第二章 代謝控制發(fā)酵的基本思想

第二章代謝控制發(fā)酵的基本思想§2.1微生物細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制§2.2代謝控制發(fā)酵的基本思想§2.3菌種改造的策略§2.4環(huán)境條件控制§2.1微生物細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制微生物細(xì)胞具有高度適應(yīng)環(huán)境和繁殖的能力。細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)能協(xié)調(diào)地進(jìn)行工作，對(duì)環(huán)境的刺激和信息作出反應(yīng)，進(jìn)行自我調(diào)節(jié)。主要調(diào)節(jié)機(jī)制一、酶活性的控制機(jī)制激活、抑制二、酶合成的控制機(jī)制誘導(dǎo)、阻遏三、通過(guò)細(xì)胞滲透性的控制幾個(gè)概念調(diào)節(jié)酶（regulatoryenzyme）在多酶體系中對(duì)代謝過(guò)程起調(diào)節(jié)作用的酶，一般是反應(yīng)序列中的第一種酶，或是代謝途徑分支點(diǎn)的酶。其催化活性受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制。變構(gòu)酶(allostericenzyme)變構(gòu)酶是具有變構(gòu)效應(yīng)的酶。有些酶除了活性中心外，還有一個(gè)或幾個(gè)部位，當(dāng)特異性分子非共價(jià)地結(jié)合到這些部位時(shí)，可改變酶的構(gòu)象，進(jìn)而改變酶的活性，酶的這種調(diào)節(jié)作用稱(chēng)為變構(gòu)調(diào)節(jié)，受變構(gòu)調(diào)節(jié)的酶稱(chēng)變構(gòu)酶，這些特異性分子稱(chēng)為效應(yīng)劑。

同工酶(isoenzyme)具有同一種酶的底物專(zhuān)一性，但分子結(jié)構(gòu)不同的一類(lèi)酶。多功能酶（multifunctionalenzyme）多功能酶是指多肽鏈上有兩個(gè)或兩個(gè)以上催化活性，能夠催化兩種以上不同反應(yīng)的酶。潛在酶(latentenzyme)酶原、非活性型或與抑制劑結(jié)合的酶。關(guān)鍵酶(keyenzyme)參與代謝調(diào)節(jié)的酶的總稱(chēng)。作為一個(gè)反應(yīng)鏈的限速因子，對(duì)整個(gè)反應(yīng)起限速作用。激活在激活劑的作用下，使原來(lái)無(wú)活性酶轉(zhuǎn)變的有活性或使原來(lái)活性低的酶提高。這種現(xiàn)象稱(chēng)為激活或活化。凡能提高酶活性的物質(zhì)稱(chēng)為激活劑。抑制抑制與激活相反，由于某些物質(zhì)的存在，降低酶活性，稱(chēng)為抑制。抑制可以是不可逆的，這將造成代謝作用的停止；也可以是可逆的，即當(dāng)抑制劑除去后酶活性又恢復(fù)，在代謝調(diào)節(jié)過(guò)程中所發(fā)生的抑制現(xiàn)象主要是可逆的，而且大多屬于反饋抑制。反饋抑制：酶促反應(yīng)的末端產(chǎn)物可抑制在該產(chǎn)物合成過(guò)程中起作用的酶的活性。一、酶活力的調(diào)控通過(guò)改變代謝途徑中一個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵酶的活力，以影響代謝途徑中各中間化合物的流量。這種活力調(diào)節(jié)通常由一特異的小分子代謝物與酶的可逆性結(jié)合來(lái)進(jìn)行。為什么最終產(chǎn)物過(guò)多會(huì)抑制酶，而濃度低時(shí)消失？研究認(rèn)為，受反饋抑制的調(diào)節(jié)酶一般都是變構(gòu)酶，酶活力調(diào)控的實(shí)質(zhì)就是變構(gòu)酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)。