蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)宏觀(guān)統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)研究

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)宏觀(guān)統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)研究

1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與形態(tài)蛋白質(zhì)是由細(xì)胞內(nèi)核糖體（ribosome）合成的聚氨基酸酶酸聚合物（也稱(chēng)為多酚醇酸），是生命活動(dòng)中不可或缺的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)分子包含幾個(gè)或多個(gè)不同數(shù)量的氨基酸單位（被稱(chēng)為遺傳因子）。一般蛋白質(zhì)分子由數(shù)千氨基酸組成。自然界中有20種氨基酸，不同類(lèi)型的氨基酸的排列序列稱(chēng)為氨基酸序列，氨基酸序列決定了不同蛋白質(zhì)之間的差異。蛋白質(zhì)通過(guò)多肽鏈折疊形成特殊的三維空間分子結(jié)構(gòu),并由此實(shí)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的生物功能,這種空間結(jié)構(gòu)稱(chēng)為天然態(tài)結(jié)構(gòu)(nativestructure).蛋白質(zhì)天然態(tài)結(jié)構(gòu)特征可以通過(guò)X射線(xiàn)散射、核磁共振(NMR)和低溫電鏡(cryo-electronmicroscopy)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)加以觀(guān)測(cè).Pauling等指出蛋白質(zhì)內(nèi)部存在規(guī)則的螺旋結(jié)構(gòu)和片層結(jié)構(gòu),正是這些結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了X射線(xiàn)中的α和β散射圖樣.此后不久,Linderstrom和Schellman發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)部的結(jié)構(gòu)組織具有層次性,并首次引入了一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的名稱(chēng).一般認(rèn)為,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以分為4種組織層次:一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu).一級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸序列.二級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈局部折疊形成的穩(wěn)定規(guī)則結(jié)構(gòu),包括α螺旋(helix)、β片層(sheet)和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(turn)等.二級(jí)結(jié)構(gòu)的生成與維持需要依靠不同氨基酸的C==O和N—H基團(tuán)間的氫鍵作用.三級(jí)結(jié)構(gòu)指多個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)在空間中緊密排列所形成的三維結(jié)構(gòu).蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)通常依靠疏水核心、雙硫鍵、氫鍵等來(lái)穩(wěn)定結(jié)構(gòu).四級(jí)結(jié)構(gòu)指不同蛋白質(zhì)多肽鏈間相互作用形成具有不同功能的復(fù)合物分子形態(tài).與天然態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的是去折疊結(jié)構(gòu)(unfoldedstructure).理想狀態(tài)的去折疊態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)無(wú)規(guī)卷曲(randomcoil)狀態(tài),沒(méi)有形成規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu).研究表明,在強(qiáng)變性劑環(huán)境下(如8M尿素),去折疊態(tài)蛋白質(zhì)的流體力學(xué)屬性與無(wú)規(guī)卷曲多肽鏈相符.但是在沒(méi)有變性劑的情況下,即使是極端的pH值和溫度環(huán)境,去折疊蛋白質(zhì)也不是真正的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu).在無(wú)規(guī)卷曲狀態(tài)下,多肽鏈不同部分之間的相互作用與結(jié)構(gòu)–溶液之間相互作用完全達(dá)到平衡.然而,蛋白質(zhì)由20種具有不同物理化學(xué)屬性的氨基酸組成,這種異質(zhì)多肽鏈(heterogeneouspolypeptidechain)結(jié)構(gòu)內(nèi)部相互作用不易與結(jié)構(gòu)–溶液間作用力完全平衡,多肽鏈本身不同部分之間的相互作用往往更占優(yōu)勢(shì),因此去折疊態(tài)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)更加緊密,更加有規(guī)則.除了天然折疊態(tài)和去折疊結(jié)構(gòu),許多蛋白質(zhì)還具有穩(wěn)定的中間態(tài)結(jié)構(gòu).具有如下特征的中間態(tài)結(jié)構(gòu)一般稱(chēng)為熔球態(tài)(moltenglobule):(1)整體大小十分接近折疊態(tài)結(jié)構(gòu);(2)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量與天然態(tài)蛋白質(zhì)相仿;(3)結(jié)構(gòu)內(nèi)部氨基酸側(cè)鏈的空間分布更均勻;(4)與折疊態(tài)相比,結(jié)構(gòu)內(nèi)部氨基(amide)與溶液之間氫原子的交換更加迅速,但是相比去折疊態(tài)更緩慢;(5)中間態(tài)結(jié)構(gòu)的焓與去折疊態(tài)結(jié)構(gòu)十分接近,與折疊態(tài)結(jié)構(gòu)相去甚遠(yuǎn);(6)中間態(tài)/去折疊態(tài)結(jié)構(gòu)之間轉(zhuǎn)換迅速且具有非協(xié)作性(nonco-operative),中間態(tài)/折疊態(tài)結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)換緩慢且具有協(xié)作性(co-operative).自然狀態(tài)下,蛋白質(zhì)在水溶液中從去折疊態(tài)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)結(jié)構(gòu),以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的生物功能,這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)折疊.去折疊結(jié)構(gòu)和天然態(tài)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)折疊過(guò)程起點(diǎn)和終點(diǎn).較大蛋白質(zhì)分子(如多域蛋白(multi-domainprotein))的折疊過(guò)程通常會(huì)出現(xiàn)中間態(tài)結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1),而小蛋白的折疊過(guò)程是去折疊態(tài)和天然態(tài)之間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變.蛋白質(zhì)折疊是個(gè)可逆過(guò)程,在添加變性劑、改變溫度和pH值、施加壓力等情況下,處于天然態(tài)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子通常會(huì)發(fā)生去折疊(unfold)現(xiàn)象.