白藜蘆醇的壓縮法純化研究

白藜蘆醇的壓縮法純化研究

近年來的研究表明，白銀醇是一種含有特定激素的非黃酮類多酚類化合物，具有重要的生理功能。它可以抑制癌細胞，抑制心血管疾病，抵抗抗菌，阻力和抗衰竭。它被稱為紫杉醇，是紫杉醇之后的一種新的綠色抗癌藥物。引起了許多專家和科學家的注意，并進行了大量研究。硅膠柱層析法是目前廣泛使用的一種分離純化技術(shù)。本世紀初俄國植物學家M.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其他色素?，F(xiàn)在層析法已成為生物化學、分子生物學以及其他領(lǐng)域內(nèi)有效的分離分析工具之一。近年來,也有學者將其應用于菝葜、劍葉龍血樹、毛脈蓼等植物中白藜蘆醇的分離。還有蘇文強等采用中壓柱層析法對虎杖中白藜蘆醇粗提液進行純化,然后經(jīng)重結(jié)晶后,可使白藜蘆醇的純度達到99%以上。但是還未看到有花生根中白藜蘆醇的硅膠柱層析分離純化的相關(guān)文獻報道,而且也沒有文獻系統(tǒng)地進行硅膠柱純化白黎蘆醇的工藝研究,因此本文采用硅膠柱層析法對花生根中白藜蘆醇的大孔樹脂純化物進一步分離純化進行了研究,確定了硅膠柱層析純化白藜蘆醇的各項工藝條件。1材料和方法1.1-2-甲基苯基氨基羧酸白藜蘆醇標準品(resveratrol>99%):美國Sigma公司;200~300目柱層析用硅膠、硅膠G薄層層析用硅膠:青島海洋化工廠;羧甲基纖維素鈉(AR)、氯仿(AR)、甲醇(GR)、丙酮(AR)、石油醚(AR)、乙酸乙酯(AR)、甲酸(AR)、乙腈(AR):湖南師大化學試劑廠。薄層層析顯色器;薄層層析展開槽(20cm×20cm×10cm);薄層層析薄層板(20cm×10cm);毛細管點樣器(0.5mm);層析柱(1.6cm×30cm);高效液相分析儀(P680泵,UVD170監(jiān)測器):美國戴安公司;微孔濾膜(0.22μm)。1.2實驗方法1.2.1超聲波提取工藝使用冷凍干燥法對花生根樣品進行干燥處理(時間12h)。用中藥粉碎機對干燥樣品進行粉碎,過40目篩。以乙醇濃度73%,超聲功率290W,萃取時間5.6min,液料比17.5∶1為萃取條件,進行超聲波提取。將提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到濃度為0.5mg/mL后,經(jīng)大孔樹脂柱層析純化,得到白藜蘆醇乙醇溶液,經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到膏狀物,然后經(jīng)真空冷凍干燥得到白藜蘆醇粗品,備用。1.2.2標準曲線的繪制(1)色譜條件:色譜柱HypercloneC18柱(250mm×4.60mm×5μm);流動相(水∶乙腈)=70∶30;流速0.6mL/min;紫外檢測波長305nm;進樣量20μL。(2)標準溶液的配置:準確稱取白藜蘆醇標準品5.70mg,用甲醇定容于25mL容量瓶中,搖勻。使用移液槍分別移取0.5、1、2、4、8mL于10mL容量瓶中,配制成白藜蘆醇標準溶液,然后分別進行HPLC檢測。對配制好的白藜蘆醇標準品溶液進行HPLC檢測,得到在11.286、22.572、45.144、90.288、180.576μg/mL濃度下HPLC的峰面積。以標樣濃度為x軸,得到的峰面積為y軸,進行線性回歸得到白藜蘆醇的HPLC標準曲線(圖1)以及白藜蘆醇的標準品液相色譜(圖5)。標準曲線方程:式中:y為白藜蘆純峰面積。x為白藜蘆醇濃度,線形范圍為11.26~100.576μg/mL。(3)樣品處理:硅膠層析柱純化得到的白藜蘆醇洗脫液使用氮吹儀吹干有機溶劑,然后溶解于甲醇中,再經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進行HPLC色譜分析。1.2.3樣品點樣、展開線(1)鋪板:先配制0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液。以1∶3的比例溶解薄層層析用硅膠6g于研缽中。研磨勻漿無固體顆粒及氣泡,然后傾倒在玻璃板上,抖動玻璃板使之平整。然后在室溫下晾干,使用前在105~110℃烘焙0.5~1h即可。(2)點樣:固體樣品通常溶解在甲醇中配成1%~5%的溶液,用內(nèi)徑為0.5mm的平口毛細管吸取樣品溶液點樣。點樣前可用鉛筆在距薄層板一端約1cm處輕輕地畫一條水平橫線作為“起始線”。然后將樣品溶液小心地點在“起始線”上。(3)展開:把點好樣的薄層板放進展開槽中展開。