液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)四逆散化學(xué)成分的分析

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)四逆散化學(xué)成分的分析

東漢的《四散》是漢族張仲景記載的《傷寒》。這是中醫(yī)和調(diào)理少陽(yáng)、調(diào)和肝脾的基本方劑。主要由柴胡、白芍、桔梗和甘草組成。具有解邪解郁、平肝理氣、祛瘀理氣、理氣祛瘀的功效。主要用于胃炎、膽腸病、肝臟疾病等。現(xiàn)代研究證明,柴胡中皂苷類成分、白芍中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等成分、枳實(shí)中黃酮類成分、甘草中三萜類成分具有明顯藥理活性,是四逆散治療疾病的效應(yīng)組分。本文采用超高效液相色譜梯度洗脫、電噴霧離子化四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF)聯(lián)用技術(shù),對(duì)四逆散中的主要化學(xué)成分進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步闡明四逆散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為中藥復(fù)方成分的鑒定提供一種快速準(zhǔn)確的方法。1試劑和儀器ACQUITYTMUPLC系統(tǒng)-PDA檢測(cè)器(Waters公司);SynaptTMQ-TOF質(zhì)譜儀(Waters公司),配有Lock-spray接口;電噴霧離子源(ESI);Masslynx4.1質(zhì)譜工作站軟件(Waters公司),Massfragment質(zhì)譜碎片分析軟件(Waters公司);BT125電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);EPED超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)。芍藥苷(110736-200934)、甘草苷(111610-200604)、甘草酸銨(110731-200409)、柚皮苷(110722-200610)、橙皮苷(110721-200211)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;芍藥內(nèi)酯苷(12-1002)購(gòu)自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心;柴胡皂苷A(自制,純度達(dá)98%);乙腈(色譜純,TEDIA公司);甲酸(分析純,Merck公司);超純水(自制)。柴胡產(chǎn)于內(nèi)蒙,白芍產(chǎn)于浙江,炙枳實(shí)產(chǎn)于江西,炙甘草產(chǎn)于新疆,分別為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根,毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根,蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥幼果,豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根莖。2方法2.1柱溫205minmin,3%~5%A;2~8min,5%~15%A;8~10min,15%~20%A;10~15min,20%~45%A;15~20min,45%~55%A;20~23min,55%~75%A;23~27min,75%~95%A;27~30min,95%~5%A。柱溫35℃;流速0.4mL·min-1;進(jìn)樣量1μL。2.2測(cè)定條件及檢測(cè)方法電噴霧離子源(ESI);正、負(fù)離子模式,毛細(xì)管電壓分別為1.4,1.3kV,錐孔電壓分別為40,23V;離子源溫度120℃,脫溶劑氣溫度350℃,錐孔氣流量50L·h-1,脫溶劑氣流量600L·h-1,碰撞能量10~40V,離子能量1V,每0.2s采集1次圖譜;準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用蘆丁溶液為鎖定質(zhì)量溶液。質(zhì)量掃描范圍50~1000。2.3對(duì)照品溶液的配制分別精密稱取芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、甘草酸銨、柚皮苷、橙皮苷、柴胡皂苷A對(duì)照品適量,用70%甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為41,40,30,31,28,32,43mg·L-1的對(duì)照品溶液。2.4甘草味藥材的制備按四逆散原方中的藥材比例,取適量符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的柴胡、白芍、制枳實(shí)、制甘草4味藥材,加入8倍量水,煎煮2次,每次1.5h,過(guò)濾,合并濾液,取濾液60mL置500mL燒杯中,加入140mL無(wú)水乙醇醇沉,靜置過(guò)夜后取醇沉上清液,用0.22μm微孔濾膜濾過(guò),即得。3結(jié)果3.1質(zhì)譜的定性分析用UPLC-ESI-MS對(duì)四逆散中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,(+)ESI-MS和(-)ESI-MS的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)見(jiàn)圖1。模式的總離子流圖3.2逆散中各化學(xué)成分的保留時(shí)間及質(zhì)譜信息通過(guò)UPLC-ESI-MS檢測(cè)得到四逆散中各化學(xué)成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息,并結(jié)合提取離子流圖及與對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比進(jìn)行化學(xué)成分確認(rèn),見(jiàn)表1。3.3質(zhì)譜行為的鑒定tR為7.15min的峰在ESI+,ESI-模式下分別得到m/z為481,479的離子峰,并對(duì)m/z481,479進(jìn)行MS2分析,其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品相一致,據(jù)此確定該化合物為芍藥內(nèi)酯苷。tR為9.40min的峰在ESI+,ESI-模式下分別得到m/z為419,417的離子峰,并對(duì)m/z419,417進(jìn)行MS2分析,其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與甘草苷對(duì)照品相一致,據(jù)此確定該化合物為甘草苷。tR為10.60min的峰在ESI+,ESI-模式下分別得到m/z為481,479的離子峰,并對(duì)m/z481,479進(jìn)行MS2分析,其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與芍藥苷對(duì)照品相一致,據(jù)此確定該化合物為芍藥苷。