第三章 細胞分離與胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解

第三章

微生物細胞破碎1生物分離過程的一般流程本章內(nèi)容2常見的細胞壁結構細胞破碎技術包涵體的純化方法本章的主要內(nèi)容3概述微生物代謝產(chǎn)物大多分泌到細胞外，如大多數(shù)小分子代謝產(chǎn)物，以及細菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶、霉菌產(chǎn)生的糖化酶、淀粉酶等等，稱為胞外產(chǎn)物。但有些目的產(chǎn)物存在于細胞內(nèi)部，如大多數(shù)的酶、蛋白、類脂等，稱為胞內(nèi)產(chǎn)物。自80年代以來，基因工程廣泛應用，許多具有重要價值的生物產(chǎn)品應運而生，如胰島素、白細胞介素、干擾素等。許多基因工程產(chǎn)物都是胞內(nèi)產(chǎn)物，分離提取這些產(chǎn)物時，首先必須將細胞破碎，使產(chǎn)物釋放，才能進一步提取分離。因此，破碎技術已引起了基因工程專家和生化工程專家的極大關注。4概述細胞破碎（cellrupture）技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術。細胞破碎技術是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎。為了研究細胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細胞壁的組成和結構。53.1細胞壁結構對破碎的影響微生物細胞和植物細胞外層均為細胞壁，細胞壁里面是細胞膜，動物細胞沒有細胞壁，僅有細胞膜。通常細胞壁較堅韌，細胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細胞破碎的阻力主要來自于細胞壁。不同細胞壁的結構和組成不完全相同，故細胞壁的機械強度不同，細胞破碎的難易程度也就不同。6細菌細胞壁結構幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶性的聚糖鏈；相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構成了細胞壁的三維網(wǎng)狀結構，包圍在細胞周圍；使細胞具有一定的形狀和強度。7細菌細胞壁結構破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結構，其網(wǎng)結構的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度。革蘭氏陰性菌的細胞壁結構與革蘭氏陽性菌有很大不同。

革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過這種細胞生產(chǎn)了很多細胞重組的產(chǎn)物。藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素大腸桿菌治療侏儒病α-干擾素大腸桿菌治療毛狀細胞白血病等8

酵母細胞壁的結構示意圖最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀，上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復合物。破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結構交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。9真菌的細胞壁真菌的細胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少量的蛋白質(zhì)和脂類。不同的真菌，細胞壁的組成有很大的不同，其中大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構成，少數(shù)含纖維素。與酵母和細菌的細胞壁一樣，真菌細胞壁的強度和聚合物的網(wǎng)狀結構有關，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結構，所以強度有所提高。10紅面包霉菌細胞壁具有同心圓層狀結構主要存在三種聚合物最外層(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2層(b)是糖蛋白的網(wǎng)狀結構第3層(c)主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層(d)主要是幾丁質(zhì)。紅面包霉菌細胞壁的結構示意圖11微生物革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌酵母菌霉菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(zhì)(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂類蛋白質(zhì)細胞壁的組成和結構微生物革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(zhì)(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂類蛋白質(zhì)細胞壁的組成和結構12研磨3.2細胞破碎技術13機械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學破碎有機溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎細胞破碎方法及其原理14一、機械法機械破碎法又可分為高壓勻漿破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（beadgrinding）超聲波破碎法（ultrasonication）15采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成）。1.高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細胞破碎。1617高壓勻漿器的種類高壓勻漿器的種類較多：WAB公司的AVPGaulin31MR型Branandluebbe

公司SHL40型意大利Niro

Soavi高壓勻漿機18高壓勻漿法使用時注意事項高壓勻漿器的操作溫度上升約２-３℃/10MPa為了控制溫度的升高，可在進口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20℃左右?？梢圆捎脝未瓮ㄟ^勻漿器或多次循環(huán)通過等方式。在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。19高壓勻漿法適用的范圍—大規(guī)模細胞破碎的常用方法☆高壓勻漿法適用的范圍：酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎；料液細胞濃度可以很高，20%左右?！畈灰耸褂酶邏簞驖{法。易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）20影響高壓勻漿器細胞破碎因素被破碎的細胞分率符合如下公式：