同時(shí),如果溶液條件允許,即使在生物體外(如實(shí)驗(yàn)室條件下),不同初始結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子(這里主要指水溶性球蛋白)也能夠?qū)崿F(xiàn)快速折疊,并完全恢復(fù)到相同的天然態(tài)結(jié)構(gòu).早在19世紀(jì)30年代,中國(guó)科學(xué)家吳憲就提出球蛋白的變性(denaturation)是從緊密有序結(jié)構(gòu)向松散無(wú)序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變.同時(shí),人們還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在發(fā)生變性后,能夠自發(fā)地重新折疊到天然態(tài)結(jié)構(gòu)20世紀(jì)70年代,Anfinsen等通過(guò)核糖核酸酶的去折疊–折疊實(shí)驗(yàn)表明,蛋白質(zhì)的天然折疊態(tài)結(jié)構(gòu)處于熱力學(xué)平衡狀態(tài),天然態(tài)結(jié)構(gòu)只依賴(lài)于氨基酸序列和溶液環(huán)境.因此,蛋白質(zhì)天然態(tài)結(jié)構(gòu)特征僅依賴(lài)于氨基酸序列,與折疊是否發(fā)生在生物體內(nèi)無(wú)關(guān).特殊的氨基酸序列是如何決定蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu),這其中的奧秘依然不為人所知這也就是我們現(xiàn)在要研究的主題.在蛋白質(zhì)折疊和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)研究中,可以分別從熱力學(xué)、量子力學(xué)和統(tǒng)計(jì)力學(xué)多個(gè)角度研究.表1給出了3種理論的對(duì)比關(guān)系.統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)(statisticalthermodynamics)將熱力學(xué)與統(tǒng)計(jì)力學(xué)聯(lián)系起來(lái),從物質(zhì)的分子(原子)結(jié)構(gòu)出發(fā)直接導(dǎo)出熱力學(xué)函數(shù),使對(duì)熱力學(xué)定理的理解更為清晰.本文將重點(diǎn)介紹蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中疏水,氫鍵、靜電力等主要物理作用的統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)基礎(chǔ),并探討非共價(jià)作用對(duì)結(jié)構(gòu)折疊過(guò)程中自由能的影響.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)的特性生物體通過(guò)DNA/RNA遺傳物質(zhì)的基因表達(dá),僅僅確定了蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列,而非氨基酸多肽鏈的三維空間結(jié)構(gòu).然而,特殊的氨基酸排布順序決定了殘基在結(jié)構(gòu)中相互接觸(contact)和相互作用的模式(pattern),這種非局部(nonlocal)的相互作用影響了蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程.氨基酸序列包含蛋白質(zhì)天然態(tài)結(jié)構(gòu)特征的“密碼”,但兩者之間并非嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系,當(dāng)氨基酸序列上的某些氨基酸發(fā)生突變時(shí),蛋白質(zhì)仍能夠保持結(jié)構(gòu)不被破壞,并繼續(xù)執(zhí)行生物功能,這對(duì)物種的進(jìn)化過(guò)程是至關(guān)重要的.氨基酸序列的差異導(dǎo)致了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同,因此蛋白質(zhì)折疊的“隱秘規(guī)則”一定包含在代表氨基酸差別的殘基側(cè)鏈以及殘基的排列順序中.對(duì)氨基酸序列如何決定蛋白質(zhì)空間三維結(jié)構(gòu)的研究,被稱(chēng)為“蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題”.蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題包含3個(gè)不同的方面:(1)蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)問(wèn)題,即在原子相互作用下氨基酸序列怎樣形成穩(wěn)定存在的天然態(tài)結(jié)構(gòu);(2)蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)問(wèn)題,即蛋白質(zhì)通過(guò)何種折疊路徑快速達(dá)到天然態(tài)結(jié)構(gòu);(3)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的計(jì)算方法問(wèn)題,即怎樣從蛋白質(zhì)氨基酸序列出發(fā)預(yù)測(cè)出天然態(tài)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu).完全理解這3個(gè)問(wèn)題是蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題的最終目標(biāo).達(dá)爾文的進(jìn)化論觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為,自然界存在“物競(jìng)天擇,適者生存”的競(jìng)爭(zhēng)和淘汰規(guī)律.自然界存在數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列,折疊成不同的三維空間結(jié)構(gòu).在自然選擇和進(jìn)化壓力的驅(qū)動(dòng)下,為了滿(mǎn)足結(jié)構(gòu)快速折疊和正確執(zhí)行生物功能,蛋白質(zhì)氨基酸序列得到不斷優(yōu)化.在形成特定的氨基酸序列之后,結(jié)構(gòu)折疊的動(dòng)力學(xué)過(guò)程和熱力學(xué)平衡態(tài)則是物理、化學(xué)、生物等研究領(lǐng)域的問(wèn)題.隨著晶體結(jié)構(gòu)和去折疊實(shí)驗(yàn)的不斷發(fā)展,支配蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊的物理原理日漸明顯.蛋白質(zhì)分子在溶液中處于布朗運(yùn)動(dòng)狀態(tài),存在各種各樣的空間結(jié)構(gòu).氨基酸多肽鏈的不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)構(gòu)成了分子結(jié)構(gòu)的系綜(ensemble),在溶液中每一種結(jié)構(gòu)出現(xiàn)概率與對(duì)應(yīng)Gibbs自由能狀態(tài)有關(guān).折疊過(guò)程中,疏水基團(tuán)在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部聚集,帶電基團(tuán)之間形成氫鍵,同時(shí)球蛋白分子與溶液接觸面積減少,這些現(xiàn)象都表明蛋白質(zhì)折疊伴隨著Gibbs自由能降低.因此,熱力學(xué)基本定律認(rèn)為,在恒定的生理環(huán)境下,蛋白質(zhì)折疊是一個(gè)自由能下降過(guò)程.如果把去折疊過(guò)程中天然態(tài)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)的打開(kāi)、二級(jí)結(jié)構(gòu)的消失看作“溶解”過(guò)程天然態(tài)結(jié)構(gòu)與去折疊結(jié)構(gòu)之間的自由能差別看作“溶解自由能”(solvationfreeenergy),則蛋白質(zhì)分子“溶解自由能”決定了蛋白質(zhì)的折疊–去折疊過(guò)程蛋白質(zhì)分子在溶液中的溶解自由能與溶液分子的性質(zhì)有關(guān)(包括pH值、極化率等).這些性質(zhì)對(duì)疏水作用、靜電作用、氫鍵作用等物理作用都有重要影響,因而也決定了折疊過(guò)程中不同分子結(jié)構(gòu)的自由能高低.