tR為10.72min的峰在ESI+,ESI-模式下分別得到m/z為581,579的離子峰,并對(duì)m/z581,579進(jìn)行MS2分析,其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與柚皮苷對(duì)照品相一致,據(jù)此確定該化合物為柚皮苷。tR為11.28min的峰在ESI+,ESI-模式下分別得到m/z為611,609的離子峰,并對(duì)m/z611,609進(jìn)行MS2分析,其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與橙皮苷對(duì)照品相一致,據(jù)此確定該化合物為橙皮苷。tR為14.94min的峰在ESI+,ESI-模式下分別得到m/z為823,821的離子峰,并對(duì)m/z823,821進(jìn)行MS2分析,其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與甘草酸對(duì)照品相一致,據(jù)此確定該化合物為甘草酸。tR為15.55min的峰在ESI+,ESI-模式下分別得到m/z為781,779的離子峰,并對(duì)m/z781,779進(jìn)行MS2分析,其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與柴胡皂苷A對(duì)照品相一致,據(jù)此確定該化合物為柴胡皂苷A。3.4化合物結(jié)構(gòu)分析tR為10.47min的峰在ESI+模式下得到m/z為449的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道柴胡中存在槲皮素-3-O-鼠李糖苷,且相對(duì)分子質(zhì)量為448,推測(cè)m/z449為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z449進(jìn)行MS2分析,得到m/z303+,285-等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C21H21O11,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為449.1455,實(shí)測(cè)值為449.1457,據(jù)此推測(cè)該化合物為槲皮素-3-O-鼠李糖苷。tR為10.87min的峰在ESI+模式下得到m/z為419的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道甘草中存在的異甘草苷相對(duì)分子質(zhì)量為418,推測(cè)m/z419為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z419進(jìn)行MS2分析,得到m/z257+,239+,229+等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C21H23O9,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為419.1342,實(shí)測(cè)值為419.1325;此峰在ESI-模式下得到m/z417的離子峰。對(duì)m/z417進(jìn)行MS2分析,得到m/z255-等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,化合物分子式為C21H21O9,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為417.1122,實(shí)測(cè)值為417.1124,據(jù)此推測(cè)該化合物為異甘草苷。tR為11.47min的峰在ESI+模式下得到m/z611的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道枳實(shí)中存在橙皮苷和新橙皮苷,且相對(duì)分子質(zhì)量都為610,推測(cè)m/z611為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z611進(jìn)行MS2分析,得到m/z465+,303+等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,化合物分子式為C28H35O15,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為611.1934,實(shí)測(cè)值為611.1935;此峰在ESI-模式下得到m/z為609的離子峰。對(duì)m/z609進(jìn)行MS2分析,得到m/z463-,301-等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C28H33O15,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為609.1856,實(shí)測(cè)值為609.1854,據(jù)此推測(cè)該化合物為新橙皮苷。tR為12.28min的峰在ESI+模式下得到m/z為465的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道柴胡中存在槲皮素-3-O-葡萄糖苷,且相對(duì)分子質(zhì)量為464,推測(cè)m/z465為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z465進(jìn)行MS2分析,得到m/z303+,285+等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C21H21O12,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為465.1375,實(shí)測(cè)值為465.1373,據(jù)此推測(cè)該化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。tR為13.38min的峰在ESI+模式下得到m/z為273的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道枳實(shí)中存在柚皮素,且相對(duì)分子質(zhì)量為272,推測(cè)m/z273為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z273進(jìn)行MS2分析,得到m/z245+,153+(RDA裂解)等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C15H13O5,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為273.0763,實(shí)測(cè)值為273.0762;此峰在ESI-模式下得到m/z為271的離子峰。對(duì)m/z271進(jìn)行MS2分析,得到m/z151-(RDA裂解)等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C15H11O5,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為271.0606,實(shí)測(cè)值為271.0626,據(jù)此推測(cè)該化合物為柚皮素。