米胚芽谷氨酸脫羧酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究

米胚芽谷氨酸脫羧酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究

氨基丙烯酸（gaba）是高等動(dòng)物體內(nèi)的一種非常重要的抑制性神經(jīng)流傳材料之一，在生物體中具有重要的生理功能。谷氨酸脫羧酶(Glutamatedecarboxylase,GAD)是用生物技術(shù)富集生產(chǎn)GABA的關(guān)鍵酶,其廣泛分布于各種生物體中。植物GAD因具有一個(gè)特殊的鈣調(diào)素(CaM)結(jié)合區(qū)域,受Ca2+濃度的調(diào)節(jié),而不同于其他來源的GAD,這使得植物GAD具有更為重要的生物意義。因此,植物來源GAD的分離純化研究受到了廣大科研工作者的重視。目前,已有關(guān)于馬鈴薯、南瓜、矮牽牛、蠶豆、大麥、小麥、山黧豆等幾種植物GAD分離純化的報(bào)道。稻米GAD最早是作為預(yù)測(cè)種子發(fā)芽率的重要指標(biāo),近年來的研究則主要集中在利用米胚芽中的GAD富集生產(chǎn)GABA方面。為進(jìn)一步改善米胚GAD富集生產(chǎn)GABA的工藝條件,對(duì)米胚GAD進(jìn)行分離純化,并了解其分子大小、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是至關(guān)重要的,但目前此方面的研究未見報(bào)道。本研究采用(NH4)2SO4分級(jí)沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜和親和層析等技術(shù),對(duì)米胚芽GAD進(jìn)行分離、純化和鑒定,并研究了米胚GAD的部分酶學(xué)性質(zhì),以期為進(jìn)一步研究米胚GAD的分子生物學(xué)性質(zhì)及米胚GAD富集生產(chǎn)GABA的工藝條件奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1其他a、c、b有關(guān)的催化劑米胚芽由上海糧食儲(chǔ)運(yùn)公司提供,4℃儲(chǔ)存。DEAE-SephroseFF、Superdex200、溴化氰活化的SephroseCL4B,均購于瑞典Pharmacia公司;磷酸吡哆醛(PLP)、苯甲基磺酰氟(PMSF),均購于Amresco公司;SDS和SE-HPLC用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),購于上海西巴斯生物技術(shù)開發(fā)有限公司。1.2dease-puh定義米胚GAD的分離純化步驟見圖1。取米胚芽200g,加入提取液800mL(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,pH5.6,2mmol/L巰基乙醇,2mmol/LEDTA,1mmol/LPLP,1mmol/LPMSF和體積分?jǐn)?shù)10%甘油),用高速分散器打成勻漿,4層紗布過濾,9000g、4℃離心25min,上清液即為米胚GAD提取液。用飽和度為30%～50%的(NH4)2SO4對(duì)提取液進(jìn)行分步鹽析,透析脫鹽后依次進(jìn)行DEAE-SephroseFF,Superdex200和GluSephroseCL4B分離純化。DEAE-SephroseFF條件為:色譜柱為Φ1.6cm×50cm;起始緩沖液為50mmol/L、pH5.6的磷酸鉀緩沖液,內(nèi)含1mmol/LPLP和1mmol/LPMSF;梯度洗脫液為400mL含0～1.4mol/LNaCl的起始緩沖液;流速為10mL/h,每24min收集1管,每管4mL。Superdex200分離條件為:色譜柱為Φ1.0cm×100cm;平衡和洗脫緩沖液為50mmol/L、pH5.6磷酸鉀緩沖液,內(nèi)含1mmol/LPLP和1mmol/LPMSF;流速為12mL/h,每隔10min收集1管,每管2mL。GluSephroseCL4B分離條件為:色譜柱Φ1.0cm×30cm;起始緩沖液為50mmol/L、pH5.6的磷酸鉀緩沖液,內(nèi)含1mmol/LPLP和1mmol/LPMSF,梯度洗脫液為100mL含0～0.5mol/LNaCl的起始緩沖液;流速為10mL/h,每12min收集1管,每管2mL。