白藜蘆醇的壓縮法純化研究

白藜蘆醇的壓縮法純化研究

近年來的研究表明，白銀醇是一種含有特定激素的非黃酮類多酚類化合物，具有重要的生理功能。它可以抑制癌細(xì)胞，抑制心血管疾病，抵抗抗菌，阻力和抗衰竭。它被稱為紫杉醇，是紫杉醇之后的一種新的綠色抗癌藥物。引起了許多專家和科學(xué)家的注意，并進(jìn)行了大量研究。硅膠柱層析法是目前廣泛使用的一種分離純化技術(shù)。本世紀(jì)初俄國植物學(xué)家M.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其他色素?，F(xiàn)在層析法已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)以及其他領(lǐng)域內(nèi)有效的分離分析工具之一。近年來,也有學(xué)者將其應(yīng)用于菝葜、劍葉龍血樹、毛脈蓼等植物中白藜蘆醇的分離。還有蘇文強(qiáng)等采用中壓柱層析法對(duì)虎杖中白藜蘆醇粗提液進(jìn)行純化,然后經(jīng)重結(jié)晶后,可使白藜蘆醇的純度達(dá)到99%以上。但是還未看到有花生根中白藜蘆醇的硅膠柱層析分離純化的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,而且也沒有文獻(xiàn)系統(tǒng)地進(jìn)行硅膠柱純化白黎蘆醇的工藝研究,因此本文采用硅膠柱層析法對(duì)花生根中白藜蘆醇的大孔樹脂純化物進(jìn)一步分離純化進(jìn)行了研究,確定了硅膠柱層析純化白藜蘆醇的各項(xiàng)工藝條件。1材料和方法1.1-2-甲基苯基氨基羧酸白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(resveratrol>99%):美國Sigma公司;200~300目柱層析用硅膠、硅膠G薄層層析用硅膠:青島海洋化工廠;羧甲基纖維素鈉(AR)、氯仿(AR)、甲醇(GR)、丙酮(AR)、石油醚(AR)、乙酸乙酯(AR)、甲酸(AR)、乙腈(AR):湖南師大化學(xué)試劑廠。薄層層析顯色器;薄層層析展開槽(20cm×20cm×10cm);薄層層析薄層板(20cm×10cm);毛細(xì)管點(diǎn)樣器(0.5mm);層析柱(1.6cm×30cm);高效液相分析儀(P680泵,UVD170監(jiān)測(cè)器):美國戴安公司;微孔濾膜(0.22μm)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1超聲波提取工藝使用冷凍干燥法對(duì)花生根樣品進(jìn)行干燥處理(時(shí)間12h)。用中藥粉碎機(jī)對(duì)干燥樣品進(jìn)行粉碎,過40目篩。以乙醇濃度73%,超聲功率290W,萃取時(shí)間5.6min,液料比17.5∶1為萃取條件,進(jìn)行超聲波提取。將提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到濃度為0.5mg/mL后,經(jīng)大孔樹脂柱層析純化,得到白藜蘆醇乙醇溶液,經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到膏狀物,然后經(jīng)真空冷凍干燥得到白藜蘆醇粗品,備用。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1)色譜條件:色譜柱HypercloneC18柱(250mm×4.60mm×5μm);流動(dòng)相(水∶乙腈)=70∶30;流速0.6mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)305nm;進(jìn)樣量20μL。(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置:準(zhǔn)確稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5.70mg,用甲醇定容于25mL容量瓶中,搖勻。