溶液條件影響著蛋白質(zhì)折疊效率在溶液環(huán)境中,擴(kuò)散速度、溶解效應(yīng)等因素決定了蛋白質(zhì)分子不同折疊狀態(tài)之間的自由能差別.對(duì)于給定氨基酸序列,蛋白質(zhì)分子是處于天然態(tài)還是去折疊態(tài)、是否存在中間態(tài)結(jié)構(gòu),都由對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(即自由能高低)決定,從根本上說(shuō),也就是由溶液的物理、化學(xué)性質(zhì)決定.一般認(rèn)為,在一定的溶液條件下,蛋白質(zhì)天然態(tài)結(jié)構(gòu)具有最小自由能(freeenergy).然而,蛋白質(zhì)分子可能的結(jié)構(gòu)數(shù)量是十分龐大的(例如,100個(gè)氨基酸組成的分子鏈可以有1018種不同空間結(jié)構(gòu)),在如此廣袤的結(jié)構(gòu)空間中遍歷所有結(jié)構(gòu)并搜索最小自由能狀態(tài)是艱巨的任務(wù)(保守估計(jì)需要1030年),如此長(zhǎng)的折疊時(shí)間顯然是不現(xiàn)實(shí)的,絕大多數(shù)蛋白質(zhì)分子都能在數(shù)秒內(nèi)完成折疊過(guò)程,這就是所謂的Levithal佯謬(paradox)Levithal佯謬表明,蛋白質(zhì)折疊不是隨機(jī)遍歷所有可能的結(jié)構(gòu),而是沿一條包含有限數(shù)目構(gòu)象的特殊折疊途徑達(dá)到天然態(tài)結(jié)構(gòu).目前,對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)空間的研究普遍認(rèn)為,不同能量狀態(tài)下結(jié)構(gòu)數(shù)量是不同的,隨著結(jié)構(gòu)自由能降低,可取的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)數(shù)量逐漸減少.結(jié)構(gòu)自由能曲面整體呈漏斗(funnel)狀(見(jiàn)圖2)天然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于能量最低點(diǎn).這個(gè)模型允許蛋白質(zhì)從大量各自不同的去折疊態(tài)結(jié)構(gòu)出發(fā),在不斷降低的自由能引導(dǎo)下,經(jīng)過(guò)不同折疊路徑和中間態(tài)結(jié)構(gòu)迅速折疊到天然態(tài)結(jié)構(gòu)該模型得到了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬計(jì)算和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的證實(shí).蛋白質(zhì)折疊路徑沿漏斗狀能量面下降,這個(gè)猜想與疏水塌縮假設(shè)緊密相關(guān).球形蛋白質(zhì)天然態(tài)結(jié)構(gòu)內(nèi)部通常包含由非極性氨基酸組成的疏水核心,而極性和帶電殘基則分布在蛋白質(zhì)表面,暴露在溶液環(huán)境中.這樣的結(jié)構(gòu)特征將非極性殘基與水分子隔離開(kāi)來(lái),結(jié)構(gòu)能量達(dá)到最穩(wěn)定狀態(tài).在蛋白質(zhì)折疊初始階段,氨基酸多肽鏈上的疏水殘基快速聚集,形成緊密疏水核心并引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)迅速縮小,這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為疏水塌縮.疏水塌縮發(fā)生在大量二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)之前,并引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入熔球態(tài)結(jié)構(gòu).熔球態(tài)對(duì)應(yīng)于能量漏斗中相對(duì)較低的部分,但是距離能量最低點(diǎn)的天然態(tài)結(jié)構(gòu)仍有一段距離,需要較長(zhǎng)時(shí)間才能逐漸進(jìn)入天然態(tài)結(jié)構(gòu).近年來(lái),蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)計(jì)算方法取得了很大的進(jìn)展.隨著越來(lái)越多的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)被解析出來(lái),基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法突飛猛進(jìn).較早運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)信息是二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)算法,該算法根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)信息,從氨基酸序列出發(fā)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)局部二級(jí)結(jié)構(gòu),對(duì)球形蛋白來(lái)說(shuō)能達(dá)到80%的正確性.二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法已被應(yīng)用于蛋白質(zhì)折疊識(shí)別(foldrecognition)、從頭開(kāi)始(abinitio)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)基序(structuralmotif)分類(lèi)和序列比對(duì)(sequencealignment)等研究中.相比二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法,三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的難度更大.目前,三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法主要包括對(duì)比蛋白質(zhì)建模方法(comparativeproteinmodelling)和從頭開(kāi)始預(yù)測(cè)方法兩類(lèi).前者以結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)解析的蛋白質(zhì)片段為模板(template),通過(guò)同源建模(homologymodeling)和序列比對(duì)等手段,拼接數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)片段.該方法的基本依據(jù)是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)樣式的有限性,盡管自然界有數(shù)百萬(wàn)種不同的蛋白質(zhì),但是自然界中獨(dú)特的三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊樣式卻有2000種左右,因此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以表示為這些獨(dú)特樣式的不同組合.對(duì)于較小的球形蛋白分子,預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)十分接近(誤差在2～6?A).從頭開(kāi)始的預(yù)測(cè)方法試圖直接從物理原理出發(fā)預(yù)測(cè)三維空間結(jié)構(gòu),而不需要使用已經(jīng)解析的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息.這類(lèi)方法包括基于牛頓運(yùn)動(dòng)方程的分子動(dòng)力學(xué)方法[63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74]、基于Langevin方程[75,76,77,78,79,80,81,82]和MonteCarlo算法的隨機(jī)動(dòng)力學(xué)方法等.基于物理原理的方法已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展,但是該方法需要很大的計(jì)算量,往往局限于較小蛋白質(zhì)或者簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)模型的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè).這種方法的優(yōu)勢(shì)非常明顯,如可以幫助人們理解蛋白質(zhì)在生物制藥中的結(jié)構(gòu)變化機(jī)理,理解蛋白質(zhì)折疊、結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變等動(dòng)力學(xué)過(guò)程的機(jī)理,幫助設(shè)計(jì)合成蛋白質(zhì)或者可以折疊的多聚物等等.3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的物理表征熱力學(xué)(thermodynamics)和動(dòng)力學(xué)(kinetics)理論是蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究中兩種主要思路.熱力學(xué)通過(guò)溫度、體積和粒子數(shù)目刻畫(huà)包含大量粒子的系統(tǒng),用熵(entropy)、焓(enthalpy)和總能量等參數(shù)描述系統(tǒng)整體行為,而非研究系統(tǒng)中每個(gè)單獨(dú)的粒子.熱力學(xué)理論認(rèn)為蛋白質(zhì)的自然態(tài)結(jié)構(gòu)具有最小自由能,蛋白質(zhì)折疊過(guò)程具有漏斗狀的能量面.動(dòng)力學(xué)理論認(rèn)為自然態(tài)蛋白質(zhì)具有動(dòng)力學(xué)意義上最容易達(dá)到結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中存在特殊路徑(如生成某些中間態(tài)結(jié)構(gòu))氨基酸多肽鏈可以沿折疊路徑達(dá)到天然態(tài)結(jié)構(gòu)而不需要搜索所有結(jié)構(gòu).以擴(kuò)散碰撞(diffusioncollision)模型為例,該理論認(rèn)為蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中存在微結(jié)構(gòu)域(microdomain)(如二級(jí)結(jié)構(gòu)的初始形態(tài)、疏水殘基團(tuán)簇等)的漲落(fluctuation),微結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)和碰撞導(dǎo)致相互結(jié)合并形成中間態(tài)結(jié)構(gòu),中間態(tài)結(jié)構(gòu)的存在加速了蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程.此外,分階段的折疊觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為蛋白質(zhì)折疊過(guò)程可以分為多個(gè)階段.在折疊初始階段,溶液與殘基之間的疏水作用驅(qū)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)快速塌縮,在特定的殘基相互作用模式(由氨基酸序列特殊性決定)幫助下,疏水塌縮促使二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn);當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)接近天然態(tài)結(jié)構(gòu)時(shí),熱力學(xué)機(jī)制占據(jù)主導(dǎo)地位,引導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)向自由能最低的狀態(tài)轉(zhuǎn)變.蛋白質(zhì)折疊是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程(stochasticprocess).蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)以大量分子的集體形式存在,分子群體運(yùn)動(dòng)形成可觀(guān)測(cè)的宏觀(guān)物理量.此外,單個(gè)分子在溶液環(huán)境下作無(wú)規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng),對(duì)單個(gè)分子的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行描述是極其困難的.因此,統(tǒng)計(jì)力學(xué)的方法是研究蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)規(guī)律的最佳途徑.同時(shí),蛋白質(zhì)分子并非只有單一空間結(jié)構(gòu),而是相互關(guān)聯(lián)、相互轉(zhuǎn)換的微觀(guān)狀態(tài)(microstate)組成的系綜.即使是X射線(xiàn)和核磁共振(NMR)觀(guān)測(cè)到的天然態(tài)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu),實(shí)際上也是不同微觀(guān)狀態(tài)的系綜平均.從這個(gè)意義上說(shuō),自然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是一組微觀(guān)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的集合,這些微觀(guān)狀態(tài)代表了蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的隨機(jī)擾動(dòng).蛋白質(zhì)的宏觀(guān)物理屬性和可觀(guān)測(cè)生物功能是微觀(guān)結(jié)構(gòu)狀態(tài)集合的系綜平均,因此,自然態(tài)結(jié)構(gòu)系綜的隨機(jī)漲落對(duì)蛋白質(zhì)的物理屬性和生物功能產(chǎn)生重要影響.通過(guò)研究原子、分子間相互作用,掌握蛋白質(zhì)系綜內(nèi)部微觀(guān)狀態(tài)的結(jié)構(gòu)特征、能量分布規(guī)律,有助于深入了解蛋白質(zhì)折疊機(jī)理,也有助于從微觀(guān)角度解釋宏觀(guān)可觀(guān)測(cè)物質(zhì)屬性.同時(shí),在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中,始終存在熵和焓之間的微妙平衡關(guān)系,結(jié)構(gòu)狀態(tài)與自由能的微小變化緊密相關(guān).熱力學(xué)狀態(tài)是連接蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與生物功能的橋梁,Gibbs自由能刻畫(huà)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的出現(xiàn)概率(即結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性),也反映了不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)之間發(fā)生轉(zhuǎn)變的可能性.因此,在統(tǒng)計(jì)力學(xué)基礎(chǔ)上,還需要研究溶液與蛋白質(zhì)分子的熱力學(xué)性質(zhì).統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)認(rèn)為:在給定的溫度、體積和粒子總數(shù)條件下,蛋白質(zhì)分子微觀(guān)結(jié)構(gòu)狀態(tài)是千差萬(wàn)別的;而在整個(gè)宏觀(guān)系統(tǒng)中,蛋白質(zhì)分子處于統(tǒng)計(jì)概率最大的結(jié)構(gòu)狀態(tài).因此,統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)給出了宏觀(guān)系統(tǒng)平衡態(tài)性質(zhì)的微觀(guān)分子理論解釋.統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)理論包含經(jīng)典熱力學(xué)和統(tǒng)計(jì)力學(xué)的內(nèi)容,但是又具有本身的特點(diǎn).與經(jīng)典熱力學(xué)之間的差別在于,經(jīng)典熱力學(xué)通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)量得到各種熱力學(xué)函數(shù),而統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)則基于統(tǒng)計(jì)力學(xué)基本原理,從分子模型出發(fā)經(jīng)過(guò)理論推導(dǎo)得到各種熱力學(xué)函數(shù);與統(tǒng)計(jì)力學(xué)的區(qū)別在于,在統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)中,從統(tǒng)計(jì)力學(xué)原理出發(fā)得到的熱力學(xué)函數(shù)和法則將被廣泛用于系統(tǒng)宏觀(guān)屬性研究.