純化后的酶液用50mmol/L,pH5.6磷酸鉀緩沖液透析脫鹽后,冷凍干燥保存待用。本試驗(yàn)分離純化米胚GAD的過程中所用的緩沖液中都添加了1mmol/LPLP和1mmol/LPMSF,以減少GAD分離純化過程中酶活性的損失。其中PLP是GAD的輔基,無PLP的存在,GAD酶活很低;PMSF可防止粗酶液中蛋白酶對(duì)GAD的分解。1.3gaba含量測(cè)定取100μL酶液,加100μL底物溶液(10mg/mLGlu,pH5.6),40℃反應(yīng)2h,90℃滅活5min,8000r/min離心15min,取上清液,HPLC法測(cè)定GABA含量。以每30min生成1μmol的GABA作為1個(gè)酶活力單位。1.4酶溶液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford法測(cè)定,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。1.5濾紙熱濾冷卻L-谷氨酸銅鹽的制備:稱取0.5g的L-Glu,溶于50mL蒸餾水中,緩慢加入適量的固體堿式碳酸銅,45℃水浴反應(yīng)5h后,用濾紙熱過濾,濾液冷卻備用。Glu的C-1羧基偶聯(lián):將5g溴化氰活化的SephroseCL4B加入50mL上述L-谷氨酸銅鹽溶液中,調(diào)pH為6.0,室溫反應(yīng)24h,蒸餾水洗幾次后抽干、裝柱(1.0cm×30cm),用3倍柱床體積的0.1mol/LEDTA-Na2洗脫,以除去Cu2+,用原子吸收法測(cè)定洗脫下的Cu2+量,計(jì)算偶聯(lián)上的Glu量為1.7μmol/mL。1.6gc/ms檢測(cè)條件采用體積排阻高效液相色譜法(SE-HPLC)測(cè)定粗酶液的相對(duì)分子質(zhì)量分布和純化的GAD酶蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量Mr,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白為參照。SE-HPLC工作條件:色譜柱為:串聯(lián)的KW802.5和KW803;檢測(cè)器為紫外檢測(cè)儀;積分儀為日立-7500;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;流動(dòng)相為50mmol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.0,含0.3mol/LNaCl;進(jìn)樣量為20μL;流速為0.5mL/min。根據(jù)已知分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SE-HPLC色譜柱上的保留時(shí)間tR,作tR-lgMr圖,然后根據(jù)米胚GAD的保留時(shí)間計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量。1.7蛋白質(zhì)含量參照文獻(xiàn)采用SDS電泳方法測(cè)定米胚GAD亞基的相對(duì)分子質(zhì)量,分離膠質(zhì)量濃度為150g/L,板膠厚度為0.75mm,進(jìn)樣量為10μL(酶液蛋白質(zhì)含量為1mg/mL左右)。根據(jù)已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SDS中的相對(duì)遷移率Rf,作Rf-lgMr圖,由米胚GAD的相對(duì)遷移率計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量。1.8一些gad酶特征的測(cè)量1.8.1溫度下的相對(duì)酶活在不同溫度下測(cè)定GAD的酶活性,以酶活最高者為100%,計(jì)算其他溫度下酶液的相對(duì)酶活。將酶液(蛋白質(zhì)含量約為0.2mg/mL)在不同溫度下保溫1h后,迅速冷卻至室溫,測(cè)定酶活力,并以未保溫的酶液在相應(yīng)溫度下的酶活為100%,計(jì)算保溫1h后酶液的相對(duì)酶活。