熱灸法對(duì)延髓背側(cè)網(wǎng)狀亞核神經(jīng)元活動(dòng)的影響

熱灸法對(duì)延髓背側(cè)網(wǎng)狀亞核神經(jīng)元活動(dòng)的影響

艾灸和艾灸是獲得疾病寒熱效果的關(guān)鍵。艾灸療法的本質(zhì)是加熱刺激的結(jié)果，它刺激皮膚感受器，刺激神經(jīng)系統(tǒng)的功能，刺激神經(jīng)。只有當(dāng)達(dá)到一定的艾灸量時(shí)，身體才能產(chǎn)生反應(yīng)。灸量包括艾灸面積、艾灸溫度、艾灸時(shí)間。艾灸面積和艾灸溫度是臨床上不易控制的因素,這方面的研究甚少。近年來,一些實(shí)驗(yàn)室注意到大鼠和猴的延髓背側(cè)網(wǎng)狀亞核(subnucleusreticularisdorsalis,SRD)在感覺感受過程中具有鮮明的特性,這些神經(jīng)元能特異地被全身傷害性刺激激活,異位傷害性信息在SRD神經(jīng)元上發(fā)生會(huì)聚。本項(xiàng)研究利用可對(duì)分級(jí)強(qiáng)度和分級(jí)面積刺激發(fā)生規(guī)律應(yīng)答反應(yīng)的SRD全身異覺異位會(huì)聚神經(jīng)元作為觀察對(duì)象,探討不同面積和不同溫度的熱灸樣刺激對(duì)全身異覺異位會(huì)聚神經(jīng)元的量-效激活反應(yīng),以期闡明最佳熱灸刺激參數(shù),用于指導(dǎo)臨床。1材料和方法1.1麻醉動(dòng)物選用清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量220～300g,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK-(軍)2007-004。用10%烏拉坦(1.0～1.5g/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)過程遵循2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。1.2微創(chuàng)手術(shù)的方法首先,給予大鼠腹腔注射阿托品100μg,行氣管插管術(shù),然后移至立體定位儀,于顱骨正中切皮膚,暴露顱骨,用操縱桿垂直頂住顱骨,使大鼠頭部處于屈曲狀態(tài),再用牙托粉將顱骨與操縱桿粘合在一起,保持大鼠頭部位置穩(wěn)定。沿項(xiàng)部中央切開皮膚,充分暴露枕骨大孔。用11號(hào)手術(shù)刀的尖端沿枕骨大孔將硬脊膜作環(huán)形切割,暴露出菱形窩。手術(shù)完成后暫用38℃左右的石蠟油覆蓋,以避免延髓干燥。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)插入記錄微電極后,在延髓表面灌注2%的瓊脂,以保護(hù)延髓,避免干燥和減少因呼吸產(chǎn)生的延髓振動(dòng)。1.3srd神經(jīng)元檢測(cè)采用充灌5%NaCl和Pontamineskyblue溶液的玻璃微電極,在微電極操縱器(日本成茂)控制下根據(jù)SRD神經(jīng)核團(tuán)的三維空間坐標(biāo)將記錄微電極插入核團(tuán)。SRD神經(jīng)元記錄的坐標(biāo)為:延髓菱形窩底端閂部為零點(diǎn),向后1.0～2.0mm,正中線旁開1.0～1.5mm,延髓表面下600～1500μm。在大鼠尾巴末端插入1對(duì)不銹鋼刺激電極,施以傷害性電刺激(4～6mA,0.66Hz,持續(xù)2ms)以尋找SRD神經(jīng)元。細(xì)胞放電經(jīng)微電極引入示波器(日本光電VC-10)和微電極放大器(日本光電8301)進(jìn)行信號(hào)放大,并采用Power-Lab電生理記錄系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)采集,進(jìn)行細(xì)胞放電的放大和信號(hào)處理。1.4大鼠熱刺激實(shí)驗(yàn)對(duì)記錄到的神經(jīng)元都檢查其外周感受野對(duì)機(jī)械刺激(包括觸摸刺激、齒鑷夾夾皮刺激)的反應(yīng),觀察它們的感受野分布范圍、感受野大小,量化反應(yīng)的性質(zhì)及反應(yīng)的強(qiáng)度。當(dāng)所記錄的神經(jīng)元能特異地被全身傷害性刺激激活,而非傷害性刺激,如聲、光和本體刺激則完全無效時(shí)可確定為SRD神經(jīng)元,隨即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。為了便于控制刺激參數(shù),我們采用不同直徑的橡膠瓶蓋,后接容量不少于300mL的瓶子,灌注不同溫度的熱水來作為模擬熱灸刺激。橡膠瓶蓋直接垂直放置于皮膚表面30s,給予皮膚熱刺激。首先記錄30s神經(jīng)元的背景活動(dòng),然后隨機(jī)選擇不同溫度熱水和不同開口面積的廣口瓶的組合給予大鼠熱刺激30s(考慮到所需的刺激面積較大,因此我們選擇在腹部“中脘”穴給予大鼠熱刺激),觀察SRD神經(jīng)元對(duì)熱刺激的反應(yīng)。