ln[1/(1-R)]=KNPɑ(3-1)式中R—破碎率，為N次循環(huán)后，蛋白質(zhì)的釋放量Rn與最大釋放量Rm之比；K－與溫度有關的速度常數(shù)；P－操作壓力，MPa；ɑ－與微生物種類有關的常數(shù)。21升高壓力有利于破碎，減少細胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過勻漿閥就可達到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細胞碎片不至過小。但p大到一定值時對勻漿器的磨損增加，也有實驗表明p超生一定值時，R增加但很慢。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55－70Mpa。破碎性能還隨菌體種類和生長環(huán)境的不同而不同大腸桿菌的細胞比酵母細胞容易破碎，生長在簡單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長在復雜培養(yǎng)基上容易破碎。影響高壓勻漿器細胞破碎因素22高壓勻漿法-X-擠壓器改進的高壓方法：將濃縮的菌體懸液冷卻至-25℃至-30℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體在受壓時的相變，包埋在冰中的細胞變形所引起的。主要用于實驗室中。優(yōu)點是適用的范圍廣，破碎率高，細胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高對冷凍-融解敏感的生化物質(zhì)不適用。232）珠磨法beadmill珠磨是常用的方法細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機WSK臥式高效全能珠磨機24高速珠磨機工作原理磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同心軸上的園盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細胞懸浮液和玻離小珠相互攪動；細胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動引起在出口處，旋轉(zhuǎn)園盤和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。由于操作過程中會產(chǎn)生熱量，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細胞懸浮液和玻璃小珠。25NetzschLM-20型珠磨機A-具有冷卻夾套的圓筒形磨室B-具有冷卻裝置的攪拌軸和圓盤C-環(huán)形震動俠縫分離器D-變速馬達1和2料液進出口3和4攪拌冷卻劑進出口5和6磨室冷卻劑進出口園盤以兩種位置交錯地安裝在軸上，一種處于徑向，一種與軸傾斜，徑向盤使磨料沿徑向運動，傾斜盤則產(chǎn)生軸向運動。由于交錯的運動，提高了破碎效率。26珠磨機破碎作用方程破碎作用是相對于時間的一級反應速度過程，符合下列公式：

ln[1/(1-R)]=Kt3-2

R—破碎率；K-一級反應速度常數(shù)；t-時間。K與攪拌轉(zhuǎn)速、細胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑以及溫度等相關。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的困難。273）超聲波破碎超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關。28超聲波破碎的機理JY92-IID超聲波細胞粉碎機一般認為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細胞上造成了剪切力，使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進行。29超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。但超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低由于對冷卻的要求相當苛刻，所以不易放大，但在實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。30

超聲波破碎的效率與聲能、聲頻、處理時間、細胞濃度及菌種類型有關。(1)振幅：振幅直接與聲能有關，影響蛋白質(zhì)釋放的比速度k。(2)細胞懸浮液的黏度：黏度影響能耗并會抑制空穴現(xiàn)象。(3)表面張力：添加表面活性劑或從細胞中釋放出表面活性物質(zhì)(如蛋白質(zhì))，能顯著地影響聲波破碎效率。因為強烈起泡在氣-液界面上會促使蛋白質(zhì)變性和空穴清除，特別是應用高的功率時。(4)被處理懸浮液的體積：大體積需要高的聲能引起強烈的渦流和大的氣泡形成。(5)探頭的形狀和材料。31超聲波破碎是細胞破碎中的一種普通方法，在許多實驗室研究或生化物質(zhì)的分離制備中都能見到，但是要向大量細胞懸浮液中通入足夠的能量是很因難的，故在工業(yè)范圍中還未采用這種破碎方法。一般來講桿菌比球菌易破碎，革蘭氏陰性菌較陽性菌易破碎，對酵母菌的效果較差。32技術原理效果成本舉例勻漿法(孔型)須使細胞通過的小孔，使細胞受到剪切力而破碎劇烈適中細胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細胞懸浮液和植物細胞的大規(guī)模處理超聲波法用超聲波的空穴作用使細胞破碎適中昂貴細胞懸浮液小規(guī)模處理研磨法細胞被研磨物磨碎適中便宜勻漿法(片型)細胞被攪拌器劈碎適中適中動物組織及動物細胞不同機械破碎方法的比較33二非機械法酶溶破碎法（enzymelysis）化學破碎法（chemicaltreatment）去垢劑破碎法（detergents）滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）凍融破碎法（freezingandthawing）其中酶法和化學法溶胞應用最廣。341酶解（酶溶法Enymaticlysis)酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等35外加酶法酶解法的特點是專一性強，因此在選擇酶系統(tǒng)時，必須根據(jù)細胞的結構和化學組成來選擇。溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷鍵，因此主要用于細菌類細胞壁的裂解。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。放線菌的細胞壁結構類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。36外加酶法有時采用幾種酶的混合物會產(chǎn)生更好的效果，加入時需確定相應的次序。對酵母細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結構，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。37酶解法的特點優(yōu)點：發(fā)生酶解的條件溫和能選擇性地釋放產(chǎn)物胞內(nèi)核酸等泄出量少，細胞外形較完整缺點：溶酶價格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶)產(chǎn)物抑制的存在。

