料與儀器吸管，培養(yǎng)皿，試管，電熱干燥箱，手提式高壓滅菌蒸汽滅菌鍋，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、蒸餾水。操作環(huán)節(jié)干熱滅菌法，合用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養(yǎng)基不合用。將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留一定間隙），管好箱門。接通電源，打開排氣孔，使箱內(nèi)濕空氣能逸出，旋動恒溫調(diào)節(jié)器，保持加熱升溫狀態(tài)，至箱內(nèi)達成100℃時關(guān)閉排氣孔。當溫度升到160~170℃時，借恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制，保持此溫度2h。切斷電源，冷卻至70℃時，打開箱門，取出滅菌物品（未將至70℃以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降造成玻璃器皿炸裂）、高壓蒸汽滅菌首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品（內(nèi)裝培養(yǎng)基或小的三角瓶），不要裝的太擠，以免妨礙蒸汽流通過影響滅菌效果，三角瓶口部要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。用電爐或其它辦法加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋的冷空氣，待冷空氣排盡后，關(guān)上排氣閥讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐步上升，當鍋內(nèi)達成所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。停止加熱，待壓力表的壓力至零位時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。注意，當壓力不為零時，不能開蓋取物，否則由于壓力忽然下降，容器內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。高壓滅菌鍋上的安全閥，是保障安全使用的重要機構(gòu)，不得隨意調(diào)節(jié)。實驗報告成果檢查滅菌與否徹底。思考題干熱滅菌操作過程中應(yīng)注意哪些問題，為什么？為什么干熱滅菌所需溫度要比濕熱滅菌高?高壓蒸汽滅菌時，為什么要排盡鍋內(nèi)的冷空氣？實驗十七微生物的平板菌落基數(shù)法一， 目的與規(guī)定掌握用平板菌落計數(shù)法來測定一定數(shù)量樣品中微生物細胞數(shù)目。二， 原理平板菌落計數(shù)法是通過將樣品制成一系列不同的稀釋液，使樣品中微生物個體分散成當個細胞狀態(tài)。再取一定量的稀釋液接種，使其均勻分部于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后統(tǒng)計菌落數(shù)目，普通認為每一種菌落是由一種細胞增殖后形成，因此可計算出樣品的含菌量。三， 材料與儀器（一） 樣品，無菌水。（二） 培養(yǎng)基普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。（三） 培養(yǎng)皿，恒溫培養(yǎng)箱等。四， 實驗環(huán)節(jié)（一） 樣品解決1，在無菌的條件下，精確稱取10g固體樣品或量取10mL 液體樣品。2將10g固體樣品快速倒入已滅菌的裝有玻璃珠和90mL無菌水的三角瓶中，充足振蕩15—30min,制成稀釋10倍的菌懸液，10ml液體樣品依稀釋10倍。3，用1支試管吸取1mL稀釋10倍的菌液，加入第一支有9ml無菌水的試管中，搖勻后得稀釋100倍的菌液。換用一支試管依次稀釋到103、10……10、10倍，稀釋程度以樣品中可能含有的活菌數(shù)多少而定。（制平板）1.混合平板培養(yǎng)計數(shù)法上述樣品稀釋好后，用吸管取適宜稀釋倍數(shù)的樣品稀釋液1mL,放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，再快速倒入約15mL融化而冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿按順、反時針方向旋轉(zhuǎn)搖動，使樣品稀釋液和培養(yǎng)基混勻，放平，冷卻凝固后倒轉(zhuǎn)放置，在被測微生物最適溫度下培養(yǎng)（每一種稀釋樣品各做三個培養(yǎng)皿），當出現(xiàn)菌落后，用計數(shù)器進行計數(shù)。2.涂抹平板培養(yǎng)計數(shù)法先將融化并冷卻至50℃左右的15ML瓊脂培養(yǎng)基注入已滅菌的培養(yǎng)皿中。放平冷卻凝固后，將不同稀釋度的樣品液0.2mL于培養(yǎng)皿中央，并用玻璃棒均勻地涂抹在平板表面，同意濃度可用一種玻璃棒持續(xù)涂抹。否則，需滅菌后再用。涂抹后的培養(yǎng)皿，暫放幾小時，待稀釋液中的水分干后將培養(yǎng)皿倒置保溫培養(yǎng)，菌落長出后，用計數(shù)器進行計數(shù)。五、實驗報告（一）成果2.計算混合平板培養(yǎng)計算公式：每克樣品菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù)涂抹平板培養(yǎng)計算公式：每克樣品菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù)X5（思考題）平板技術(shù)法的優(yōu)缺點是什么？實驗二普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和使用目的與規(guī)定學(xué)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造、部分功效及使用辦法。學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理的使用辦法。