蛋白質(zhì)折疊過(guò)程受到多種作用力的影響,包括疏水作用、氫鍵作用、靜電力作用和范德華力作用等.從能量角度看,雖然天然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比去折疊態(tài)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,但是兩者之間的能量差別很小,僅有5～10kcal/mol(蛋白質(zhì)內(nèi)部一個(gè)氫鍵強(qiáng)度約為1～4kcal/mol,注1cal=4.18J),因此,顯然無(wú)法忽略各種分子間作用力對(duì)折疊過(guò)程的微小影響.在諸多作用力中,疏水作用是驅(qū)使蛋白質(zhì)主鏈快速塌縮并形成疏水核心的主要力量,在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中發(fā)揮最主要作用.這些重要作用表現(xiàn)在:球形蛋白質(zhì)通常具有疏水核心,使疏水殘基遠(yuǎn)離水環(huán)境使結(jié)構(gòu)能量更加穩(wěn)定;如果將蛋白質(zhì)放入非極性溶液中,由于缺少極性溶液環(huán)境下的疏水作用,蛋白質(zhì)主鏈通常會(huì)打開(kāi),進(jìn)入去折疊狀態(tài).研究表明,即使缺少適當(dāng)?shù)撵o電和氫鍵作用如果蛋白質(zhì)主鏈?zhǔn)杷?親水殘基分布特征正確,蛋白質(zhì)分子依然能夠折疊成天然態(tài)結(jié)構(gòu).主鏈氫鍵作用是形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵作用力,但是二級(jí)結(jié)構(gòu)本身通常在溶液中是不穩(wěn)定的,蛋白質(zhì)分子主鏈的緊密填埋使α螺旋和β片層結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定;同時(shí),也只有α螺旋和β片層結(jié)構(gòu)這樣的規(guī)則結(jié)構(gòu)才能使氨基酸多肽鏈在空間排布更緊密.作為一種長(zhǎng)程作用力,靜電作用通常不被認(rèn)為是蛋白質(zhì)折疊的重要力量,一方面是因?yàn)槎鄶?shù)蛋白質(zhì)的帶電殘基含量較少,而且分布在蛋白質(zhì)表面具有較高介電常數(shù)區(qū)域,另一方面蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性似乎與溶液離子濃度無(wú)關(guān),帶電殘基的突變通常對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響很小.但是,隨著研究的不斷深入,靜電作用的影響逐漸變得不可忽視范德華力在折疊過(guò)程中也是至關(guān)重要的,這是因?yàn)樘烊粦B(tài)蛋白質(zhì)具有緊密的內(nèi)部結(jié)構(gòu),范德華力作為一種近程作用發(fā)揮著不可替代的作用.蛋白質(zhì)內(nèi)部以及蛋白質(zhì)–溶液環(huán)境之間的相互作用力與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性緊密相關(guān),特別是作用力與結(jié)構(gòu)自由能之間的關(guān)系,決定了蛋白質(zhì)天然態(tài)結(jié)構(gòu)能否穩(wěn)定存在.因此,對(duì)疏水作用、氫鍵作用、靜電作用和范德華力等非共價(jià)作用的統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)原理研究至關(guān)重要.對(duì)非共價(jià)作用力的研究要點(diǎn)包括:(1)作用力的物理機(jī)制;(2)作用力在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中起到的作用;(3)作用力變化對(duì)結(jié)構(gòu)自由能和穩(wěn)定性的影響;(4)作用力強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)能量的計(jì)算方法等.統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)要求蛋白質(zhì)折疊是一個(gè)各態(tài)遍歷(ergodic)過(guò)程,這是一個(gè)重要的前提假設(shè).非共價(jià)作用力研究的基本方式是從物理定律(如庫(kù)侖定律)出發(fā),在合理的模型簡(jiǎn)化基礎(chǔ)上(如點(diǎn)電荷模型、均勻介電常數(shù)假設(shè)),推導(dǎo)出作用力的計(jì)算公式.基于統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)原理的非共價(jià)作用力分析近年來(lái)取得了許多積極進(jìn)展.通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中過(guò)渡態(tài)(transitionstate)結(jié)構(gòu)系綜的熱力學(xué)平衡態(tài)測(cè)量,發(fā)現(xiàn)了使過(guò)渡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在的作用力,這些作用力來(lái)自于某些特殊氨基酸側(cè)鏈的相互作用.Lazaridis和Paulaitis計(jì)算了簡(jiǎn)單小分子溶液水合作用的熵,在此基礎(chǔ)上,Ashbaugh和Paulaitis計(jì)算了甲烷和乙烷等分子水合作用的熵,與實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)吻合得很好.在蛋白質(zhì)配體結(jié)合過(guò)程中,將溶解自由能分解為熵和焓兩部分,有利于進(jìn)一步理解整個(gè)生物過(guò)程,這種方法已經(jīng)被用于配體結(jié)合自由能計(jì)算.盡管如此,統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)方法仍然面臨著一些挑戰(zhàn),例如,結(jié)構(gòu)自由能通常是熵和焓共同作用、相互補(bǔ)償、相互抵消的結(jié)果,因而往往變化量很小,不易分析對(duì)整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響.對(duì)蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中各種非共價(jià)作用的統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)分析,可以幫助我們深入理解蛋白質(zhì)各種結(jié)構(gòu)狀態(tài)的穩(wěn)定性來(lái)源,推動(dòng)對(duì)折疊機(jī)理和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)研究的發(fā)展.4分散水和分子溶解自由4.1小球形結(jié)構(gòu)的構(gòu)建自然界存在20種氨基酸,根據(jù)側(cè)鏈的物理、化學(xué)屬性不同,可以分為疏水、極性、帶電等多種類(lèi)型.大量研究表明[36,101,107,119,120,121,122,123],疏水作用是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在溶液環(huán)境中發(fā)生快速塌縮的重要驅(qū)動(dòng)作用.疏水殘基具有類(lèi)似于兩性分子(amphiphilic)的結(jié)構(gòu),殘基側(cè)鏈末端是非極性的碳?xì)?烴)基團(tuán),另一端則是主鏈部分具有極性特征的碳氧(羰基)基團(tuán)C==O和氮?dú)?氨基)基團(tuán)N—H.在非極性端“厭水”和極性端“親水”作用下,疏水殘基相互聚集,在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成緊密的疏水核心,其中疏水末端構(gòu)成蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水“微小球團(tuán)”(globule),親水一端多數(shù)形成彼此間氫鍵作用.同時(shí),極性氨基酸殘基也會(huì)在疏水球團(tuán)外部形成親水“包裹層”.