電致化學(xué)發(fā)光葡萄糖傳感器的研制

電致化學(xué)發(fā)光葡萄糖傳感器的研制

1固定化方法的應(yīng)用電致化學(xué)發(fā)光（cel）是在化學(xué)發(fā)光的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種化學(xué)發(fā)光法。它是結(jié)合電極反應(yīng)和其他化學(xué)發(fā)光方法的。利用葡萄糖氧化酶(GOD)催化氧化葡萄糖生成H2O2可以構(gòu)建葡萄糖ECL傳感器。在ECL葡萄糖傳感器研究中,GOD的固定方法是一個(gè)重要課題。常用的酶固定化方法有吸附法、包埋法、共價(jià)鍵合法及交聯(lián)法,電化學(xué)聚合法。這些方法制備ECL酶?jìng)鞲衅鬟^程煩瑣、復(fù)雜,電極表面敏感膜不易更新。在酶?jìng)鞲衅髦胁捎眉{米材料為載體,不僅可以增加酶的固定量和穩(wěn)定性,而且還可以提高酶的催化活性,進(jìn)而提高酶電極的響應(yīng)靈敏度。Fe3O4磁性納米粒子具有納米粒子的諸多優(yōu)點(diǎn),又具有非常好的生物相容性,在外加磁力的作用下能非常方便地實(shí)現(xiàn)電極敏感膜的更新,故在酶?jìng)鞲衅餮芯恐械玫搅藦V泛應(yīng)用[10,11,12,13,14,15]。但是在ECL葡萄糖傳感器中,使用Fe3O4磁性納米粒子固定GOD還未見報(bào)道。本研究通過交聯(lián)劑將GOD共價(jià)固定在Fe3O4磁性納米粒子表面,再通過磁力將此固載酶的磁性納米粒子修飾在SPCE表面,從而制成了易更新的酶?jìng)鞲衅?并用于葡萄糖的ECL分析。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器、試和儀器MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司);M1703型紅外光譜儀(Perkin-Elmer公司);三電極系統(tǒng):工作電極為自制的磁性納米粒子固定酶修飾電極(GOD/Fe3O4/SPCE/CME),參比電極為Ag/AgCl飽和KCl電極,鉑絲為對(duì)電極;Bransonic200超聲清洗儀(德國(guó)BransonUltraschall公司);pHS-2C型精密酸度計(jì)(上海雷磁精密儀器有限公司)。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS,98%,AlfaAesar公司);葡萄糖氧化酶(GOD,120U/mg,Sigma公司);標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲(chǔ)備液,放置過夜后使用,保存于4℃冰箱中。魯米諾(>98%,Fluka公司);戊二醛(25%,上海化學(xué)試劑廠);其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水(18.2MΩ·cm)。2.2修飾電極的制備參考文獻(xiàn),取3cm長(zhǎng)的鐵棒(外徑2.55mm)和2cm長(zhǎng)的玻璃管(3.0mmi.d),磨平鐵棒和玻璃管的兩端,用水洗凈。按一定比例混合固體石蠟和碳粉,加熱熔化石蠟,均勻攪拌,制得石蠟碳糊。把鐵棒插入玻璃管中距底部約0.5mm,形成一個(gè)凹坑,趁熱將石蠟碳糊封裝進(jìn)此凹坑,填平,冷卻,除去玻璃壁外的沾粘的碳糊,并在光滑打印紙拋光電極表面。然后分別用HNO3(1∶1,V/V)、無水乙醇和二次蒸餾水清洗電極。在1.0mol/LH2SO4溶液中采用循環(huán)伏安(CV)法活化作為工作電極的SPCE,掃描范圍1.2～-1.2V。再于5mmol/LK3Fe(CN)6溶液中循環(huán)掃描,掃描范圍改為0.5～-0.2V。重復(fù)上述步驟直至得到峰形良好的一對(duì)可逆氧化還原峰。按照n(Fe2+)∶n(Fe3+)=1∶1.75稱取適量FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O,溶于水中。攪拌下快速加入適量2.0mol/LNaOH溶液,調(diào)pH值至11.0,室溫下攪拌0.5h,迅速升溫到75℃,熟化0.5h,整個(gè)過程都在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下進(jìn)行,得黑色懸浮液。