原理普通光學(xué)顯微鏡由機械裝置和光學(xué)系統(tǒng)2大部分構(gòu)成。在光學(xué)系統(tǒng)中物鏡的性能最為核心，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學(xué)顯微鏡中配備的幾個物鏡以油鏡的放大倍數(shù)最大，與其它物鏡相比，使用較特殊，需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，以增加照明亮度和提高分辨率。材料與儀器（一）菌種金黃色葡萄球菌及枯草桿菌染色玻片標本，啤酒酵母水浸片。（二）其它香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。四、操作環(huán)節(jié)（一）顯微鏡的安置置顯微鏡于平整的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿3~4cm，鏡檢時姿勢要端正。（二）調(diào)節(jié)光源安裝在鏡座內(nèi)的光源燈可通過調(diào)節(jié)電壓以獲得適宜的照明亮度，而使用反光鏡采集自然光或燈光作為照明光源時，應(yīng)根據(jù)光源的強度及所用物鏡的放大倍數(shù)選用凹面或平面反光鏡并調(diào)節(jié)其角度，使視野內(nèi)的光線均勻，亮度適宜。（三）低倍鏡觀察將標本玻片置于載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器使觀察對象處在物鏡的正下方，下降10×物鏡，使其靠近標本，用粗調(diào)節(jié)器（粗調(diào)螺旋）慢慢升起鏡筒，出現(xiàn)圖像后，再用細調(diào)節(jié)器（細調(diào)螺旋）調(diào)節(jié)圖像至清晰。通過標本夾推動器慢慢移動玻片，認真觀察標本各部位，找到適宜目的物，認真觀察。（四）高倍鏡觀察在低倍鏡下找到適宜的觀察目的并將其移至視野中心后，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移至工作位置，對聚光器光圈及視野亮度進行適宜調(diào)節(jié)后微調(diào)細調(diào)節(jié)器使物象清晰，運用推動器移動標本認真觀察并統(tǒng)計。（五）油鏡觀察在低倍鏡或高倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升高約2cm，然后在待觀察區(qū)域滴加1~2滴香柏油，將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接，將聚光器升至最高位置并開足光圈，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒漸漸上升，直至視野中出現(xiàn)物象并用細調(diào)節(jié)器使其清晰為止。（六）顯微鏡用后解決1.上升鏡筒，取下載玻片。2.用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后擦鏡紙蘸少量二甲苯擦去鏡頭上的殘留的油跡，然后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。3.用擦鏡紙清潔其它物鏡和目鏡，用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。4.將各部分還原，反光鏡垂于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八字形“再向下旋，同時把聚光鏡降下，以免物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。五、實驗報告（一）成果分別繪出在不同物鏡下觀察到的不同菌種的形態(tài)，同時注明放大倍數(shù)。（二）思考題1.油鏡與普通物鏡在使用辦法上有何不同？應(yīng)特別注意什么？2.顯微鏡中調(diào)節(jié)光線強弱的裝置有哪些？實驗五酵母菌形態(tài)觀察一、 目的與規(guī)定觀察酵母菌的形態(tài)及出芽繁殖方式。二、 原理大小普通比細菌大幾倍甚至于十幾倍，大多數(shù)的酵母以出芽方式進行無性繁殖，有的二分裂繁殖。用美蘭支制成的水浸片，可觀察酵母的形態(tài)和出芽繁殖方式以及進行死活細胞的鑒別（染成藍色的為死細胞，無色的為活細胞）、三、 材料與儀器（一） 啤酒酵母，假絲酵母，漢遜酵母。（二） 顯微鏡，載玻片，蓋玻片，接種針，酒精燈。（三） 呂氏美藍染液。四、 操作環(huán)節(jié)（一） 在干凈載玻片中央加一滴呂氏美藍染色液，以無菌操作接種環(huán)挑取少量酵母菌體放于美藍液中，混合均勻。（二） 取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下（以免產(chǎn)憤怒泡），使其蓋在菌液上，將多出菌液用吸水紙吸干。（三） 將蓋玻片置于載物臺上，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽狀況，并根據(jù)顏色來區(qū)別死活細胞。（四） 染色約0.5h后再進行觀察，注意四細胞數(shù)量與否增加。五、 實驗報告(一) 成果繪圖闡明你所觀察到的酵母形態(tài)特性。(二) 思考題1. 在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特性區(qū)別于普通細菌？2. 酵母水浸片制作室應(yīng)注意什么？實驗十三培養(yǎng)基的制備一、 目的與規(guī)定(一) 學(xué)習(xí)制備培養(yǎng)基的基本技術(shù)。(二) 制備牛肉膏蛋白瓊脂培養(yǎng)基。二、 原理牛肉膏蛋白培養(yǎng)基時一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基中含有普通細菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，可供繁殖之用。