因此,蛋白質(zhì)折疊態(tài)結(jié)構(gòu)可以視為內(nèi)部具有疏水球團(tuán)核心、外部擁有親水表面層的類(lèi)球形結(jié)構(gòu).圖3給出了肌紅蛋白Myoglobin的折疊態(tài)結(jié)構(gòu)示意圖.外層親水殘基中,小球狀原子共價(jià)鍵連接模型(紅色)表示帶負(fù)電(acidic)殘基(包括AspGlu),棒狀模型(藍(lán)色)表示帶正電(basic)殘基(包括LysArg),球形模型(綠色)表示極性(polar)殘基(包括Ser,Thr,Tyr,His,Cys,Asn,Gln,Trp);內(nèi)部球狀(白色)殘基(具有范德華半徑的實(shí)心球狀模型)表示疏水(hydrophobic)殘基(包括AlaValPheProMetIleLeu).氨基酸縮寫(xiě)名稱(chēng)表示Gly:氨基乙酸,Ala:丙胺酸,Val:纈氨酸,Phe:苯基丙氨酸,Pro:脯氨酸,Met:蛋氨酸,Ile:異亮氨酸,Leu:亮氨酸,Asp天(門(mén))冬氨酸,Glu:谷氨酸,Lys:賴(lài)氨酸,Arg:精氨酸Ser:絲氨酸Thr:蘇氨酸Tyr:酪氨酸His:組氨酸Cys:半胱氨酸Asn:天冬酰胺酸Gln:谷氨酸鹽Trp:色氨酸.疏水作用是水溶液環(huán)境下球形蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力,疏水殘基遠(yuǎn)離溶液環(huán)境并向蛋白質(zhì)核心的埋藏過(guò)程導(dǎo)致了結(jié)構(gòu)的快速折疊1959年,Kauzmann提出通過(guò)改變周?chē)芤嚎梢詼y(cè)量疏水殘基自由能變化,并指出疏水殘基進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部后,自由能降低約為-8kcal/mol至-25kcal/mol.這個(gè)結(jié)果表明疏水作用是蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中最為重要的能量因素.一般認(rèn)為,疏水作用來(lái)源于水分子氫鍵網(wǎng)絡(luò)被疏水殘基破壞后引起的熵減效應(yīng).相對(duì)于氨基酸之間的直接相互作用而言,水分子相互作用是疏水效應(yīng)的更重要原因.但是,導(dǎo)致疏水作用的熱力學(xué)因素十分復(fù)雜,至今為止,直接給出疏水作用的定量計(jì)算公式仍然十分困難.4.2疏水作用的物理基礎(chǔ)疏水基團(tuán)溶解的熱力學(xué)過(guò)程是理解疏水作用的關(guān)鍵,許多學(xué)者研究了驅(qū)動(dòng)疏水基團(tuán)發(fā)生聚集的統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)機(jī)制[101,119,124,125,126,127,128],特別是溶液環(huán)境下水分子與疏水基團(tuán)之間的交界面特征.由于疏水基團(tuán)在蛋白質(zhì)內(nèi)部的聚集,引起結(jié)構(gòu)中疏水相和親水相的分離,并形成分界面.與均勻液體中分子之間相互作用的距離相比,界面的尺度相當(dāng)大,足夠形成類(lèi)似于分子微團(tuán)、雙分子層等介觀(guān)尺度的結(jié)構(gòu).在溶液環(huán)境中,水分子之間形成氫鍵網(wǎng)絡(luò),分子間距離約為3～5?A.在這個(gè)尺度上,水分子的空間位置處于不斷調(diào)整過(guò)程中,彼此間的氫鍵作用也處于不斷消失–生成狀態(tài).通常認(rèn)為,在疏水基團(tuán)侵入之后,水分子會(huì)在疏水基團(tuán)周?chē)纬删哂幸?guī)則結(jié)構(gòu)的“水籠”,將疏水基團(tuán)包圍在中間.水分子網(wǎng)絡(luò)中規(guī)則結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)導(dǎo)致系統(tǒng)熵減少,因而驅(qū)使疏水基團(tuán)聚集成簇,最大程度上降低水分子–疏水基團(tuán)接觸面積,以期減少規(guī)則結(jié)構(gòu)的出現(xiàn).但是,這種剛性“籠狀”結(jié)構(gòu)的物理解釋存在明顯缺陷,普通流體分子間的相關(guān)度較弱,還不足以形成類(lèi)似晶體結(jié)構(gòu)的規(guī)則“水籠”,特別是在具有很大接觸面積的疏水基團(tuán)附近,“籠狀”結(jié)構(gòu)在幾何上更難以想象.疏水基團(tuán)在水溶液中阻斷氫鍵網(wǎng)絡(luò),排斥水分子并侵占近似球狀的空間.在這部分“空腔”內(nèi),水分子無(wú)法存在,更不能形成氫鍵作用,因此通過(guò)研究“空腔”在水溶液中的溶解過(guò)程,可以進(jìn)一步了解疏水作用的物理基礎(chǔ).溶液中“空腔”水合作用(hydration)的研究指出,對(duì)于較小的疏水基團(tuán)(如甲烷分子),其體積尺度小于5?A,相對(duì)于水分子之間氫鍵的作用尺度(3～5?A)來(lái)說(shuō),在無(wú)需打斷水分子氫鍵的情況下,這類(lèi)小分子就能夠存在于水分子氫鍵網(wǎng)絡(luò)的空隙之中(見(jiàn)圖4).水分子之間通過(guò)調(diào)整彼此間相對(duì)位置,使氫鍵分布在疏水小分子附近,這個(gè)氫鍵位置重新分布過(guò)程近似于水溶液中氫鍵網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)動(dòng)態(tài)調(diào)整過(guò)程.對(duì)于具有較大體積的疏水基團(tuán)來(lái)說(shuō),基團(tuán)表面積較大(常超過(guò)10?A2)且曲率較低,表面附近的水分子無(wú)法形成并維持完整的氫鍵網(wǎng)絡(luò).在水溶液中每個(gè)水分子可以與周?chē)?個(gè)水分子形成氫鍵,而在大疏水基團(tuán)附近,每個(gè)水分子平均氫鍵個(gè)數(shù)只有2～3個(gè).因此,水分子具有遠(yuǎn)離大疏水基團(tuán)的趨勢(shì),并在基團(tuán)附近形成類(lèi)似于液體–氣體的交界面.自由能是熱力學(xué)系統(tǒng)狀態(tài)發(fā)生改變的重要因素.分子溶解自由能?G是指溶液結(jié)構(gòu)重新調(diào)整并使溶質(zhì)發(fā)生溶解的可逆功,包含焓的改變量?H和熵的改變量?S式中T是絕對(duì)溫度.焓表示分子之間相互作用勢(shì)能的平均強(qiáng)度,熵表示了分子之間相關(guān)性或者分子結(jié)構(gòu)的有序程度.在熱力學(xué)狀態(tài)改變過(guò)程中,當(dāng)分子之間的相互作用發(fā)生明顯改變時(shí)(如氫鍵數(shù)量的減少和液體–氣體界面的生成),自由能?G主要受焓的影響,?G/T隨溫度的升高而降低.在熱力學(xué)狀態(tài)改變過(guò)程中,當(dāng)氫鍵在空間中產(chǎn)生特殊排布結(jié)構(gòu)時(shí)(如氫鍵網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)規(guī)則界面),自由能主要受熵的影響.室溫下,小疏水基團(tuán)在溶液中的水合作用受到熵的控制,自由能?G隨溫度的升高而增加.自由能給出了分子系統(tǒng)的變化趨勢(shì),當(dāng)分子系統(tǒng)變化過(guò)程導(dǎo)致?G<0時(shí),該過(guò)程使系統(tǒng)趨向于平衡態(tài),是一個(gè)自發(fā)過(guò)程(spontaneousprocess).因此,在焓改變量?H的最小化和熵改變量?S的最大化推動(dòng)下,分子系統(tǒng)到達(dá)平衡狀態(tài).在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中,打開(kāi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可取的空間構(gòu)型數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于折疊態(tài)結(jié)構(gòu),即?S>0;疏水、氫鍵等非共價(jià)作用使折疊態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保持緊密,破壞這些作用力并使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打開(kāi)需要輸入能量,因此?H>0.根據(jù)自由能的定義,?G依賴(lài)于焓?H和熵?S值的變化,自由能改變量有可能是正值,也有可能是負(fù)值.通過(guò)Boltzmann因子,分子在溶液環(huán)境中的溶解概率P與分子溶解自由能?G之間建立了明確的關(guān)系式中kB是Boltzmann常數(shù).