1.8.2酶活力的測(cè)定用濃度為0.1mol/L的醋酸(pH2.0～5.5)、磷酸(pH5.5～7.0)、Tris-HCl(pH7.0～9.0)緩沖溶液配制不同pH的底物和稀釋酶液(蛋白質(zhì)含量約為0.2mg/mL),測(cè)定酶活力,以酶活最高者為100%,計(jì)算GAD在其他pH下酶液的相對(duì)酶活。此外,將酶液用上述不同pH緩沖液稀釋,在室溫下放置1h后,測(cè)定其酶活力,以未放置的酶液在相應(yīng)pH下的酶活為100%,計(jì)算放置1h后酶液的相對(duì)酶活。1.8.3酶活性的測(cè)定將酶液(蛋白質(zhì)含量約為0.2mg/mL)與底物(10g/LGlu,pH5.6)在最適溫度和最適pH下分別反應(yīng)2,4,6,8,10,12,14,16,20,25,30和60min,測(cè)定酶反應(yīng)速度保持初速度的時(shí)間范圍。將酶與不同濃度Glu或PLP在最適溫度和最適pH下以初速度進(jìn)行反應(yīng),測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中GABA的含量,以單位時(shí)間的GABA產(chǎn)量為酶反應(yīng)的初速度,用LineweaverBurk雙倒數(shù)作圖,經(jīng)線性擬合得到回歸直線,求解米胚GAD對(duì)Glu和PLP的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)。1.8.4酶活測(cè)定配制2mmol/L的KCl、KI、MgSO4、MnSO4、Al2(SO4)3、AgNO3、LiSO、CaCl2、EDTA和40mmol/L的SDS溶液,分別與等體積酶液(蛋白質(zhì)含量約為0.2mg/mL)混合,于30℃保溫30min,然后測(cè)定酶的剩余活力,以不加化學(xué)物質(zhì)的酶活力為100%,計(jì)算添加化學(xué)物質(zhì)后酶液的相對(duì)酶活。2結(jié)果與分析2.1美胚gad的分離和精制2.1.1洗脫酶活性測(cè)定由圖2可知,在梯度洗脫過程中,收集到的第20～30管洗脫液具有GAD活力,表明第2個(gè)洗脫液峰有酶活性,酶活峰只有一個(gè),且與洗脫液的A280峰吻合,分離效果較好。2.1.2洗脫曲線比較收集酶液透析除鹽,再經(jīng)過凝膠色譜superdex200分離,洗脫曲線見圖3。由圖3可知,米胚GAD酶活峰出現(xiàn)在第2個(gè)紫外吸收峰的位置,在洗脫體積為50～60mL時(shí)被洗脫下來。2.1.3米胚gad的純化由圖4可見,米胚GAD經(jīng)離子交換色譜和凝膠色譜分離后,在GluSephroseCL4B上仍然能分離2個(gè)蛋白峰,在NaCl濃度達(dá)到0.12mol/L時(shí),GAD開始被洗脫下來,即第2個(gè)A280峰(洗脫液為26～30mL)有酶活性。收集處理酶活峰部位酶液,進(jìn)行SDS電泳,結(jié)果(圖5)表明,GAD為單一區(qū)帶,說明米胚GAD可利用DEAE-SephroseFF離子交換色譜、Superdex200凝膠過濾色譜和GluSephroseCL4B親和層析進(jìn)行純化。分別測(cè)定米胚GAD提取液、(NH4)2SO4分級(jí)沉淀、DEAE-SephroseFF離子交換色譜、Superdex200凝膠過濾色譜和GluSephroseCL4B親和色譜分離純化過程中,各步所收集酶液的酶活力、蛋白質(zhì)含量,結(jié)果見表1。由表1可見,純化后的米胚GAD酶的比活力達(dá)到了223.4U/mg,純化倍數(shù)為65.7,酶活回收率為10.8%。2.2相對(duì)分子質(zhì)量小結(jié)果表明,米胚GAD的相對(duì)分子質(zhì)量為78ku,較大麥GAD(260ku)、小麥GAD(310ku)、山黧豆GAD(140ku)等的相對(duì)分子質(zhì)量小,與馬鈴薯塊莖GAD(90ku)較為接近。說明植物中GAD的相對(duì)分子質(zhì)量差異較大。2.3相對(duì)分子質(zhì)量圖5為純化各階段酶液的SDS圖,利用純化米胚GAD在SDS中的Rf值,可計(jì)算得到米胚GAD亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為40ku,米胚GAD相對(duì)分子質(zhì)量為78ku,由此可推斷,米胚GAD蛋白分子是由2個(gè)相同亞基組成的二聚體,與馬鈴薯塊莖GAD(天然相對(duì)分子質(zhì)量90ku,亞基相對(duì)分子質(zhì)量43ku)相似,但與其他動(dòng)植物的GAD差別較大。