高效液相色譜法測定l02人胎肝細胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽

高效液相色譜法測定l02人胎肝細胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽

氨基葡萄糖是一種由谷氨酸、半胱酸和甘氨酸合成的三醇衍生物。廣泛存在于各類組織細胞內(nèi)。動物體內(nèi)的谷胱甘肽主要由肝細胞分泌,大部分以還原型谷胱甘肽(GSH)的形式存在,在氧化脅迫(oxidativestress)等特定條件下可被氧化成氧化型的谷胱甘肽(GSSG)。GSSG/GSH比值是反映機體氧化還原狀態(tài)的重要指標,多種病理損傷可致氧化脅迫,造成該比值升高,如神經(jīng)退行性疾病,心血管疾病,癌癥等。精確測定組織或細胞內(nèi)GSSG和GSH水平,以反映組織氧化脅迫狀態(tài)十分必要。已有文獻報道了采用高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)法檢測血漿或組織中GSH的方法,但對于細胞內(nèi)GSH與GSSG的含量精確測定未見相關(guān)報道。本文利用HPLC定量測定正常及處于氧化脅迫狀態(tài)下L02人胎肝細胞中GSH、GSSG含量,并以GSSG/GSH比值作為細胞內(nèi)氧化脅迫狀態(tài)指標,以期建立可靠、準確、專屬性強的細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)指標及標準化測定方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細胞植物L02人胎肝細胞,購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。1.1.2siga-aldrity公司的紡粘設備還原型谷胱甘肽標準品(Sigma-Aldrich公司,純度≥99.0%);5,5’-二硫代雙硝基苯甲酸(DT-NB,Sigma-Aldrich公司,純度≥99.0%);二硫蘇糖醇(DTT,Sigma-Aldrich公司,純度≥99.0%);TritonX-100(北京拜爾迪生物公司,純度>99.0%);甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)為色譜純;優(yōu)級胎牛血清(FBS,浙江天杭生物科技有限公司);RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.3儀器、設備和儀器Agilent1100Series高效液相色譜儀及色譜工作站(Agilent公司),TGL-16G-A-高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠),普通顯微鏡(濟南強勝光電儀器有限公司),AL104型分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司),BCM-1000型生物凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司),MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱(三洋電器有限公司),IX71倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。1.1.4保護柱和檢測波長XB-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm,WelchMaterials,Inc),保護柱為C18柱(4mm×2mm,Phenomenex公司),流動相為0.05mol/LpH5.6醋酸鈉緩沖液-甲醇(93∶7,V∶V),流速為0.8mL/min,檢測波長為320nm,柱溫為40℃,進樣量為20μL。1.1.5溶液的制備1.2方法1.2.1細胞正常與損傷將L02細胞按4×105/mL的密度接種到含15%胎牛血清FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中,細胞分為正常組,H2O2損傷組。培養(yǎng)12小時后,H2O2損傷組加入終濃度為100μmol/LH2O2,共孵育1h后,胰酶消化,收集細胞,4℃下1000g離心10min,棄上清收集并處理細胞。1.2.2重組蛋白的制備將細胞沉淀懸浮于100μLPBS中,再加入40μL0.3mmol/L的EDTA和100μL2%TrironX-100,渦旋混合1min,裂解細胞。細胞裂解液分兩份,一份以Lowry法測定蛋白含量;余下裂解液加入200μL0.15g/mL的三氯乙酸沉淀蛋白,4℃下10000g離心10min,收集上清液。1.2.3測定固氮基因的測定1.2.3.dtnb-h3po4溶液的制備取130μL上清液,加入0.5mL500μmol/LpH8.9的Tris-HCl溶液,混合均勻,加入20μL純水,再加入350μL10mmol/L的DTNB溶液,振蕩混勻,室溫反應5min,再加入100μL7.0mol/L的H3PO4溶液重新酸化。10000g離心10min,上清液過0.45μm的微孔濾膜后,進行高效液相色譜分析。1.2.3.高效液相色譜分析取130μL上清液,加入0.5mL500μmol/LpH8.9的Tris-HCl溶液,混勻,加入20μL10mmol/L的DTT,反應5min,向體系中加入350μL10mmol/L的DTNB溶液,作用5min,再加入100μL7.0mol/L的H3PO4溶液重新酸化。10000g離心10min,上清液過0.45μm的微孔濾膜后,進行高效液相色譜分析。氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量按照以下公式計算:1.2.4處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)以ue003±S表示,采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù),各組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析,P<0.05有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果與分析2.1gsh-tnb的測定DTNB是定量巰基化合物常用的衍生劑,其與GSH反應生成衍生物GSH-TNB及陰離子TNB,GSH-TNB的量可以直接反映出GSH的量。