在室溫和標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下,液相水和氣相水之間能夠共存(coexistence),氣、液兩相的水分子之間存在一個(gè)交界面,這是因?yàn)橐合嗨肿舆M(jìn)入氣相水內(nèi)部需要耗費(fèi)較大熱能.理論分析和模擬計(jì)算[134,135,136,137]發(fā)現(xiàn),液體水中的空腔周?chē)嬖诮唤缑?而且液體–空腔界面與液體–氣體水分子交界面十分相似.較大球形空腔的水合作用需要的自由能是式中,R是球形空間半徑,γ是液體–氣體表面的張力,p是空腔內(nèi)壓力.當(dāng)空腔很大(甚至達(dá)到宏觀(guān)尺度)時(shí),壓力項(xiàng)(與體積成線(xiàn)性關(guān)系)4πR3p/3十分重要;當(dāng)空腔較小時(shí),張力項(xiàng)4πR2γ(與面積成線(xiàn)性關(guān)系)十分重要,而壓力項(xiàng)可以忽略不計(jì).在標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力條件下,由于體積排斥作用,較大疏水殘基侵占水分子空間位置,形成無(wú)水空腔區(qū)域.水分子之間的氫鍵被打斷后,在疏水溶質(zhì)附近形成交界面.考慮到上述液體–腔體的能量分析,較大疏水溶質(zhì)的溶解自由能主要包含與腔體面積(R2)相關(guān)的能量項(xiàng).小疏水分子在水中所占體積很小,無(wú)需打斷水分子間的氫鍵,也不會(huì)形成液體–空腔交界面.在體積為v的溶液中,發(fā)現(xiàn)N個(gè)水分子的概率表示為Pv(N),則小疏水分子溶解自由能與Pv(N)有關(guān),可以表示為式中,ρ是溶液密度,χv表示分子數(shù)N的隨機(jī)漲落的均方值(mean-squarefluctuation)式中g(shù)(r)是徑向分布函數(shù)(radialdistributionfunction).在近似情況下,χv與體積v呈線(xiàn)性關(guān)系.研究表明,小疏水分子的溶解自由能與所占體積(R3)成比例,而不是面積(R2).小疏水分子溶解自由能隨體積增大而近似線(xiàn)性增長(zhǎng);大疏水基團(tuán)溶解自由能隨面積增大而近似線(xiàn)性增長(zhǎng).因此,疏水分子的溶解自由能存在尺度效應(yīng).基于溶解自由能的尺度效應(yīng),疏水分子在水溶液中將發(fā)生聚集.設(shè)水中有相互分離的n個(gè)疏水小分子(半徑為r),這些分子的總?cè)芙庾杂赡鼙硎緸槭街衚表示溶解自由能與分子體積之間的線(xiàn)性系數(shù).當(dāng)這些小分子緊密聚集在一起時(shí),形成較大疏水單元(體積為V,表面積為S,半徑為R),此時(shí)溶解自由能與單元面積呈線(xiàn)性關(guān)系,分子溶解自由能表示為式中K表示溶解自由能與分子面積之間的線(xiàn)性系數(shù).當(dāng)n足夠大,且小分子發(fā)生緊密聚集的條件下,大疏水單元的體積近似等于小分子體積之和,即滿(mǎn)足下式因此得到則疏水分子發(fā)生聚集前后的溶解自由能之比可表示為從式中可以看出,當(dāng)大疏水單元的體積/面積比(V/S)很大時(shí),處于聚集狀態(tài)的疏水分子具有相對(duì)更低的溶解自由能,因而該狀態(tài)更穩(wěn)定.對(duì)于小疏水分子,溶解自由能主要受系統(tǒng)熵的影響(由水分子氫鍵結(jié)構(gòu)調(diào)整引起);對(duì)于大疏水單元,溶解自由能主要受到系統(tǒng)焓的影響(由界面附近水分子氫鍵數(shù)目的減少引起).在水溶液環(huán)境中,疏水作用的尺度效應(yīng)來(lái)源于熵與焓之間的相互競(jìng)爭(zhēng)、相互平衡,這也是使疏水分子發(fā)生聚集的驅(qū)動(dòng)力.除了體積排斥作用外,疏水基團(tuán)與水分子之間還存在范德華力作用,同時(shí),疏水殘基的羰基、氨基一端具有極性,與水分子之間還會(huì)發(fā)生親水作用.盡管這些作用相對(duì)較弱,仍然影響水分子–疏水基團(tuán)界面的位置和形狀.5氫鍵作用的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性5.1氨基酸功能片段n—?dú)滏I—–蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要作用力氫鍵是氫原子與其他電負(fù)性(electronegative)原子(如氧原子、氮原子等)之間形成的吸引作用,該氫原子通常已經(jīng)與其它電負(fù)性原子形成共價(jià)鍵(covalentbond).氫鍵一般被描述為電偶極子(dipole)之間的靜電作用,同時(shí),氫鍵也具有部分共價(jià)鍵的性質(zhì).例如,氫鍵具有方向性,只有當(dāng)羰基(C==O)和氨基(N—H)之間滿(mǎn)足一定的角度時(shí),才能形成氫鍵,氫鍵的方向性使相鄰水分子之間只能存在4個(gè)氫鍵;氫鍵具有較大的強(qiáng)度,形成氫鍵的兩個(gè)原子(H和電負(fù)性原子)之間的距離小于二者的范德華半徑,這表明存在電子云的部分重合.在氫鍵中,提供氫原子的一方常稱(chēng)為供氫者(donor),另外一方稱(chēng)為受氫者(acceptor).氫鍵在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,早在1951年,Pauling和Corey等學(xué)者就指出氫鍵是形成α螺旋(helix)和β片層(sheet)的重要作用力.通過(guò)對(duì)比氨基酸與水分子和氨基酸與氨基酸之間氫鍵能量的差異,可以估計(jì)出氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的貢獻(xiàn)(見(jiàn)圖5).Pauling等學(xué)者給出了氨基酸功能基團(tuán)N—H···O==C之間氫鍵能量(約-8kcal/mol);Schellmann首次測(cè)量了蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)中氨基酸之間氫鍵的強(qiáng)度,結(jié)果表明氫鍵帶來(lái)的焓變化量?H是形成螺旋結(jié)構(gòu)的驅(qū)動(dòng)力,水溶液中?H(enthalpychange)約為-1.5kcal/mol.直到1959年,Kauzmann指出非極性基團(tuán)的疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力(這個(gè)結(jié)論得到不斷證實(shí)并被普遍接受),氫鍵作為蛋白質(zhì)折疊驅(qū)動(dòng)力的地位才逐漸被疏水作用取代.盡管疏水作用在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)塌縮和結(jié)構(gòu)自組裝(self-assembly)中扮演著重要角色,然而蛋白質(zhì)折疊絕非簡(jiǎn)單的掩埋疏水殘基、暴露親水殘基過(guò)程.在疏水作用的驅(qū)動(dòng)下,普通油脂也會(huì)在水中發(fā)生聚集,但是并不具有穩(wěn)定的特殊空間結(jié)構(gòu).因此,僅僅依靠疏水作用還不足以解釋為何蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定的自然態(tài)結(jié)構(gòu).包括氫鍵在內(nèi)的多種作用力是蛋白質(zhì)形成特殊結(jié)構(gòu)的重要原因,在這些作用力的共同驅(qū)使下,殘基側(cè)鏈在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成三維拼圖游戲(jigsawpuzzle)一樣的相互填補(bǔ),并使蛋白質(zhì)的緊密程度近似于晶體結(jié)構(gòu).非極性殘基在蛋白質(zhì)內(nèi)部的聚集被認(rèn)為是形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的推動(dòng)力,殘基之間氫鍵作用則決定了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu).例如,在α螺旋結(jié)構(gòu)中,第i個(gè)殘基的羰基(C==O)與第i+4個(gè)殘基的氨基(N—H)之間形成氫鍵,規(guī)則的氫鍵分布使蛋白質(zhì)主鏈形成螺旋狀結(jié)構(gòu);與α螺旋相似,不同的氫鍵排布方式還導(dǎo)致其他類(lèi)型螺旋結(jié)構(gòu),如310螺旋結(jié)構(gòu)(第i和第i+3個(gè)殘基之間形成氫鍵)和π螺旋(第i和第i+5個(gè)殘基之間形成氫鍵).判斷氨基酸殘基之間是否存在氫鍵的法則包括距離–角度、氫鍵能量等方面.