變構(gòu)酶分子除了有與底物結(jié)合的活性中心外，還有一個(gè)能與最終產(chǎn)物結(jié)合的部位，稱(chēng)調(diào)節(jié)中心，當(dāng)它與最終產(chǎn)物結(jié)合之后就改變了酶分子的構(gòu)象，從而影響了底物與活性中心的結(jié)合。變構(gòu)酶的作用程序：專(zhuān)一性的代謝物（變構(gòu)效應(yīng)物）與酶蛋白表面的特定部位（變構(gòu)部位）結(jié)合酶分子構(gòu)象發(fā)生變化（變構(gòu)轉(zhuǎn)換）活性中心修飾抑制或促進(jìn)酶活性。(一)變構(gòu)酶的模型1、莫諾德等人的協(xié)調(diào)模型模型要點(diǎn):(1)變構(gòu)酶一般是具有多亞基四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。(2)變構(gòu)酶存在著兩種構(gòu)象狀態(tài)。(3)底物、激活劑或抑制劑可以使兩種狀態(tài)之間的平衡發(fā)生移動(dòng)。(4)變構(gòu)酶蛋白分子具有對(duì)稱(chēng)性，各亞基對(duì)稱(chēng)排列，當(dāng)酶的狀態(tài)發(fā)生改變時(shí)，分子的對(duì)稱(chēng)性仍維持不變。2、科什蘭等人的順序模型構(gòu)象的變化并不是同時(shí)發(fā)生在所有的亞基上，而是僅發(fā)生在結(jié)合有配體的亞基上。由于這一構(gòu)象的變化才使得臨近亞基間發(fā)生相互作用的變化，從而促進(jìn)或減弱了底物與其他亞基的親和力。(二)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)變構(gòu)酶的反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線(xiàn)呈S-型。當(dāng)?shù)孜餄舛裙潭〞r(shí)，變構(gòu)抑制劑濃度與酶反應(yīng)速度之間的關(guān)系也呈S-型曲線(xiàn)。(三)脫敏作用變構(gòu)酶經(jīng)特定處理后，不喪失酶活性而失去對(duì)變構(gòu)效應(yīng)物的敏感作用，稱(chēng)為脫敏作用。方法：(1)利用物理化學(xué)方法使變構(gòu)酶解聚。(2)基因突變。脫敏作用的現(xiàn)象，說(shuō)明了變構(gòu)中心的獨(dú)立性。1、只有一個(gè)終端產(chǎn)物的途徑（單功能途徑）的調(diào)節(jié)方式。⑴終端產(chǎn)物的簡(jiǎn)單（反饋）抑制⑵前體激活或代謝激活⑶補(bǔ)償性激活(四)調(diào)節(jié)類(lèi)型⑴終端產(chǎn)物的簡(jiǎn)單（反饋）抑制判別特征是途徑的終端產(chǎn)物抑制這個(gè)反應(yīng)序列中的第一個(gè)專(zhuān)一性的酶。如在大腸桿菌的從Thr合成Ile的途徑中，Ile對(duì)合成途徑中的第一個(gè)酶（蘇氨酸脫氨酶）的反饋抑制。⑵前體激活(precursoractivation)或代謝激活判別特征：反應(yīng)序列的某一后面的反應(yīng)受前面某中間代謝產(chǎn)物的激活。這種調(diào)節(jié)方式多見(jiàn)于分解代謝途徑，如在大腸桿菌EMP途徑的中間產(chǎn)物FDP激活PK。⑶補(bǔ)償激活(compensatoryactivation)判別特征：如果某一化合物（G）的利用取決于另一反應(yīng)序列（A→D）的運(yùn)行，那么這個(gè)化合物就能激活這個(gè)反應(yīng)序列的第一個(gè)酶。如ATP激活PEP羧化酶，這個(gè)酶催化的反應(yīng)對(duì)Asp以及由此而形成嘧啶核苷酸是必要的。2、多個(gè)終端產(chǎn)物的途徑（分支代謝途徑）的調(diào)節(jié)方式。⑴終產(chǎn)物的多價(jià)抑制⑵終產(chǎn)物的增效性抑制⑶終產(chǎn)物的累積性抑制⑷終產(chǎn)物抑制的補(bǔ)償性逆轉(zhuǎn)⑸順序抑制⑹同功酶的抑制⑴終產(chǎn)物的多價(jià)抑制(multivalentend-productinhibition)，又稱(chēng)協(xié)同反饋抑制。判別特征：分支代謝途徑的兩個(gè)（或多個(gè)）終產(chǎn)物共同地，而不是單獨(dú)地過(guò)量存在時(shí)，對(duì)公共途徑的第一個(gè)酶發(fā)生抑制作用。