停止熱刺激后記錄20s神經(jīng)元的背景活動(dòng),待細(xì)胞放電恢復(fù)后,再進(jìn)行下一種組合的熱刺激。選定的溫度為:40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃,廣口瓶開口的直徑為:1.0cm、1.5cm、2.0cm、2.5cm、3.0cm、3.5cm、4.0cm,熱刺激組合共有49種。實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)監(jiān)控大鼠的心率和體溫。動(dòng)物體溫通過反饋型加熱儀(瑞沃德CL-8)控制并維持在36～38℃之間。1.5實(shí)驗(yàn)大鼠腦電極的檢測(cè)單細(xì)胞記錄結(jié)束后,由刺激器(日本光電)輸出20μA的負(fù)向直流電20～30min,通過玻璃微電極將電極液導(dǎo)入大鼠腦組織,以標(biāo)記記錄位置。動(dòng)物心臟灌流固定,取腦組織做冰凍切片,HE染色觀察,參考大鼠腦立體定位圖譜(Paxinos&Watson,2007),確定Pontamineskyblue標(biāo)定微電極的記錄位置。1.6數(shù)據(jù)處理及分析Power-Lab計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)及Chart5.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。刺激前、后及差值做描述性統(tǒng)計(jì),表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)。溫度與面積之間做直線回歸分析;組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1不同部位激活srd神經(jīng)元的反應(yīng)在40只大鼠的延髓背側(cè)共記錄到145個(gè)神經(jīng)元。其中SRD神經(jīng)元115個(gè),三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元20個(gè),與呼吸相關(guān)的呼吸中樞神經(jīng)元10個(gè)。圖1為本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中記錄的部分SRD神經(jīng)元的Pontamineskyblue定位。因在尋找SRD神經(jīng)元過程中給予大鼠的傷害性電刺激稍大,在停止刺激后大多數(shù)SRD神經(jīng)元都呈現(xiàn)出一定程度的自發(fā)放電[(3.3±0.2)spikes/s]。大鼠全身各部位的閾上電刺激(持續(xù)2ms)均可以激活SRD神經(jīng)元。這種激活反應(yīng)表現(xiàn)為兩個(gè)激活峰,并且兩個(gè)激活峰之前都存在一定時(shí)間的潛伏期,如圖2所示,對(duì)大鼠尾巴基底部施加的閾上電刺激所引發(fā)的SRD神經(jīng)元激活反應(yīng)的潛伏期要明顯小于刺激間隔10cm的大鼠尾巴尖端所引發(fā)的反應(yīng)。尾巴基底部刺激(50次單個(gè)方波刺激迭加)引發(fā)的兩個(gè)激活峰的潛伏期分別為12～40ms和200～250ms,尾巴尖端部的潛伏期為23～60ms和560～650ms。經(jīng)統(tǒng)計(jì),兩部位早期激活反應(yīng)的時(shí)間差為(9.5±0.6)ms,可計(jì)算出其外周纖維傳導(dǎo)速度為(10.5±0.6)m/s,符合Aδ類神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)速度范圍;兩處刺激引發(fā)的晚期激活反應(yīng)的時(shí)間差為(145.0±10.2)ms,經(jīng)計(jì)算其外周纖維傳導(dǎo)速度為(0.70±0.05)m/s,符合C類纖維傳導(dǎo)速度范圍。因此我們推論早期激活反應(yīng)為Aδ類神經(jīng)纖維興奮,晚期激活反應(yīng)為C類纖維興奮所致。所有的SRD神經(jīng)元不對(duì)任何形式的非傷害性刺激(如聲、光和本體刺激等)發(fā)生反應(yīng),對(duì)全身傷害性范圍內(nèi)的機(jī)械刺激(如有齒鑷夾皮)、48℃的熱水刺激等均發(fā)生明顯的激活反應(yīng)。2.2熱刺激對(duì)srd神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響如圖3所示,當(dāng)刺激溫度為40、42℃時(shí),與刺激前的基礎(chǔ)值相比,無論刺激面積多大,對(duì)SRD神經(jīng)元都沒有明顯的激活作用。