好氧發(fā)酵工藝與設(shè)備-好氧發(fā)酵產(chǎn)物的合成機制

第五章好氧發(fā)酵工藝及設(shè)備發(fā)酵工藝與設(shè)備黃力

好氧性發(fā)酵(aerobicfermentation)：在發(fā)酵過程中需要不斷地通入一定量的無菌空氣，如利用黑曲霉進行檸檬酸的發(fā)酵、利用棒狀桿菌進行谷氨酸的發(fā)酵、利用黃單孢菌進黃原膠－多糖的發(fā)酵等等。糖的分解代謝包括EMP（糖的共同分解途徑）和TCA（糖的最后氧化途徑）。第一節(jié)好氧發(fā)酵產(chǎn)物的合成機制

溶氧(DO)是需氧微生物生長所必需。在發(fā)酵過程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。

在28℃氧在發(fā)酵液中的100％的空氣飽和濃度只有0.25mmol

L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在對數(shù)生長期即使發(fā)酵液中的溶氧能達到100％空氣飽和度，若此時中止供氧，發(fā)酵液中溶氧可在幾秒（分）鐘之內(nèi)便耗竭，使溶氧成為限制因素。一、發(fā)酵對氧的需求溶氧對三種不同微生物生長的影響（一）溶解氧對發(fā)酵的影響若溶氧量低，微生物？

若溶氧量過量，微生物？臨界氧濃度:溶解氧的濃度不影響微生物呼吸時的濃度稱為臨界氧濃度。1.影響耗氧的因素影響耗氧因素培養(yǎng)基的成分和濃度顯著影響耗氧菌齡影響耗氧發(fā)酵條件影響耗氧2.臨界氧濃度CCr:

臨界溶氧濃度,指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度。CCrQO2CLO2氣膜氣液界面細胞膜菌絲團發(fā)酵液液膜O2O2細胞液膜氣泡中氧→氣膜→氣液界面→發(fā)酵液→胞外液膜→細胞膜→細胞內(nèi)發(fā)酵液中氧的傳遞途徑雙膜理論氣—液界面氣膜液膜CiCL空氣泡PO2PPi發(fā)酵液氣相液相氣體擴散方向（二）供氧與微生物呼吸代謝的關(guān)系比耗氧速度或呼吸強度（QO2）：單位時間內(nèi)單位重量的細胞所消耗的氧氣，mmolO2·g-1·h-1

攝氧率(r)：單位時間內(nèi)單位體積的發(fā)酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1

r=QO2.X影響需氧的因素

菌體濃度QO2

遺傳因素

菌齡

營養(yǎng)的成分與濃度

有害物質(zhì)的積累

培養(yǎng)條件（三）溶解氧濃度的控制氧傳質(zhì)方程N：體積傳氧速率kmol/m3.