如谷氨酸棒桿菌的單一的天門(mén)冬氨酸激酶（AK）受終產(chǎn)物L(fēng)ys和Thr的協(xié)同反饋抑制，這種抑制在Lys或Thr單獨(dú)過(guò)量存在時(shí)并不會(huì)發(fā)生。⑵終產(chǎn)物的增效性抑制(synergisticend-productinhibition)或合作反饋抑制。這種調(diào)節(jié)方式與前一個(gè)模式類(lèi)似，但必須注意，在這個(gè)調(diào)節(jié)模式中，各終端產(chǎn)物單獨(dú)過(guò)量存在時(shí)也有抑制作用，終端產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí)，抑制作用加強(qiáng)。如乳糖發(fā)酵短桿菌的AK受Thr和Lys的增效性抑制，即Thr和Lys中任何一個(gè)過(guò)量對(duì)AK均有抑制作用，Thr和Lys同時(shí)存在時(shí)，抑制作用加強(qiáng)。⑶終產(chǎn)物的累積性抑制。判別特征是每一個(gè)最終產(chǎn)物只單獨(dú)地、部分地抑制共同步驟第一個(gè)酶，并且各最終產(chǎn)物的抑制作用互不影響。如大腸桿菌中的谷氨酰胺合成酶受8各終端產(chǎn)物的積累性抑制。⑷終產(chǎn)物抑制的補(bǔ)償性逆轉(zhuǎn)(compensatoryreversalofend-productinhibition)。雖然一個(gè)分支途徑的終產(chǎn)物（E）能完全抑制共同序列的第一個(gè)酶，另一個(gè)分支的前體（I）卻是同一個(gè)酶的激活劑，起到抑制效應(yīng)的對(duì)抗物作用。大腸桿菌中，一個(gè)分支的終產(chǎn)物是UMP，另一個(gè)分支的終產(chǎn)物是Arg。UMP抑制催化共有反應(yīng)的氨甲酰磷酸合成酶。鳥(niǎo)氨酸作為另一個(gè)分支的前體卻能激活這個(gè)酶，以防止它被UMP完全抑制。⑸順序抑制（sequentialinhibition）分支代謝途徑中的末端產(chǎn)物，不能直接抑制代謝途徑中的第一個(gè)酶，而是分別抑制分支點(diǎn)后的反應(yīng)步驟，造成分支點(diǎn)上中間產(chǎn)物的積累，這種高濃度的中間產(chǎn)物再反饋抑制第一個(gè)酶的活性。

如枯草芽孢桿菌芳香族氨基酸的合成途徑中分支點(diǎn)中間產(chǎn)物預(yù)苯酸和分支酸抑制DAHP合成酶，而Trp、Phe和Tyr則分別抑制各自分途徑的第一個(gè)酶。⑹同功酶的抑制（isoenzymeinhibition）共同途徑的第一步由兩個(gè)或更多個(gè)同功酶催化，而分支途徑的終產(chǎn)物則抑制其中之一的同功酶。如大腸桿菌的天門(mén)冬氨酸的合成途徑中，AK有三個(gè)同功酶，其中兩個(gè)同功酶分別受分支途徑的終產(chǎn)Lys和Thr的抑制。3、代謝途徑的橫向調(diào)節(jié)⑴代謝互鎖⑵輔助底物(cosubstrate)和終產(chǎn)物對(duì)另一個(gè)分支途徑的調(diào)節(jié)。⑴代謝互鎖（metabolicinterlock）分支途徑上游的某個(gè)酶（催化G→H反應(yīng)的酶）受到另一條分支途徑的終產(chǎn)物，甚至與本分支途徑幾乎不相關(guān)的代謝中間產(chǎn)物的抑制或激活（X、Y、和D起激活作用，F(xiàn)起抑制作用），使酶的活力受到調(diào)節(jié)。⑵輔助底物(cosubstrate)和終產(chǎn)物對(duì)另一個(gè)分支途徑的調(diào)節(jié)一分支途徑的第一個(gè)酶，受另一分支途徑的輔助底物（D）的抑制和終產(chǎn)物（G）的激活；共同途徑的終產(chǎn)物（即分支點(diǎn)C）形成受分支途徑的終產(chǎn)物（I）的調(diào)節(jié)。二、酶合成的調(diào)控在微生物生物合成體系中，常通過(guò)代謝產(chǎn)物抑制酶的生物合成或誘導(dǎo)酶的生物合成，來(lái)調(diào)節(jié)生物合成的代謝過(guò)程。由代謝終點(diǎn)產(chǎn)物抑制酶合的負(fù)反饋?zhàn)饔梅Q(chēng)為反饋?zhàn)瓒?feedbackrepression)，正反饋稱(chēng)為酶誘導(dǎo)作用(induction)。1、單個(gè)終產(chǎn)物的生物合成途徑。