測定結(jié)果見圖1。圖1顯示:本實驗條件下TNB、GSH-TNB、DTNB的保留時間分別為5、19、26min左右,GSH-TNB保留時間固定,峰形良好,無雜質(zhì)峰干擾測定(圖1)。2.2gsh檢測方法取L02細胞懸浮于100μLPBS中,取80μL于1.5ml離心管中,加入20μLGSH標準曲線工作液或加入20μLPBS(作為空白對照),按“細胞處理”項處理細胞,測定GSH含量。以GSH峰面積對進樣濃度繪制標準曲線,得線性回歸方程為Y=376.25X-1.2523(R2=0.9990)。在0.1~2mmol/L范圍內(nèi)線性良好,最低定量限為0.1mmol/L。2.3細胞相對標準偏差的測定按“線性關(guān)系”項下操作,得到含GSH標準品分別為0.1,0.5,1.0mmol/L的低、中、高3個濃度的細胞樣品,每個樣品測定5次,共測定3日,并與標準曲線同時進行,由標準曲線計算各樣品的濃度,計算其相對標準偏差。經(jīng)統(tǒng)計分析得到的日內(nèi)和日間精密度RSD值均小于10%,說明本方法精密度良好,結(jié)果見表1。2.4標準回歸率2.5穩(wěn)定性2.5.1gsh的穩(wěn)定性測定結(jié)果見表3。將新配制的儲備液在-20℃凍存,分別在30、60、90d取出,用PBS稀釋成濃度分別為0.2、0.5和1.0mmol/L的測定液,每個濃度平行配制3份進行測定,結(jié)果表3顯示:儲備液稀釋的3個濃度的相對標準偏差均小于10%,說明GSH在3個月內(nèi)穩(wěn)定(表3)。2.5.2l2細胞樣品衍生化后的GSH的穩(wěn)定性從3個水平進行測定,即L02細胞和含0.2、0.5mmol/LGSH標準品的L02細胞樣品。樣品儲存于-20℃冷凍,分別在0、0.5、1、2、5d測定GSH含量,結(jié)果表明3個水平GSH的相對標準偏差均小于10%(表4)。2.6細胞內(nèi)gsh和gssg的測定將L02細胞按4×105/mL的密度接種到含15%胎牛血清FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中,按“細胞培養(yǎng)”及“細胞處理”項處理,L02細胞中GSH和GSSG的測定結(jié)果見表5。由表5可知:與正常組相比,氧化損傷組的GSSG含量上升,GSSG/GSH比值明顯升高。3抗氧化活性的提高DTNB是定量巰基化合物常用的衍生劑,其與GSH反應生成衍生物GSH-TNB及陰離子TNB。TNB在412nm處有強吸收,因此之前通過分光光度法測定TNB,間接反映GSH的含量,但經(jīng)常被在測定波長下有吸收的其他物質(zhì)干擾,而不能準確測定。近幾年高效液相色譜法因其良好的專屬性,靈敏度而用于GSH的測定,并因其具有良好的分離功能,能夠把衍生物GSH-TNB與陰離子TNB分開,通過測定GSH-TNB直接確定GSH的含量。GSSG的測定利用還原劑DTT將GSSG還原成GSH,測定總的GSH,再減去還原前測定的GSH量,即為GSSG的量。高效液相色譜系統(tǒng)中,生物樣品中蛋白質(zhì)的去除至關(guān)重要,樣品中殘留的蛋白會對色譜柱造成損傷。TCA能夠除去樣品中的蛋白得到澄清的上清,達到高效液相色譜分析的標準。影響GSH測定的一個重要的因素就是GSH的氧化,GSH氧化形成GSSG,而使樣品中測得的GSH量比實際值偏低。酸化樣品能夠阻止GSH中的巰基離子化形成更容易被氧化的巰基陰離子,從而減少GSH的氧化。另外,在肝細胞中含有一些降解GSH的酶,例如γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶,GSH是其催化反應的底物,它參與GSH降解的第一步。因此,酸化樣品及冰浴操作可以降低γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的活性,減少GSH的降解。對生物樣品進行酸化是非常必要的,但DTT的還原力受pH的影響,只有pH大于7時,-SH脫去質(zhì)子形成-S-才具有反應活性。另外衍生化試劑DTNB在中性條件下的反應性和穩(wěn)定性比酸性條件下好。因處理樣品時對樣品進行了酸化,所以在還原或衍生化之前加入Tris-HCl緩沖液,使體系達到反應的最佳pH。H2O2造成細胞氧化損傷是經(jīng)典的氧化損傷模型,H2O2不僅能直接氧化細胞膜上的脂質(zhì)及蛋白,而且能自由穿過細胞膜進入胞質(zhì)。GSH是細胞內(nèi)重要的抗氧化劑,它是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的底物,該酶消耗GSH把H2O2還原成水,在這個過程中GSH氧化成GSSG,從而使胞內(nèi)的GSSG/GSH比例改變。H2O2造模的損傷程度與其濃度,作用時間,細胞類型及密度有關(guān)。實驗結(jié)果表明選用4×105/mL密度的L02細胞,用100μmol/L的H2O2作用1h,可顯著提高GSSG的水平,使GSSG/GSH的比值升高。本方法準確,精密,線性關(guān)系良好,穩(wěn)定性高,可用于細胞中GSH的測定。并且此方法能夠檢測出正常及處于氧化脅迫條件下L02細胞中GSSG/GSH比值的變化,可作為檢驗氧化模型建立是否成功的方法之一,為體外抗氧化劑的篩選和研究奠定基礎。用PBS(NaCl137.0mmol/L,KCl2.7mmol/L,Na2HPO410.0mmol/L,KH2PO42.0mmol/L,pH7.4)溶解GSH,得到20mmol/L的GSH儲備液。用PBS稀釋儲備液得到0.5~10mmol/L的工作液。精密稱取198mg的DTNB于50mL容量瓶中,用0.5mol/L的K2HPO4溶解定容得到10mmol/L的DTNB工作液。精密稱取15.4mg的DTT于10mL容量瓶中,用水溶解定容得到