如圖4所示,當(dāng)刺激溫度為44℃、刺激面積直徑為1.0～3.0cm時(shí),熱刺激對(duì)SRD神經(jīng)元有輕微的激活作用(與刺激前基礎(chǔ)值相比,均P>0.05);只有當(dāng)刺激面積直徑達(dá)到3.5cm和4.0cm時(shí),熱刺激后的SRD神經(jīng)元放電頻率與刺激前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但這兩組之間進(jìn)行比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)刺激溫度為46℃、刺激面積直徑為3.5cm時(shí),熱刺激對(duì)SRD神經(jīng)元有較強(qiáng)的激活作用(圖5);疊加的結(jié)果表明,在刺激面積直徑2.0～4.0cm范圍內(nèi),46℃的熱刺激面積與SRD神經(jīng)元的放電活動(dòng)呈線性關(guān)系。當(dāng)刺激溫度為48℃、刺激面積直徑為3.5cm時(shí),熱刺激對(duì)SRD神經(jīng)元同樣有較強(qiáng)的激活作用(圖6);疊加的結(jié)果表明,在刺激面積直徑1.0～3.0cm范圍內(nèi),48℃的熱刺激面積與SRD神經(jīng)元的放電活動(dòng)呈線性關(guān)系;在刺激面積直徑達(dá)到3.0cm后,SRD神經(jīng)元的放電活動(dòng)到達(dá)平臺(tái)期,沒有隨刺激面積的增大而增加。由圖7可見,當(dāng)刺激溫度為50℃時(shí),50℃-Φ1.0cm熱刺激組合已經(jīng)可以激活SRD神經(jīng)元;在直徑1.0～3.5cm范圍內(nèi),SRD神經(jīng)元的放電頻率隨著刺激面積的增大而增加;但是當(dāng)刺激面積直徑達(dá)到4.0cm時(shí),SRD的放電頻率不再隨刺激面積的增大而增加。疊加的結(jié)果表明,在刺激面積直徑1.0～3.5cm范圍內(nèi),50℃的熱刺激面積與SRD神經(jīng)元的放電活動(dòng)呈線性關(guān)系,當(dāng)刺激面積直徑達(dá)到3.5cm之后SRD神經(jīng)元的放電活動(dòng)到達(dá)平臺(tái)期。由圖8可見,當(dāng)刺激溫度達(dá)到52℃時(shí),與50℃時(shí)的結(jié)果類似,在刺激面積直徑在1.0～3.5cm范圍內(nèi),熱刺激面積與SRD神經(jīng)元的放電活動(dòng)呈線性關(guān)系,在刺激面積直徑達(dá)到3.5cm后,SRD神經(jīng)元的放電活動(dòng)到達(dá)平臺(tái)期。如圖9所示,50℃和52℃在任何面積下對(duì)SRD神經(jīng)元的激活作用幾乎相同;當(dāng)刺激面積直徑為4.0cm、刺激溫度為50℃時(shí),SRD神經(jīng)元放電頻率達(dá)到最大值[(16.8±1.4)spikes/s為刺激前后差的均值]。但是,50℃-Φ4.0cm刺激組合引發(fā)的SRD神經(jīng)元的放電分別與50℃-Φ3.5cm刺激組合(P=0.994>0.05)、52℃-Φ3.5cm刺激組合(P=0.924>0.05)、52℃-Φ4.0cm刺激組合(P=0.993>0.05)、48℃-Φ3.5cm刺激組合(P=0.289>0.05)、48℃-Φ4.0cm刺激組合(P=0.357>0.05)相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。50℃-Φ4.0cm刺激組合引發(fā)的SRD神經(jīng)元的放電與46℃-Φ4.0cm組合(P=0.019<0.05)、46℃-Φ3.5cm組合(P=0.021<0.05)相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。50℃-Φ4.0cm刺激組合引發(fā)的SRD神經(jīng)元的放電與剩余的其它刺激組合比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。3網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對(duì)傷害性信號(hào)的編碼作用在本實(shí)驗(yàn)中,我們以神經(jīng)元的放電頻率為指標(biāo),觀察了不同溫度和不同面積的熱刺激組合刺激“中脘”穴對(duì)大鼠SRD神經(jīng)元的激活作用。在一定的范圍內(nèi),SRD神經(jīng)元的放電隨著熱刺激的增強(qiáng)而增加。更確切地說,SRD神經(jīng)元可以對(duì)傷害性刺激范圍內(nèi)的自然刺激的強(qiáng)度進(jìn)行編碼。在相同的傷害性刺激溫度的條件下,SRD神經(jīng)元的放電頻率在一定范圍內(nèi)隨刺激面積的增加而增加,在達(dá)到一定刺激面積后,SRD神經(jīng)元的放電活動(dòng)會(huì)到達(dá)一個(gè)平臺(tái)期,放電活動(dòng)不再隨刺激面積的增加而增強(qiáng)。SRD神經(jīng)元的這種性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道較多的三叉神經(jīng)核尾側(cè)部核團(tuán)、脊髓背角神經(jīng)元和一些外周感受器的反應(yīng)性質(zhì)類似。