制作固體培養(yǎng)基時須加2%瓊脂，培養(yǎng)細菌時，應(yīng)用烯酸或稀堿將PH調(diào)至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養(yǎng)基的配方：牛肉膏0.%5蛋白胨1%NaCL0.5%pH7.4~7.6.三、 材料與儀器（一） 試劑牛肉膏，蛋白胨，Nacl，瓊脂1mol/L;NaoH1mol/LHCL（二） 其它試管，三角燒杯，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花，牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺秤。四、 操作環(huán)節(jié)(一) 稱量根據(jù)用量按比例依次稱取多種成分，牛肉膏慣用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要快速。(二) 溶解在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，逐個加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需要不停攪拌。加熱時應(yīng)注意火力，勿使培養(yǎng)基燒焦或溢出。溶好后，局限性所需水分。(三) 調(diào)PH用1mol/LNaoH把pH調(diào)至所需范疇。(四) 過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗成果的觀察，如無特殊規(guī)定時可省去此環(huán)節(jié)。(五) 分裝按實驗規(guī)定，可將配備的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，分裝裝置如實驗圖-8所示：分裝時注意，勿使培養(yǎng)基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引發(fā)污染。1．液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，普通以不超出三角瓶容積的1/2為宜。2．固體分裝分裝試管，其裝量不超出量筒的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超出管長的1/2。分裝三角瓶，以不超出容積的1/2為宜。3.半固體分裝裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝（六）加棉塞分裝完畢后，在試管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），以制止外界微生物進入培養(yǎng)基而造成污染，并確保有良好的通氣性能。（七）包扎棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。（八）保存滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以檢查滅菌的效果，無污染方可使用。五、實驗報告（一）成果闡明你配備培養(yǎng)基過程中的狀況。（思考題）1. 培養(yǎng)基配備時應(yīng)注意什么問題？為什么？2. 分裝培養(yǎng)基時為什么要使用彈簧夾？3. 培養(yǎng)基配好后，為什么要立刻滅菌？實驗十三干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌一、 目的與規(guī)定二、 原理干熱滅菌時運用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白凝固變形而達成滅菌的目的，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其我省的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固越塊，反之含水量越小，則凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160~170℃），時間長（1~2h）.高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一種密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋內(nèi)水沸騰產(chǎn)生蒸汽，水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)溫度，造成菌體蛋白質(zhì)凝固變形而達成滅菌的目的。普通培養(yǎng)及用0.1MPa(相稱于15Ib/In2或1.05kg/cm2)121.5℃。15~30min可達成徹底滅菌，滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體狀況而有所變化。三、 材料與儀器吸管，培養(yǎng)皿，試管，電熱干燥箱，手提式高壓滅菌蒸汽滅菌鍋，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、蒸餾水。四、 操作環(huán)節(jié)（一） 干熱滅菌法，合用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養(yǎng)基不合用。1. 將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留一定間隙），管好箱門。2. 接通電源，打開排氣孔，使箱內(nèi)濕空氣能逸出，旋動恒溫調(diào)節(jié)器，保持加熱升溫狀態(tài)，至箱內(nèi)達成100℃時關(guān)閉排氣孔。3. 當溫度升到160~170℃時，借恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制，保持此溫度2h。4. 切斷電源，冷卻至70℃時，打開箱門，取出滅菌物品（未將至70℃以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降造成玻璃器皿炸裂）、（二） 高壓蒸汽滅菌1. 首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相