h-1KLa:以(C*-CL)為推動力的體積溶氧系數(shù)h-1cL：發(fā)酵液中氧濃度（kmol/m3）；c*：與氣相中氧分壓p平衡的發(fā)酵液氧濃度（kmol/m3）；設(shè)法提高氧傳遞的推動力和液相體積氧傳遞系數(shù)KLα。2.發(fā)酵液中氧的飽和度C*主要受溫度、罐壓及發(fā)酵液性質(zhì)的影響。而這些參數(shù)在優(yōu)化了的工藝條件下，已經(jīng)很難改變。因此，在實際生產(chǎn)中通常從提高氧的體積傳質(zhì)系數(shù)KLα著手，提高設(shè)備的供氧能力。影響KLα的工藝措施1、攪拌增加溶氧、促進微生物懸浮混合2、空氣流度隨空氣量的增加而使氧傳遞系數(shù)KLα增大3、擋板改變液流的方向，促使液體激烈翻動，增加溶解氧。4、空氣分布管空氣分布管的形式、噴口直徑、管口與罐底距離的相對位置對氧溶解速率有較大的影響。5、加入傳氧中間介質(zhì)一方面起到表面活性劑的作用，降低表面張力，增大了單位體積液體中氣液界面面積；另一方面，在氣泡周圍的氧載體與氣液界面之間形成一層薄膜，增大了通過水膜進入水相的推動力，從而提高了傳氧速率。6、溫度的影響降低發(fā)酵溫度可以得到較高的溶氧值。7、氧分壓增加罐壓和增加空氣中氧的含量可提高溶氧值。二、谷氨酸發(fā)酵機制磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰輔酶A檸檬酸順烏頭酸衣康酸異檸檬酸草酰琥珀酸α－酮戊二酸谷氨酸琥珀酰輔酶A琥珀酸延胡索酸葡萄糖蘋果酸草酰乙酸乙醛酸乙酰輔酶A123316451567891012111413反饋抑制蘋果酸脫氫酶CO2參與嘌呤和嘧啶的合成脂肪酸天冬氨酸參與蛋白質(zhì)合成參與蛋白質(zhì)合成丙酮酸脫氫酶（三）谷氨酸生物合成代謝調(diào)節(jié)（1）完全氧化能力降低（生物素亞適量）（2）蛋白質(zhì)合成能力降低（α－酮戊二酸）（3）環(huán)境條件對谷氨酸合成的調(diào)節(jié)（4）增加細胞膜對谷氨酸的滲透性谷氨酸產(chǎn)生菌因環(huán)境條件變化而引起的發(fā)酵轉(zhuǎn)換環(huán)境因子發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)換溶解氧谷氨酸乳酸和琥珀酸α－酮戊二酸（通氣不足）（適中）（通風過量，轉(zhuǎn)速過快）NH4+α－酮戊二酸谷氨酸谷氨酰胺（適量）（缺乏）（過量）pH值谷氨酰胺，N-乙酰谷酰胺谷氨酸（pH值5～8，NH4+過多）（中性或微堿性）磷酸纈氨酸谷氨酸（高濃度磷酸鹽）（磷酸鹽適中）生物素乳酸或琥珀酸谷氨酸（過量）（限量）影響谷氨酸產(chǎn)生菌細胞膜通透性的物質(zhì)生物素油酸表面活性劑其作用是引起細胞膜的脂肪成分的改變，尤其是改變油酸的含量，從而改變細胞膜通透性一二青霉素：抑制細胞壁的合成甘油化學法物理法：針對溫度敏感型菌株，只需要控制溫度即可三、檸檬酸發(fā)酵機制檸檬酸又名枸櫞酸，學名α-羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產(chǎn)物之一?；瘜W名稱2-羥基丙三羧酸，英文俗名citricacid，分子式C6H8O7。無色或白色晶體，無臭，味極酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反應(yīng)。菌種：黑曲霉(Aspergillus.niger)

原料：糖，乙醇，乙酸

途徑：EMP（HMP）丙酮酸羧化

TCA循環(huán)黑曲霉生長，EMP與HMP途徑的比率是2：1；生產(chǎn)檸檬酸時為4：1。葡萄糖檸檬酸(citricacid)

理論轉(zhuǎn)化率？（一）檸檬酸產(chǎn)生菌檸檬酸產(chǎn)生菌青霉屬毛霉屬其他（真菌或細菌）黑曲霉作為高產(chǎn)檸檬酸的特征以葡萄糖為唯一碳源時生長受到限制能夠耐受住高濃度葡萄糖，且大量產(chǎn)生活力高的酸性α-淀粉酶和糖化酶能夠耐受住但不分解高濃度的檸檬酸抗微量金屬離子可產(chǎn)生菌絲球具有旁系呼吸鏈活性，利用葡萄糖時產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生ATP（二）檸檬酸的生物合成途徑若要大量積累檸檬酸，我們該如何做？1.阻斷代謝途徑2.要設(shè)法滿足菌體代謝活動最基本需求（三）檸檬酸生物合成中的代謝調(diào)節(jié)與控制可通過哪些代謝途徑的調(diào)節(jié)或調(diào)控方式達到積累檸檬酸的目的？1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的調(diào)節(jié)2.Mn2+的調(diào)節(jié)

Mn2+

缺乏為何會使NH4+濃度升高呢？當培養(yǎng)基中Mn2+

缺乏時，微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），這些氨基酸的積累，意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣NH4+的消耗下降，NH4+濃度就會升高。3.順烏頭酸酶活性的控制在控制Fe2+含量的情況下，順烏頭酸酶活性低，從而使檸檬酸積累，順烏頭酸酶在催化時建立如下平衡，檸檬酸：順烏頭酸酶：異檸檬酸=90：3：7。4.及時補加草酰乙酸外加草酰乙酸選育回補途徑旺盛的菌種措施5.溶氧濃度對檸檬酸發(fā)酵的影響乙酰CoA和草酰乙酸結(jié)合生成檸檬酸過程中要引進一個氧原子，因此氧也可以看作為檸檬酸生物合成底物。它對檸檬酸發(fā)酵的作用為：(1)氧是發(fā)酵過程生成的NADH2重新氧化的氫受體。(2)近來的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中除了具有一條標準呼吸鏈以外，還有一條側(cè)系呼吸鏈。