當展開劑前沿升至距薄層板上端約1cm處時,取出薄層板并立即標記出前沿位置。(4)現(xiàn)色:1%鐵氰化鉀水溶液-2%的三氯化鐵水溶液使用前等體積混合,使用顯色器噴在展開的薄層板上。1.2.4粗樹林表面白饋柱的純化(1)硅膠的活化:將硅膠置于烘箱中,在105~110℃最佳活化條件下,保持30min,進行活化處理,然后即可裝柱。(2)裝柱:本實驗采用濕法裝柱、濕法上樣。選取合適的玻璃柱,稱取適量的硅膠(200~30目)放入燒杯中,然后加入石油醚或氯仿,使液面高出硅膠面2cm,然后放入真空干燥箱中抽真空約1h,抽去其中空氣。然后準備一支較長的玻璃棒,在裝柱時邊倒硅膠石油醚混合液邊用玻璃棒攪拌使硅膠均勻沉降,并且使硅膠一次加完。全部吸附劑加完后,在吸附劑沉積面上蓋上一張直徑與柱內(nèi)徑相當?shù)臑V紙片。(3)上樣:將大孔樹脂純化后的白藜蘆醇粗粉溶于盡可能少的甲醇中,然后打開柱下活塞小心放出柱中液體至液面下降到濾紙片處,關(guān)閉活塞,將甲醇溶液沿著柱內(nèi)壁緩緩加入。(4)洗脫:樣品加入后即加入大量洗脫溶劑洗脫。事先準備30個收集瓶,依次編出號碼,各接收相同體積的流出液,并各自在薄層板上點樣展開,然后在薄層板上顯色。1.2.5展開劑的選擇(1)薄層層析法選擇洗脫溶劑:在活化好的薄層板上點樣,分別是白藜蘆醇標準品和大孔樹脂純化后的樣品,然后放入展開槽中展開。分別選擇展開劑為氯仿:甲醇=4:1~10:1進行展開,然后記錄展開后的薄層板的特征并計算各個點樣點的值。式中:Rf為比移值;a為原點到斑點中心的距離;(2)柱層析選擇:使用經(jīng)薄層層析確定的洗脫溶劑比例范圍進行洗脫,然后用50mL三角瓶分段收集洗脫液,各個收集瓶中的洗脫液用薄層板進行檢測,尋找白藜蘆醇所在的洗脫瓶,確定分離效果最好的洗脫劑比例。1.2.6大孔樹脂的hplc純度檢測準確稱取200~300目100g硅膠進行裝柱,分別稱取大孔樹脂純化后的粉末5.00、3.33、2.50、2.00、1.67、1.25g,用適量的甲醇溶解,然后上樣洗脫,收集得到的目標成分進行HPLC純度檢測。1.2.7純度試驗，純產(chǎn)品的純度準確稱取5.00mg硅膠柱層析純化后的結(jié)晶產(chǎn)物,定溶于100mL的容量瓶中,進行HPLC檢測。2結(jié)果與分析2.1反滲透膜柱的下一步實驗(1)由薄層層析法實驗得到表1,薄層層析的Rf值處于0.2~0.4之間的展開劑比例適用于硅膠柱層析,而且視覺觀察也明顯證明其比例能夠使目標成分與其他雜質(zhì)分離,因此確定氯仿與甲醇的比例為9∶1、10∶1,進行下一步實驗。(2)柱層析法選擇如圖2所示,在洗脫溶劑為氯仿和甲醇的比例為9∶1時,可以把白藜蘆醇和其他雜質(zhì)分離,能夠作為洗脫溶劑應用于硅膠柱層析,另外由于增大氯仿比例時,同時也會增加淋洗的時間以及洗脫的溶劑量,因此選擇氯仿與甲醇比例為9∶1為最佳洗脫溶劑。圖3為柱層析純化后的目標成分與白藜蘆醇標準品的薄層層析展開圖,由此可以確定其目標成分與標準品是同一物質(zhì),即反式白藜蘆醇。2.2進料量對白堊系黃粱醇上樣的影響使用上述討論確定的洗脫溶劑,即氯仿∶甲醇=9∶1時,不同上樣量的條件下洗脫得到的白藜蘆醇樣品經(jīng)HPLC檢測其純度得到圖4。隨著進料量的增加,層析吸附平衡從等溫線的線性范圍向非線性范圍移動當進料量很大時,層析柱吸附平衡往往處在非線性范圍。當填料量與上樣量之比為50∶1時白藜蘆醇的純度不再增加,可以確定其上樣量為2.0g,其純度可以超過99%以上,且不浪費硅膠填料。而且由圖5、圖6可以看出,經(jīng)硅膠柱層析純化后的針狀結(jié)晶產(chǎn)物,就是實驗所要求得到的目標產(chǎn)物反式白藜蘆醇。3硅膠柱層析和流動相的選擇(1)經(jīng)大孔樹脂純化后的樣品粉末,通過一次硅膠柱層析,得到的白藜蘆醇針狀結(jié)晶,其純度可以超過99%。(2)通過薄層層析和硅膠柱層析對洗脫溶劑的研究發(fā)現(xiàn),在氯仿與甲醇之比為9∶1時,對目標產(chǎn)物即可達到很好的分離。(3)在不同的吸附劑與樣品量之比進行的實驗條件下,通過硅膠柱層析得到的白藜蘆醇純化產(chǎn)物,然后使用HPLC檢測其純度,發(fā)現(xiàn)在吸附劑與樣品量之比50∶1時白藜蘆醇的純度即可以達到最高。硅膠是氫鍵型固定相,其表面的終端是硅醇或硅氧烷。硅氧烷不具吸附性,硅醇基能與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵,具有吸附性,因此硅膠對復雜有機化合物地分離具有很高地效率。另外硅膠具有其他較多的優(yōu)點,如線性容量較高,機械