quechers-分散固相萃取-高效液相色譜法測定魚中氟喹諾酮類藥物

quechers-分散固相萃取-高效液相色譜法測定魚中氟喹諾酮類藥物

氟乙醇（fqs）藥物屬于抗高血壓藥物，廣泛用于預防和處理動物和魚類疾病。但是由于缺乏相應的科學理論指導,藥物的濫用現(xiàn)象較為嚴重,這不僅使得生物體產生耐藥性,而且藥物在其中積累殘留,對人體健康構成威脅。水產品作為日常膳食中蛋白質的重要來源之一,控制其獸藥殘留水平對于人體健康至關重要。因此,迫切需要建立一種快速高效的獸藥殘留檢測方法,以便加強水產品質量安全監(jiān)測。目前,提取動物組織中FQs的前處理方法主要是沉淀蛋白質結合固相萃取(SPE)凈化[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11],此類方法操作繁瑣且耗時,并不適用于快速檢測。Stubbings和Bigwood在QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,RuggedandSafe)前處理技術的基礎上,采用乙腈為提取劑,分散固相萃取(DSPE)凈化,雖然操作簡便,但提取率并不理想。本研究旨在QuEChERS技術的基礎上建立一種新的前處理方法,滿足水產品中FQs藥物殘留的快速、簡便和高效檢測。1實驗部分1.1化學試劑及試劑Agilent1100高效液相色譜儀,配有熒光檢測器;OL-861漩渦震蕩器;Hitachi20PR-520制冷高速離心機;UPWS-超純水系統(tǒng);氮氣鋼瓶及氮吹裝置。依諾沙星(EO)、諾氟沙星(NRF)、鹽酸環(huán)丙沙星(CPFHCl)和恩諾沙星(ERF)(純度>98%,浙江國邦藥業(yè)有限公司);乙腈(色譜純,上海陸都化學試劑廠);冰乙酸(分析純,江蘇強盛化學有限公司);濃鹽酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);檸檬酸(分析純,天津市瑞金特化學品有限公司);三乙胺(化學純,上海試劑三廠);CleanertC18、NH2和PSA(20～40μm,AngelaTechnologies);超純水(自制)。1.2熒光分離器vd色譜柱:ChromatoraxC18column(4.6mm×150mm;5μm)。流動相:0.05mol/L檸檬酸—乙腈(V/V,82∶18),三乙胺調pH至3.5。流速:1.0mL/min。柱溫:30℃。進樣量:20μL。熒光檢測器,激發(fā)波長:280nm,發(fā)射波長:360nm。此條件下,4種FQs能在短時間內得到有效的分離(見圖1)。1.3標準溶液配制FQs標準儲備液:精密稱取鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和依諾沙星標準品各10mg,5mmol/L/LHCl溶解并定容至100mL,置于4℃冰箱內保存,4種標準儲備液的質量濃度均為100μg/mL。FQs混合標準工作液:移取上述4種標準儲備液各1mL于同一10mL棕色容量瓶中,超純水稀釋并定容,配制成質量濃度均為10μg/mL的混合標準工作液。然后用流動相稀釋為5、10、20、50、100、200、500ng/mL的濃度梯度。1.4稀鹽酸+乙腈離心法取新鮮魚脊背肉樣品進行勻漿,置于-20℃冰箱內保存?zhèn)溆谩蚀_稱取2.5g魚脊背肉樣品,置于15mL離心管中,加入1mL稀鹽酸(0.15mol/L)漩渦1min。再加入9mL乙腈(1%乙酸)渦旋1min,4000rpm離心8min。取上清液加入200mgPSA,漩渦1min,離心,取上清液,50℃氮吹,2mL流動相定容,過0.45μm微膜,濾液供HPLC檢測。1.5通過國家標準方法測定魚類中的fqs藥物含量參考國標方法,對魚肉中4種FQs藥物進行了檢測。2結果與討論2.1乙腈1%乙酸的提取根據(jù)文獻報道,FQs更易溶于酸性提取劑中。故本研究采用不同濃度的乙腈-水溶液和乙腈-酸溶液作為提取劑,并進行對比(見表1)。結果顯示,含1%乙酸的乙腈提取效果遠大于純乙腈,這也和文獻報道相一致。當在乙腈和乙腈(1%乙酸)中分別加入不同比例的水和稀鹽酸時,提取效率順序為:90%乙腈(1%乙酸)-鹽酸溶液>90%乙腈(1%乙酸)-水溶液>90%乙腈-水溶液;并且90%乙腈(1%乙酸)-鹽酸溶液>75%乙腈(1%乙酸)-鹽酸溶液≈100%乙腈(1%乙酸)。所以最終選擇90%乙腈(1%乙酸)-鹽酸溶液作為提取劑。2.2不同固體顆粒凈化能力的比較對于魚肉中的FQs藥物殘留,目前采取的凈化方式主要是SPE和DSPE凈化。SPE方法設備比較昂貴,且會造成實驗重現(xiàn)性降低。本實驗采用DSPE凈化法,比較了CleanertC18、NH2和PSA固體顆粒對FQs藥物的吸附作用強弱和凈化能力大小。結果(表2)表明:C18雖凈化能力很強,但對FQs有一定的吸附作用;NH2和PSA對藥物的吸附極小,可忽略不計,但兩者相比,NH2凈化能力較弱,且殘留基質可影響檢測回收率;故最終選擇PSA作為凈化劑。圖2和圖3分別為PSA做凈化劑時,魚肉樣品色譜圖和魚肉加標樣品色譜圖(以鯉為例)。2.3藥物檢出限、測定下限將所配制的系列濃度混合標準溶液,經(jīng)高效液相色譜測定。各藥物的檢出限為三倍基線噪音對應的濃度。線性范圍、回歸方程(y為峰面積;x為質量濃度,ng/mL)、相關系數(shù)以及檢測限見表3。2.4不同添加水平的fqs獸藥殘留測定根據(jù)以上討論,選擇90%乙腈酸溶液作為提取劑、PSA作為凈化劑,以鯉和鲅為研究對象,來提取魚肉樣品中不同添加水平的FQs獸藥殘留,并與國標法做了比較(表4)。實驗結果證明,改進后的QuEChERS前處理方法不僅簡便快速,而且4種藥物回收率較國標法均有很大提高,且均能達到80%以上。3psa的提取本研究在QuEChERS前處理技術