當缺氧時，只要很短時間中斷供氧，就會導致此側(cè)系呼吸鏈的不可逆失活，而導致檸檬酸產(chǎn)酸急劇下降。

小結(jié)：

積累檸檬酸應(yīng)采取的措施：想方設(shè)法提高檸檬酸合成反應(yīng)所需酶的活力；

必須切斷檸檬酸的去路；順烏頭酸酶失活，

TCA循環(huán)阻斷。保證中間產(chǎn)物的供給；草酰乙酸的及時供給。

（四）檸檬酸的產(chǎn)率1.葡萄糖丙酮酸乙酰輔酶A（CH3CO-CoA）2.葡萄糖丙酮酸四碳二羧酸檸檬酸（C6H8O7）檸檬酸積累機理概括如下：1）錳缺乏抑制蛋白質(zhì)的合成，而導致細胞內(nèi)的NH4濃度升高和一條呼吸活性強的側(cè)系呼吸鏈不產(chǎn)生ATP，其解除了對磷酸果糖激酶的代謝調(diào)節(jié)，促進了EMP途徑暢通。2）由組成型的丙酮酸羧化酶源源不斷提供草酰乙酸。3）在控制Fe2+含量的情況下，順烏頭酸酶活性低，從而使檸檬酸積累，順烏頭酸酶在催化時建立如下平衡，檸檬酸：順烏頭酸酶：異檸檬酸=90：3：7。4）丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA和CO2固定兩個反應(yīng)平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強了合成檸檬酸能力。5）檸檬酸積累增多，pH低，在低pH時，順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，從而進一步促進了檸檬酸自身的積累。四、其他好氧發(fā)酵產(chǎn)物的合成（一）核苷酸發(fā)酵核苷酸由堿基、核糖、磷酸組成。

核苷酸類中的肌苷酸（IMP）、鳥苷酸（GMP）、黃苷酸（XMP）呈強鮮味。如：肌苷酸鈉比味精鮮40倍，鳥苷酸鈉比味精鮮160倍。

5’－鳥苷酸

5’－肌苷酸

5’－黃苷酸（guanylicacid）（inosinicacid）（xanthylicacid）

5’-GMP

>

5’-IMP>5’-XMP（1）核苷酸的生物合成途徑從頭合成途徑（denovo途徑）由氨基酸、磷酸戊糖、CO2和NH3合成核苷酸。嘌呤核苷酸：直接生成次黃嘌呤核苷酸（IMP）,然后轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌堰屎塑账帷?/p>

葡萄糖

HMP

5’－磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸（PRPP）

PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶

5’-IMP腺苷酸腺苷酸琥珀酸

黃苷酸

鳥苷酸（2）補救合成途徑（salvagesynthesis）微生物從培養(yǎng)基中取得完整的嘌呤、戊糖、磷酸，直接合成單核苷酸。當全生物合成途徑受阻時，微生物可通過此途徑合成核苷酸。2.核苷酸生物合成的代謝調(diào)控PRPPPRAIMPXMPGMPSAMPAMP反饋阻遏PRPPPRAIMPXMPGMPSAMPAMPGDPADPATPGTP反饋抑制1.GMP+AMP阻遏PRPP轉(zhuǎn)酰苷酶形成

2.ATP是XMP合成GMP反應(yīng)的供能體

GTP是SAMP合成AMP反應(yīng)的供能體

3.若大量合成IMP，則培養(yǎng)基中不能有組氨酸的存在（二）抗生素發(fā)酵什么是初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物？抗生素是屬于初級代謝產(chǎn)物還是次級代謝產(chǎn)物？初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物分別在什么時期產(chǎn)生？1.次級代謝產(chǎn)物的特征次級代謝產(chǎn)物是由微生物產(chǎn)生的，不參與微生物的生長和繁殖。次級代謝產(chǎn)物的生物合成是與初級代謝產(chǎn)物合成無關(guān)的遺傳物質(zhì)有關(guān)次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵經(jīng)歷兩個階段，即營養(yǎng)增殖期（trophophase）和生產(chǎn)期（idiophase）一般都產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相類似的多種副組分生產(chǎn)能力受微量金屬離子和磷酸鹽等