tR為13.43min的峰在ESI+模式下得到m/z為985的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道甘草中存在甘草皂苷A3,且相對(duì)分子質(zhì)量為984,推測(cè)m/z985為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z985進(jìn)行MS2分析,得到809+,615+,453+(gluA為葡萄糖醛酸)等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C48H73O21,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為985.4683,實(shí)測(cè)值為985.4684;此峰在ESI-模式下得到m/z為983的離子峰。對(duì)m/z983進(jìn)行MS2分析,得到m/z807+,613+(gluA為葡萄糖醛酸)等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C48H71O21,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為983.4499,實(shí)測(cè)值為983.4500,據(jù)此推測(cè)該化合物為甘草皂苷A3。tR為14.43min的峰在ESI+模式下得到m/z為839的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道甘草中存在甘草皂苷G2,且相對(duì)分子質(zhì)量為838,推測(cè)m/z839為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z839進(jìn)行MS2分析,得到m/z487+,469+(gluA為葡萄糖醛酸)等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C42H63O17,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為839.4089,實(shí)測(cè)值為839.4087,據(jù)此推測(cè)該化合物為甘草皂苷G2。tR為14.60min的峰在ESI+模式下得到m/z為303的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道柴胡中存在槲皮素,且相對(duì)分子質(zhì)量為302,推測(cè)m/z303為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z303進(jìn)行MS2分析,得到285+等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C15H11O7,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為303.0833,實(shí)測(cè)值為303.0829;此峰在ESI-模式下得到m/z為301的離子峰。對(duì)m/z301進(jìn)行MS2分析,得到m/z283-等碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C15H9O7,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為301.1341,實(shí)測(cè)值為301.1334,據(jù)此推測(cè)該化合物為槲皮素。在ESI+模式下,tR為17.45min的峰存在m/z781的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道柴胡中存在柴胡皂苷A,D,且相對(duì)分子質(zhì)量都為780,推測(cè)m/z781為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z781進(jìn)行MS2分析,得到m/z619+,473+,455+等碎片峰,根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C42H69O13,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為781.4769,實(shí)測(cè)值為781.4767,與柴胡皂苷A對(duì)照品有相同的裂解規(guī)律,但質(zhì)譜相應(yīng)豐度不同;此峰在ESI-模式下得到m/z為779的離子峰。對(duì)m/z779進(jìn)行MS2分析,得到m/z617-碎片峰,根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C42H67O13,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為779.4625,實(shí)測(cè)值為779.4624,與柴胡皂苷A對(duì)照品有相同的裂解規(guī)律,但質(zhì)譜相應(yīng)豐度不同。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,使用C18反相色譜柱時(shí),柴胡皂苷A出峰較柴胡皂苷D早,柴胡皂苷A的tR為15.55min,據(jù)此推測(cè),tR17.45min的峰為柴胡皂苷D。tR為21.90min的峰在ESI+模式下得到m/z為471的離子峰。文獻(xiàn)報(bào)道甘草中存在甘草次酸,且相對(duì)分子質(zhì)量為470,推測(cè)m/z471為其準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z471進(jìn)行MS2分析,得到m/z453+碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C30H47O4,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為471.3474,實(shí)測(cè)值為471.3476;此峰在ESI-模式下得到m/z為469的離子峰。對(duì)m/z469進(jìn)行MS2分析,得到m/z425-碎片峰。根據(jù)元素組成分析,該化合物分子式為C30H45O4,相對(duì)分子質(zhì)量理論值為469.3318,實(shí)測(cè)值為469.3344,據(jù)此推測(cè)該化合物為甘草次酸。4質(zhì)譜條件分析本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-ESI-Q-TOF聯(lián)用技術(shù),并結(jié)合了高靈敏度和特異性質(zhì)譜及高分離效率的色譜等優(yōu)點(diǎn),通過(guò)獲得色譜峰準(zhǔn)分子離子,對(duì)四逆散進(jìn)行了化學(xué)成分分析,鑒定出17種四逆散中可能含有的化學(xué)成分。其中芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸及柴胡皂苷A通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照后進(jìn)行確認(rèn),其他成分則通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)聯(lián)用所提供的結(jié)構(gòu)信息加以確認(rèn)。在ESI+模式下,四逆散樣品溶液中的17個(gè)色譜峰,2個(gè)來(lái)自芍藥,5個(gè)來(lái)自柴胡,6個(gè)來(lái)自甘草,4個(gè)來(lái)自枳實(shí);在ESI-模式下,四逆散樣品溶液中的14