使用移液槍分別移取0.5、1、2、4、8mL于10mL容量瓶中,配制成白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)。對(duì)配制好的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè),得到在11.286、22.572、45.144、90.288、180.576μg/mL濃度下HPLC的峰面積。以標(biāo)樣濃度為x軸,得到的峰面積為y軸,進(jìn)行線性回歸得到白藜蘆醇的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)以及白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜(圖5)。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:式中:y為白藜蘆純峰面積。x為白藜蘆醇濃度,線形范圍為11.26~100.576μg/mL。(3)樣品處理:硅膠層析柱純化得到的白藜蘆醇洗脫液使用氮吹儀吹干有機(jī)溶劑,然后溶解于甲醇中,再經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC色譜分析。1.2.3樣品點(diǎn)樣、展開線(1)鋪板:先配制0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液。以1∶3的比例溶解薄層層析用硅膠6g于研缽中。研磨勻漿無固體顆粒及氣泡,然后傾倒在玻璃板上,抖動(dòng)玻璃板使之平整。然后在室溫下晾干,使用前在105~110℃烘焙0.5~1h即可。(2)點(diǎn)樣:固體樣品通常溶解在甲醇中配成1%~5%的溶液,用內(nèi)徑為0.5mm的平口毛細(xì)管吸取樣品溶液點(diǎn)樣。點(diǎn)樣前可用鉛筆在距薄層板一端約1cm處輕輕地畫一條水平橫線作為“起始線”。然后將樣品溶液小心地點(diǎn)在“起始線”上。(3)展開:把點(diǎn)好樣的薄層板放進(jìn)展開槽中展開。當(dāng)展開劑前沿升至距薄層板上端約1cm處時(shí),取出薄層板并立即標(biāo)記出前沿位置。(4)現(xiàn)色:1%鐵氰化鉀水溶液-2%的三氯化鐵水溶液使用前等體積混合,使用顯色器噴在展開的薄層板上。1.2.4粗樹林表面白饋柱的純化(1)硅膠的活化:將硅膠置于烘箱中,在105~110℃最佳活化條件下,保持30min,進(jìn)行活化處理,然后即可裝柱。(2)裝柱:本實(shí)驗(yàn)采用濕法裝柱、濕法上樣。選取合適的玻璃柱,稱取適量的硅膠(200~30目)放入燒杯中,然后加入石油醚或氯仿,使液面高出硅膠面2cm,然后放入真空干燥箱中抽真空約1h,抽去其中空氣。然后準(zhǔn)備一支較長(zhǎng)的玻璃棒,在裝柱時(shí)邊倒硅膠石油醚混合液邊用玻璃棒攪拌使硅膠均勻沉降,并且使硅膠一次加完。全部吸附劑加完后,在吸附劑沉積面上蓋上一張直徑與柱內(nèi)徑相當(dāng)?shù)臑V紙片。(3)上樣:將大孔樹脂純化后的白藜蘆醇粗粉溶于盡可能少的甲醇中,然后打開柱下活塞小心放出柱中液體至液面下降到濾紙片處,關(guān)閉活塞,將甲醇溶液沿著柱內(nèi)壁緩緩加入。(4)洗脫:樣品加入后即加入大量洗脫溶劑洗脫。事先準(zhǔn)備30個(gè)收集瓶,依次編出號(hào)碼,各接收相同體積的流出液,并各自在薄層板上點(diǎn)樣展開,然后在薄層板上顯色。1.2.5展開劑的選擇(1)薄層層析法選擇洗脫溶劑:在活化好的薄層板上點(diǎn)樣,分別是白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品和大孔樹脂純化后的樣品,然后放入展開槽中展開。分別選擇展開劑為氯仿:甲醇=4:1~10:1進(jìn)行展開,然后記錄展開后的薄層板的特征并計(jì)算各個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)的值。