⑴簡(jiǎn)單終產(chǎn)物阻遏⑵受阻遏酶產(chǎn)物的誘導(dǎo)作用⑴簡(jiǎn)單終產(chǎn)物阻遏當(dāng)終產(chǎn)物過(guò)量時(shí)，途徑中所有的酶均被阻遏，當(dāng)終產(chǎn)物濃度受限制時(shí)，阻遏均被解除。如大腸桿菌的Arg、His、Trp等各自合成的途徑就是按這種方式調(diào)節(jié)途徑中各酶的分子數(shù)的。⑵受阻遏酶產(chǎn)物的誘導(dǎo)作用終產(chǎn)物的阻遏只施加在途徑的第一個(gè)酶上，這個(gè)酶催化的反應(yīng)的產(chǎn)物（B）的高濃度，促使其下游的酶的誘導(dǎo)合成。2、多個(gè)終產(chǎn)物的生物合成途徑

⑴多個(gè)單功能酶的簡(jiǎn)單終產(chǎn)物阻遏(2)多功能酶的多價(jià)阻遏⑶催化兩條不同合成途徑的共用酶系的阻遏⑴多個(gè)單功能酶的簡(jiǎn)單終產(chǎn)物阻遏——同功酶阻遏。共同途徑從A到B之間的反應(yīng)受兩個(gè)同功酶的催化，這兩個(gè)同功酶分別受一個(gè)分支的終產(chǎn)物的阻遏。如大腸桿菌的AK有3個(gè)同功酶，它們分別受一個(gè)分支的終產(chǎn)物（Lys、Met、Thr）的阻遏。(2)多功能酶的多價(jià)阻遏(multivalentrepressionofmultifunctionalenzyme)Ea、Eb是多功能酶肽鏈上的兩個(gè)酶，C是它前面的途徑的產(chǎn)物，又是它后面途徑的起始底物。只有當(dāng)途徑的產(chǎn)物C和E均過(guò)量時(shí)，Ea才被阻遏。如大腸桿菌的天門(mén)冬氨酸族氨基酸合成代謝途徑中，AK有3個(gè)同功酶（AKⅠ、AKⅡ、AKⅢ），HD有兩個(gè)同功酶（HDⅠ、HDⅡ）。由AKⅠ和HDⅠ構(gòu)成的多功能酶受Thr和Ile的反饋?zhàn)瓒?。⑶催化兩條不同合成途徑的共用酶系的阻遏。催化兩條不同合成途徑的共用酶系的阻遏必須要兩條途徑的終產(chǎn)物均過(guò)量時(shí)才發(fā)生。如在大腸桿菌中，Ile合成途徑中的５個(gè)酶有４個(gè)同樣都催化Val合成中的對(duì)應(yīng)反應(yīng)步驟，所以這兩種氨基酸均是阻遏這個(gè)酶系所需要的。3、分解代謝途徑⑴分解代謝物阻遏⑵起始底物的誘導(dǎo)作用⑶降解代謝途徑的中間產(chǎn)物所引起的誘導(dǎo)作用⑷匯流降解代謝途徑⑸多功能途徑的誘導(dǎo)⑴分解代謝物阻遏（cataboliterepression）較易被一種微生物降解的化合物或其分解代謝物對(duì)較難被這種微生物降解的化合物降解途徑的阻遏。如葡萄糖、乳糖同時(shí)存在的情況下，大腸桿菌首先降解葡萄糖。葡萄糖的存在和降解阻遏了降解乳糖的酶系的合成。⑵起始底物的誘導(dǎo)作用起始底物誘導(dǎo)其自身被分解的途徑的酶系統(tǒng)。在枯草芽孢桿菌中，His誘導(dǎo)其自身被分解代謝生成Glu的途徑的一系列酶。⑶降解代謝途徑的中間產(chǎn)物所引起的誘導(dǎo)作用起始底物A必須首先被轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)物B后，才能由B誘導(dǎo)合成降解途徑的酶。如大腸桿菌中乳糖的降解，就必須借助基礎(chǔ)水平的（指未經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)的酶水平）β-半乳糖苷酶與乳糖的作用，才能誘導(dǎo)出降解乳糖的酶系，并進(jìn)而誘導(dǎo)出降解乳糖的分解產(chǎn)物半乳糖的酶系。⑷匯流降解代謝途徑兩條可誘導(dǎo)途徑導(dǎo)致一個(gè)共同的中間產(chǎn)物（F），而這個(gè)中間產(chǎn)物進(jìn)一步誘導(dǎo)一條對(duì)兩個(gè)初始底物而言是共同的降解途徑。⑸多功能途徑的誘導(dǎo)兩化合物（A或F，C或H）中的每個(gè)均誘導(dǎo)一些反應(yīng)，從而構(gòu)成一條能降解這兩個(gè)化合物（A和F）的途徑。三、反饋抑制與反饋?zhàn)瓒舻谋容^反饋?zhàn)瓒羰钦{(diào)節(jié)基因作用的結(jié)果，這是生物不通過(guò)基因突變而適應(yīng)于環(huán)境改變的一種“措施”，這種“措施”對(duì)于環(huán)境的改變的反應(yīng)比較遲緩。