2.4美藻gad的酶學(xué)性質(zhì)2.4.1酶液溫度對(duì)酶活的影響由圖6可知,米胚GAD的最適反應(yīng)溫度約為40℃,與山黧豆的GAD最適反應(yīng)溫度(40℃)基本一致,而與南瓜的GAD最適反應(yīng)溫度(60℃)不同,說明不同植物的GAD最適溫度差別較大。將米胚GAD酶液分別置于40,50,60,70,80和90℃的水浴中保溫1h,測(cè)定殘余酶活。結(jié)果(圖7)表明,米胚GAD的熱穩(wěn)定性較差,50℃時(shí)酶活只能維持80%,55℃時(shí)已失活1/2,60℃時(shí)酶活僅剩13%,80℃時(shí)幾乎完全失活。與小麥GAD相比,米胚GAD的熱穩(wěn)定性較差。2.4.2ph對(duì)gad酶活的影響由圖8可以看出,米胚GAD的最適pH為5.6,與一些植物GAD的最適pH相近(如山黧豆GAD的最適pH為5.4,小麥為5.8,南瓜為5.8),而與微生物和動(dòng)物的差別較大。由圖9可見,米胚GAD在較寬的pH范圍內(nèi)(pH4.5～8.0)表現(xiàn)較為穩(wěn)定,均能保持88%以上的酶活;pH在4.5以下或8.5以上時(shí),酶活迅速下降。2.4.3glu的文學(xué)質(zhì)量采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法來測(cè)定米胚GAD的Km和Vmax,結(jié)果顯示米胚GAD對(duì)PLP的Km為1.7μmol/L,Vmax為1.171mg/min;對(duì)Glu的Km值為32.3mmol/L,Vmax為1.159mg/min。米胚GAD對(duì)PLP的Km值與馬鈴薯GAD對(duì)PLP的Km(2.0μmol/L)較為接近,但與鼠腦GAD對(duì)PLP的Km(0.05μmol/L)和人GAD對(duì)PLP的Km(0.13μmol/L)差異較大。2.4.4ca2+對(duì)米胚gad活性的影響從表2可以看出,金屬離子Mg2+、Mn2+、Al3+、Ca2+和Li2+對(duì)米胚GAD的活性未產(chǎn)生顯著的影響,2mmol/L的EDTA對(duì)米胚GAD的活性影響也不大;KCl對(duì)米胚GAD的活性稍有抑制,KI和Ag2+對(duì)米胚GAD的活性有較大抑制作用;SDS對(duì)于米胚GAD的活性有較強(qiáng)的抑制作用。有研究表明,GAD活性受Ca2+的調(diào)節(jié),因此本研究測(cè)定了Ca2+對(duì)米胚GAD的活性的影響。由圖10可以看出,當(dāng)Ca2+濃度在600μmol/L以下時(shí),其對(duì)GAD的活性有較強(qiáng)的激活作用;當(dāng)Ca2+濃度為500μmol/L時(shí),其對(duì)米胚GAD活性的激活作用最強(qiáng),相對(duì)酶活達(dá)到145%。說明,Ca2+對(duì)米胚GAD的活性有較強(qiáng)的激活作用,推測(cè)米胚GAD可能是一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(CaM-bindingprotein,CaMBP),而且鈣依賴的CaMBP。3米胚gad是一種亞基類化合物,其最適添加溫度和時(shí)間、酶活力1)通過(NH4)2SO4分級(jí)沉淀、DEAE-SephroseFF離子交換色譜、Superdex200凝膠過濾色譜和GluSephroseCL4B親和色譜等分離純化技術(shù),從米胚芽中分離得到GAD,經(jīng)SDS鑒定為單一組分,說明米胚GAD得到了有效的純化。米胚GAD的純化倍數(shù)為65.7,酶活力達(dá)223.4U/mg,酶活回收率為10.8%。2)米胚GAD的相對(duì)分子質(zhì)量為78ku,亞基相對(duì)分子質(zhì)量為40ku,說明米胚GAD是由2個(gè)相同亞基構(gòu)成的二聚體。3)米胚GAD的最適反應(yīng)溫度為40℃,最適反應(yīng)pH為5.6。米胚GAD的熱穩(wěn)定性較差,80℃時(shí)酶