式中:Rf為比移值;a為原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離;(2)柱層析選擇:使用經(jīng)薄層層析確定的洗脫溶劑比例范圍進(jìn)行洗脫,然后用50mL三角瓶分段收集洗脫液,各個(gè)收集瓶中的洗脫液用薄層板進(jìn)行檢測(cè),尋找白藜蘆醇所在的洗脫瓶,確定分離效果最好的洗脫劑比例。1.2.6大孔樹脂的hplc純度檢測(cè)準(zhǔn)確稱取200~300目100g硅膠進(jìn)行裝柱,分別稱取大孔樹脂純化后的粉末5.00、3.33、2.50、2.00、1.67、1.25g,用適量的甲醇溶解,然后上樣洗脫,收集得到的目標(biāo)成分進(jìn)行HPLC純度檢測(cè)。1.2.7純度試驗(yàn)，純產(chǎn)品的純度準(zhǔn)確稱取5.00mg硅膠柱層析純化后的結(jié)晶產(chǎn)物,定溶于100mL的容量瓶中,進(jìn)行HPLC檢測(cè)。2結(jié)果與分析2.1反滲透膜柱的下一步實(shí)驗(yàn)(1)由薄層層析法實(shí)驗(yàn)得到表1,薄層層析的Rf值處于0.2~0.4之間的展開劑比例適用于硅膠柱層析,而且視覺觀察也明顯證明其比例能夠使目標(biāo)成分與其他雜質(zhì)分離,因此確定氯仿與甲醇的比例為9∶1、10∶1,進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。(2)柱層析法選擇如圖2所示,在洗脫溶劑為氯仿和甲醇的比例為9∶1時(shí),可以把白藜蘆醇和其他雜質(zhì)分離,能夠作為洗脫溶劑應(yīng)用于硅膠柱層析,另外由于增大氯仿比例時(shí),同時(shí)也會(huì)增加淋洗的時(shí)間以及洗脫的溶劑量,因此選擇氯仿與甲醇比例為9∶1為最佳洗脫溶劑。圖3為柱層析純化后的目標(biāo)成分與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的薄層層析展開圖,由此可以確定其目標(biāo)成分與標(biāo)準(zhǔn)品是同一物質(zhì),即反式白藜蘆醇。2.2進(jìn)料量對(duì)白堊系黃粱醇上樣的影響使用上述討論確定的洗脫溶劑,即氯仿∶甲醇=9∶1時(shí),不同上樣量的條件下洗脫得到的白藜蘆醇樣品經(jīng)HPLC檢測(cè)其純度得到圖4。隨著進(jìn)料量的增加,層析吸附平衡從等溫線的線性范圍向非線性范圍移動(dòng)當(dāng)進(jìn)料量很大時(shí),層析柱吸附平衡往往處在非線性范圍。當(dāng)填料量與上樣量之比為50∶1時(shí)白藜蘆醇的純度不再增加,可以確定其上樣量為2.0g,其純度可以超過99%以上,且不浪費(fèi)硅膠填料。而且由圖5、圖6可以看出,經(jīng)硅膠柱層析純化后的針狀結(jié)晶產(chǎn)物,就是實(shí)驗(yàn)所要求得到的目標(biāo)產(chǎn)物反式白藜蘆醇。3硅膠柱層析和流動(dòng)相的選擇(1)經(jīng)大孔樹脂純化后的樣品粉末,通過一次硅膠柱層析,得到的白藜蘆醇針狀結(jié)晶,其純度可以超過99%。(2)通過薄層層析和硅膠柱層析對(duì)洗脫溶劑的研究發(fā)現(xiàn),在氯仿與甲醇之比為9∶1時(shí),對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物即可達(dá)到很好的分離。(3)在不同的吸附劑與樣品量之比進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)條件下,通過硅膠柱層析得到的白藜蘆醇純化產(chǎn)物,然后使用HPLC檢測(cè)其純度,發(fā)現(xiàn)在吸附劑與樣品量之比50∶1時(shí)白藜蘆醇的純度即可以達(dá)到最高。硅膠是氫鍵型固定相,其表面的終端是硅醇或硅氧烷。硅氧烷不具吸附性,硅醇基能與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵,具有吸附性,因此硅膠對(duì)復(fù)雜有機(jī)化合物地分離具有很高地效率。另外硅膠具有其他較多的優(yōu)點(diǎn),如線性容量較高,機(jī)械