超聲15min,磁鐵分離不溶物,用水洗滌至溶液呈中性。在75℃下真空干燥,得粉末,4℃下密閉保存在。取20mL乙醇,加入50mgFe3O4納米粒子粉末,超聲分散,之后加入0.2mL3-氨基丙基三乙氧基硅烷(98%),在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下,25℃攪拌12h制得氨基化的磁性納米粒子,用無水乙醇、水超聲清洗后定容至20mL備用。取2.0mL上述溶液于5mL試管中,晾干,再于試管中加入2.0mL0.25%戊二醛,混旋30s后,放入4℃冰箱冷藏1h,之后水洗并晾干,再加20g/LGOD溶液2.0mL,于4℃冰箱中保存12h,制得GOD修飾的磁性粒子溶液(GOD/Fe3O4)。圖1為磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶的示意圖。SPCE電極面朝上,用磁鐵吸住電極上端鐵芯,滴加15μLGOD/Fe3O4粒子在電極表面,制得酶修飾電極(GOD/Fe3O4/SPCE/CME)。測(cè)定時(shí)將電極面對(duì)準(zhǔn)光電倍增管檢測(cè)方向。每次更新電極時(shí),移去磁鐵,水洗去磁性復(fù)合粒子,之后重復(fù)上述過程以更新電極。2.3魯米諾的ecl行為ECL傳感器的原理如圖2。GOD/Fe3O4復(fù)合磁性納米粒子通過外加磁場(chǎng)而修飾在SPCE電極表面。此時(shí),溶液中的葡萄糖與溶解氧發(fā)生GOD酶促反應(yīng),生成H2O2。同時(shí),溶液中的魯米諾在修飾電極表面發(fā)生氧化,魯米諾氧化物與H2O2發(fā)生ECL反應(yīng)。GOD/Fe3O4復(fù)合磁性納米粒子的存在促進(jìn)了魯米諾的氧化和H2O2生成。在本實(shí)驗(yàn)中,室溫下,將10mL含一定濃度的葡萄糖的0.5mmol/L魯米諾-0.1mol/L硼酸鈉緩沖溶液(pH=8.0)轉(zhuǎn)至石英燒杯中,然后采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試,并測(cè)定ECL的強(qiáng)度。掃描范圍為0.2～1.4V(vs.SCE),掃速為50mV/s。光電倍增管高壓600V,采樣速率10T/S,放大倍數(shù)3,測(cè)量時(shí)間60s。SPCE不用時(shí)置于冰箱中4℃下保存。3結(jié)果與討論3.1酶復(fù)合磁元素地球化學(xué)特征用激光散射儀(英國(guó)Malvern公司)測(cè)定Fe3O4納米粒子粒徑。從圖3可見,本實(shí)驗(yàn)所制備的Fe3O4磁性粒子粒徑主要分布在12～22nm之間。說明磁性納米粒子已經(jīng)達(dá)到納米級(jí),且粒徑分布較為集中,因此,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用紅外光譜表征Fe3O4粒子表面氨基化修飾前后的變化。由圖4可見,在Fe3O4粒子表面功能化修飾了氨基基團(tuán),Fe3O4粒子與氨基化Fe3O4粒子都具有Fe3O4粒子特征峰(583.235cm-1);氨基化Fe3O4粒子具有Si-O的伸縮振動(dòng)特征峰(1409.675cm-1)和氨基彎曲振動(dòng)特征峰(1638.335cm-1)。用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(PAR115型)對(duì)移去磁鐵而洗脫獲得的酶復(fù)合磁性粒子進(jìn)行磁力測(cè)量。復(fù)合粒子矯頑力較低,同時(shí)未見明顯的剩磁和磁滯現(xiàn)象,其比飽和磁化強(qiáng)度σ僅為42.1emu/g(圖5)。由此可見,Fe3O4/GOD復(fù)合粒子具有較強(qiáng)超順磁性即在外磁場(chǎng)存在下有磁性,外撤除磁場(chǎng)則磁性消失,故可用于磁性分離。3.2cv實(shí)驗(yàn)過程Fe3O4/GOD(a)和Fe3O4(b)粒子分別修飾的SPCE,在10mL含0.1mmol/L魯米諾和1.0mmol/L葡萄糖+0.1mol/L硼酸鈉緩沖溶液(pH=8.0)中進(jìn)行CV實(shí)驗(yàn)所得到ECL圖(見圖6)。實(shí)驗(yàn)條件:電位掃速為50mV/s,掃描范圍為0.2～1.4V,采樣速率10T/S,放大倍數(shù)3。