38酶解-自溶作用

自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。自溶作用：改變其生長環(huán)境（溫度、ｐＨ、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到自溶目的。缺點是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。39某些化學試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。2化學滲透法（Chemicalpermeation）該法取決于化學試劑的類型以及細胞壁膜的結構與組成。40酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿能溶解細胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細胞內(nèi)滲漏出來。成本低，反應激烈，不具選擇性。（1）酸、堿處理法41細胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；非離子型如TritonX-100和吐溫（Tween）等。對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。（2）表面活性劑無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細胞壁上的脂蛋白結合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解42能分解細胞壁中的磷脂，使細胞結構破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等（3）有機溶劑（4）EDTA螯合劑處理G-細菌，對細胞壁外層有破壞作用。G-細菌的壁外層結構通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。43通用性差；時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%；有些化學試劑有毒?；瘜W試劑的加入常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難，并影響最終產(chǎn)物純度化學滲透法特點：缺點對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。優(yōu)點443物理法滲透壓沖擊法凍結-融化法干燥法451）滲透壓沖擊法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓毎D(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細胞快速膨脹而破裂。僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。462）凍結-融化法

將細胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反復多次而達到破壁作用。一方面能使細胞膜的疏水鍵結構破裂，從而增加細胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。47使細胞結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)3）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥4849選擇破碎方法的依據(jù)：細胞處理量；細胞壁強度和結構(高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度)；目標產(chǎn)物對破碎條件的敏感性；破碎程度；目標產(chǎn)物的選擇性釋放50選擇性釋放目標產(chǎn)物的一般原則⑴僅破壞或破碎存在目標產(chǎn)物的位置周圍當目標產(chǎn)物存在于細胞膜附近時，可采用較混和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結－融化法等。當目標產(chǎn)物存在于細胞質(zhì)內(nèi)時，則需采用強烈的機械破碎法．當目標產(chǎn)物處于與細胞膜或細胞壁結合的狀態(tài)時，調(diào)節(jié)溶液PH值，離子強度或添加與目標產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標產(chǎn)物容易溶解釋放。(2)機械破碎法和化學法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標產(chǎn)物釋放率條件下，降低細胞的破碎程度。51討論題：青霉素?；讣毎扑榈难芯?/p>

一.化學法

20%(W/V)大腸桿菌懸浮液+B.A37℃攪拌高速離心測上清液酶活。1.處理時間

R%

2.5h2.丁酯用量條件：37℃，攪拌3小時適宜的B.A加量為12%，釋放率R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活52二.化學法—凍融法結合

加B.A(12%,37℃攪拌3h）菌懸液凍融(凍結14h融化)

釋放率—70%；比活—2.69u/mg

三.化學—超聲波振蕩法結合

先丁酯處理，再超聲波（90秒），釋放率72%小型設備，不能工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。四.高壓勻漿法

20%(W/V)菌懸液，ΔP=50MPa，N=3。釋放率R=38.4%，原因:細胞破碎后,仍有較多酶吸附在細胞碎片上。五.高壓勻漿—化學法結合

先高壓勻漿，再加10%丁酯，37