而在早期的一些文獻(xiàn)中并沒有報(bào)道網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有這一反應(yīng)特性,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對(duì)傷害性信號(hào)沒有編碼作用。但近十幾年,關(guān)于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在痛覺信號(hào)處理中的重要作用逐漸被眾多科研工作者所認(rèn)識(shí),相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道也證明了SRD神經(jīng)元的這一作用。3.1srd內(nèi)表達(dá)的單次給藥作用有數(shù)據(jù)表明超過一半以上位于SRD內(nèi)的與丘腦相連的神經(jīng)元向脊髓發(fā)出單突觸纖維投射。這一結(jié)果與Scheibel等早期結(jié)果是一致的,他們的工作表明,大部分腦干巨細(xì)胞網(wǎng)狀核神經(jīng)元的軸突都很長(zhǎng),并沿腦干的上和/或下發(fā)出長(zhǎng)距離的投射。這一開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)是對(duì)傳統(tǒng)生理學(xué)概念的挑戰(zhàn),傳統(tǒng)生理學(xué)認(rèn)為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是由軸突很短的細(xì)胞鏈組成的,它們可以像多米諾骨牌一樣被依次激活;早期的示蹤法研究很少發(fā)現(xiàn)有和脊髓相連的腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)神經(jīng)元向間腦發(fā)出側(cè)支纖維。這一差異很可能是由示蹤劑的靈敏度以及關(guān)注部位的不同造成的。SRD基本上是由反應(yīng)性質(zhì)相同的細(xì)胞組成,同時(shí)對(duì)脊髓-丘腦通路的痛覺信號(hào)進(jìn)行調(diào)節(jié)。位于大鼠SRD背側(cè)部?jī)?nèi)的神經(jīng)元表現(xiàn)出全身痛覺會(huì)聚的性質(zhì)并且向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多部位發(fā)出纖維投射,這些部位很多都涉及到了運(yùn)動(dòng)功能。這些部位包括脊髓所有節(jié)段的深層背角和前角背側(cè)部,腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核,巨細(xì)胞和小細(xì)胞網(wǎng)狀核以及前腦與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的結(jié)構(gòu),如腹內(nèi)側(cè)丘腦外側(cè)部、束旁核、未定帶腹側(cè)部等。而對(duì)傷害性皮膚和/或內(nèi)臟刺激做出應(yīng)答的背角深層的眾多區(qū)域向SRD發(fā)出主要的投射纖維。SRD通過其與脊髓的相互聯(lián)系對(duì)脊髓的輸出信號(hào)進(jìn)行興奮性和抑制性的調(diào)節(jié)。行為學(xué)的研究表明,向大鼠SRD內(nèi)注射谷氨酸可以產(chǎn)生甩尾實(shí)驗(yàn)的潛伏期延長(zhǎng)等動(dòng)作反應(yīng)。有意思的是,SRD還接受大腦皮層眾多區(qū)域的直接影響,眾多的離皮層影響通過SRD的側(cè)支幾乎可以同時(shí)到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的頭側(cè)和尾側(cè)部?？梢栽O(shè)想,SRD是延髓內(nèi)對(duì)痛覺信號(hào)和運(yùn)動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。3.2不同艾姜片的刺激灸的方法種類繁多,主要有直接灸、間接灸、溫針灸、溫和灸、雀啄灸等,但是灸量往往沒有準(zhǔn)確的定量,一般以灸至皮膚溫?zé)峒t暈,而又不致燒傷皮膚為度(化膿灸除外),灸的面積更是大小不一。就刺激面積而言,艾炷的炷底直徑常用的為1.0cm左右,艾條直徑為1.2cm左右,實(shí)際作用到皮膚的面積直徑至少在3cm以上;鋪灸作為一種特殊的灸法,在臨床也有較為廣泛的應(yīng)用,其刺激面積是各類灸法中最大的(長(zhǎng)為脊柱全長(zhǎng),寬6cm以上);線香灸作為灸法的一種,其刺激面積相對(duì)是最小的。2mg艾炷施灸時(shí),隨艾炷數(shù)的增加,其最高溫度及持續(xù)時(shí)間呈升高和延長(zhǎng)趨勢(shì),如:1壯施灸時(shí)最高溫度約達(dá)100℃,可持續(xù)20s保持40℃以上,連續(xù)施灸20壯時(shí)最高溫度可達(dá)150℃,可持續(xù)350s保持40℃以上;Okazaki觀察了單壯、多壯艾炷灸對(duì)皮溫的影響,認(rèn)為單壯灸后溫度隨艾炷增大(0.5～2mg)而升高,在皮膚表面,單壯(2mg)