由圖6可見,修飾在電極表面的Fe3O4粒子表面成功地共價(jià)固定了GOD,從而催化氧化葡萄糖生成魯米諾ECL所需的H2O2。3.3魯米諾ecl的響應(yīng)研究了3種緩沖液:0.1mol/L硼酸鈉、0.1mol/LHAc-NaAc和PBS(pH=8.0)作為支持電解質(zhì)的影響。結(jié)果表明,0.1mol/L硼酸鈉緩沖溶液中ECL響應(yīng)最高。魯米諾的ECL反應(yīng)需在弱堿性條件下進(jìn)行,考慮到葡萄糖氧化酶的生物活性受pH值影響較大,本研究考察了pH在7.0～9.5時(shí)ECL強(qiáng)度的變化。其中魯米諾濃度為0.1mmol/L,葡萄糖濃度為1.0mmol/L。當(dāng)pH=8.0時(shí),魯米諾的ECL強(qiáng)度最大,本實(shí)驗(yàn)選取pH=8.0。酶的催化活性受溫度影響較大。本實(shí)驗(yàn)用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器控制水浴溫度,考察了20～60℃范圍內(nèi)酶電極的電流響應(yīng)。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí),響應(yīng)最大。綜合考慮溫度對(duì)葡萄糖氧化酶電極壽命的影響,本實(shí)驗(yàn)均在室溫25℃下進(jìn)行。3.4魯米諾溶液中cl強(qiáng)度的變化本實(shí)驗(yàn)考察了魯米諾的濃度在0.01～1.2mmol/L范圍內(nèi)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響(圖7)。由圖7可知,隨著魯米諾的濃度由0.01mmol/L增大到0.5mmol/L時(shí),溶液的ECL強(qiáng)度快速增大,之后趨于平穩(wěn)飽和。因此,實(shí)驗(yàn)中魯米諾的濃度為0.5mmol/L。3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限取10mL石英小燒杯,加入含一系列不同濃度的葡萄糖0.1mol/L硼酸鈉緩沖溶液(pH=8.0)10mL,此時(shí)魯米諾濃度為0.5mmol/L,按上述方法測(cè)定ECL的強(qiáng)度(圖8)。葡萄糖在1×10-5～1.0×10-2mol/L濃度范圍內(nèi)與ECL強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系:I=65.4374C+23.9017,r=0.9987;檢出限為1μmol/L;酶電極的響應(yīng)時(shí)間約為10s。3.6納米粒子的檢測(cè)通過移除ECL葡萄糖傳感器上方的磁鐵,用水沖SPCE電極表面,在0.5mol/LHCl中清洗0.5min,從而去除磁性復(fù)合粒子。重復(fù)2.2.2節(jié)的修飾過程,可實(shí)現(xiàn)磁性復(fù)合粒子的更新。每次電極更新后對(duì)1.0mmol/L的葡萄糖進(jìn)行測(cè)定,其RSD=3.9%(n=5)。而對(duì)于5批次相同條件下制得的傳感器,其RSD=4.5%?？疾煲粋€(gè)月內(nèi)組裝有磁性復(fù)合粒子的工作電極對(duì)葡萄糖響應(yīng)情況(不使用時(shí),電極放置在4℃冰箱中保存)。結(jié)果表明,7天內(nèi)電極響應(yīng)基本不變,CV和ECL曲線形狀也基本不變;14天后ECL強(qiáng)度約為原來的95%;1月后ECL強(qiáng)度下降85%。顯然,用本實(shí)驗(yàn)方法固定GOD在Fe3O4納米粒子表面,能在微環(huán)境下保持生物蛋白的活性,從而獲得較好的穩(wěn)定性。考察了一些常見干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定5.0×10-5mol/L葡萄糖的影響。結(jié)果表明,10倍的尿酸和抗壞血酸對(duì)葡萄糖的檢測(cè)的影響均<5%,說明本方法選擇性好,這歸功于酶促反應(yīng)特異性和ECL的高靈敏度。3.7加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)人血清樣品(桂林理工大學(xué)附屬醫(yī)院提供)中葡萄糖的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,本