反饋抑制的物質(zhì)基礎(chǔ)是變構(gòu)酶，通過(guò)酶的變構(gòu)作用，改變酶的活性，因此，反饋抑制的效果比較直接而快速。§2.2代謝控制發(fā)酵的基本思想代謝控制發(fā)酵能否獲得成功，目的產(chǎn)物的產(chǎn)量高低與否，取決于微生物細(xì)胞自我調(diào)節(jié)控制機(jī)制是否能夠被解除和解除得怎么樣。最有效的方法就是造就從遺傳角度解除了微生物正常代謝控制機(jī)制的突變株。一、切斷支路代謝1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株（A-）的應(yīng)用所謂營(yíng)養(yǎng)缺陷型就是指原菌株由于發(fā)生了基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，從而喪失了合成某種物質(zhì)的能力，必須在培養(yǎng)中外源補(bǔ)加該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變型菌株。由于其在合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，致使終產(chǎn)物不能積累，因此，也就遺傳性地解除了終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，使得中間產(chǎn)物或另一分支途徑的末端產(chǎn)物得以積累。（1）積累中間產(chǎn)物PRPP：磷酸核糖焦磷酸PRA：5-磷酸核糖胺5’-IMP：5’-肌苷酸XMP：黃嘌呤GMP：鳥(niǎo)嘌呤SAMP：腺苷琥珀酸AMP：腺嘌呤IR：次黃嘌呤核苷，肌苷例：利用枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型生產(chǎn)肌苷枯草芽孢桿菌中嘌呤核苷酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制肌苷發(fā)酵就是通過(guò)代謝流的阻塞來(lái)消除終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，以達(dá)到中間產(chǎn)物的積累。（2）積累另一分支途徑的終產(chǎn)物在分支合成途徑中，由于存在著多個(gè)終產(chǎn)物單獨(dú)存在時(shí)不能對(duì)其合成途徑的關(guān)鍵酶實(shí)現(xiàn)全部的反饋抑制或阻遏這一現(xiàn)象，因此，可以利用這種機(jī)制選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，造成一個(gè)或兩個(gè)終產(chǎn)物合成缺陷而使另外的終產(chǎn)物得以積累。例：利用高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(Hom-)或蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(Thr-)菌株達(dá)到賴(lài)氨酸的積累。關(guān)鍵酶天冬氨酸激酶不存在不存在同工酶，該酶受賴(lài)氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制。蘇氨酸缺陷型高絲氨酸缺陷型2、滲漏突變株（AL）的應(yīng)用滲漏突變株就是指遺傳性障礙不完全的缺陷型。這種突變是使它的某一種酶的活性下降而不是完全喪失，因此，滲漏缺陷型能夠少量地合成某一種代謝最終產(chǎn)物，能在基本培養(yǎng)基上進(jìn)行少量的生長(zhǎng)。由于滲漏缺陷型不能合成過(guò)量的最終產(chǎn)物，所以不會(huì)造成反饋抑制而影響中間代謝產(chǎn)物的積累。二、解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)1、選育抗類(lèi)似物突變株（Ar）結(jié)構(gòu)類(lèi)似物：在微生物生理學(xué)中是指某些與指定代謝中間產(chǎn)物、合成途徑的終產(chǎn)物等空間結(jié)構(gòu)相似而代謝性能不同的化合物。判別結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的要點(diǎn)：一是空間結(jié)構(gòu)