較為簡(jiǎn)單的判別準(zhǔn)則認(rèn)為,如果在N—H和C==O之間存在氫鍵原子N—H—O形成的角度θ和原子距離rHO應(yīng)該滿(mǎn)足條件[145-147]根據(jù)這個(gè)法則,大約90%的蛋白質(zhì)主鏈N—H和C==O基團(tuán)之間存在氫鍵.在更為細(xì)致的氫鍵判斷準(zhǔn)則中,通過(guò)計(jì)算帶電原子之間的的Coulomb能量(圖5),也可以判斷殘基之間是否存在氫鍵式中,f=332kcal/e2,δ+和δ-是原子的殘余電荷,單位是電子電量e,rNO是N—O原子之間距離,rHC是H—C原子之間距離,rHO是H—O原子之間距離,rNC是N—C原子之間距離.當(dāng)氫鍵庫(kù)侖能量小于閾值時(shí)(如E<-0.5kcal/mol),可以認(rèn)為殘基之間形成了氫鍵.基于這個(gè)法則,大約有62%的蛋白質(zhì)主鏈N—H和C==O基團(tuán)之間存在氫鍵.5.2u2004氫鍵幾何特征一般認(rèn)為,氫鍵包含電偶極子(electricdipole)的靜電(electrostatic)作用和部分共價(jià)(covalent)作用.研究表明,庫(kù)侖靜電作用在氫鍵強(qiáng)度中占重要地位(約75%),共價(jià)作用所占比例少于5%通過(guò)對(duì)晶體結(jié)構(gòu)中氫鍵幾何特征的研究,可以導(dǎo)出氫鍵能量Ehb的經(jīng)驗(yàn)公式式中,rm表示N—O原子間的平衡距離,Em是該距離對(duì)應(yīng)最低能量.對(duì)于蛋白質(zhì)主鏈的氫鍵,一般取rm=3?A.與原子共價(jià)鍵之間角度有關(guān)的能量項(xiàng)為式中,角度θ,ti,t0的含義見(jiàn)圖6.5.3蛋白分子中氫鍵穩(wěn)定性的研究蛋白質(zhì)折疊發(fā)生在水溶液中,周?chē)嬖诖罅克肿硬⑿纬蓺滏I網(wǎng)絡(luò).蛋白質(zhì)的極性殘基和帶電殘基與水分子形成氫鍵、靜電作用,因而受到水分子的吸引;疏水殘基則阻礙水分子間形成氫鍵,因此受到水分子的排斥.通過(guò)將疏水殘基掩埋到蛋白質(zhì)內(nèi)部,水分子可以把缺失氫鍵引起的自由能改變量降低到最小.但是,當(dāng)疏水殘基進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部時(shí),殘基主鏈部分的極性基團(tuán)N—N和C==O也被帶入遠(yuǎn)離水分子的內(nèi)部環(huán)境,喪失與水分子形成氫鍵的機(jī)會(huì).主鏈極性基團(tuán)與水分子之間氫鍵的斷開(kāi)導(dǎo)致自由能增加.為了使結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,身處蛋白質(zhì)內(nèi)部的主鏈極性基團(tuán)必須彼此配對(duì),重新形成氫鍵作用,這樣就催生了規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu).氫鍵的有規(guī)律分布對(duì)自然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)起到固定作用.多數(shù)氫鍵處于蛋白質(zhì)內(nèi)部,其余則分布在蛋白質(zhì)表面,受到水分子從四面八方的不斷沖擊.在一定溶液條件下,當(dāng)暴露在水溶液中的氫鍵被打斷時(shí),水分子就可以逐步深入到蛋白質(zhì)內(nèi)部,并試圖斷開(kāi)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的氫鍵,直至最終打開(kāi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所有氫鍵.這時(shí)候,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生去折疊.與氫鍵本身的能量相比,氨基酸之間形成氫鍵的自由能變化量更具意義.在蛋白質(zhì)分子中,氨基酸殘基之間存在氫鍵作用(CO···HN);同時(shí),氨基酸殘基也能與水分子形成氫鍵(CO···HOH和NH···OH2,見(jiàn)式(17)).因此,水溶液對(duì)氨基酸之間的氫鍵有強(qiáng)烈的破壞作用,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性取決于氨基酸–氨基酸之間的氫鍵是否比氨基酸–水分子之間的氫鍵更穩(wěn)定[155,156,157,158].蛋白質(zhì)分子中氫鍵熱力學(xué)穩(wěn)定性的研究仍然存在不一致的觀(guān)點(diǎn).20世紀(jì)五六十年代,Schellman等學(xué)者研究了包含氫鍵(hydrogen-bonded)的多肽鏈從折疊態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)長(zhǎng)鏈(randomchain)過(guò)程中自由能的改變,對(duì)聚氨基乙酸(polyglycine)形成的螺旋(helix)和片層(sheet)結(jié)構(gòu)自由能估算表明,水溶液中極性基團(tuán)之間氫鍵的穩(wěn)定性較為微弱,殘基形成一個(gè)氫鍵帶來(lái)的焓(enthalpy)降低約為-1.5kcal/mol自由能最多降低約為-0.6kcal/mol.不同類(lèi)型的氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)對(duì)殘基氫鍵穩(wěn)定性也有影響,依據(jù)側(cè)鏈性質(zhì)和空間分布的不同,會(huì)加強(qiáng)或削弱折疊態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.1962年Klotz和Franzen研究了在不同溶液環(huán)境下N-甲基乙酰胺(N-Methylacetamide)的紅外吸收光譜(infraredspectroscopy).N-甲基乙酰胺是一種小分子化合物,分子式為C3H7NO,分子結(jié)構(gòu)是,能夠很好表示殘基之間氫鍵作用.對(duì)N-甲基乙酰胺(N-Methylacetamide)的二聚化(dimerization)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在25?C條件下,極性溶液(水溶液)中C==O和N—H形成氫鍵的自由能變化為正值(約3.1kcal/mol),因此氨基化合物之間(interamide)的氫鍵十分不穩(wěn)定;在二氧雜環(huán)乙烷(dioxane)溶液中,盡管介電常數(shù)(dielectricconstant)很低(大約為2)氨基化合物之間的氫鍵穩(wěn)定性仍然較弱(形成氫鍵的自由能約0.39kcal/mol);只有在四氯化碳(carbontetrachloride)有機(jī)溶液中,氨基化合物之間的氫鍵才能穩(wěn)定存在(形成氫鍵的自由能約-0.92kcal/mol).因此他們認(rèn)為,除了少數(shù)介電常數(shù)非常低的局部區(qū)域外,在極性溶液中殘基氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定作用貢獻(xiàn)不大.另一種觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為氫鍵是自然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的最主要原因.Fersht等學(xué)者研究了水溶液中酪氨酰–tRNA合成酶(tyrosyl-tRNAsynthetase)的突變體與基質(zhì)(substrate)之間的氫鍵作用,通過(guò)突變合成酶的某些氨基酸側(cè)鏈,可以使酶與基質(zhì)之間的氫鍵斷開(kāi),并計(jì)算出氫鍵斷開(kāi)前后的自由能變化.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),極性基團(tuán)之間形成氫鍵帶來(lái)的自由能降低大約為-0.5kcal/mo至-1.8kcal/mol,當(dāng)氫鍵的供氫者或受氫者帶電荷時(shí),自由能降低量進(jìn)一步達(dá)到-3.5kcal/mol至-4.5kcal/mol.單聚物(monomer)的二聚化(dimerization)過(guò)程研究表明,分子間氫鍵的形成增加了雙分子系統(tǒng)的約束,使分子的平移和旋轉(zhuǎn)自由度喪失,導(dǎo)致了很大的熵減少,正是這部分熵減(而非氫鍵本身的能量)使二聚物不穩(wěn)定.從熵?fù)p失角度說(shuō),兩個(gè)相互獨(dú)立的自由分子之間形成氫鍵的二聚化過(guò)程,并不等價(jià)于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部氫鍵的形成過(guò)程.這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中絕大部分氫鍵是在分子內(nèi)部形成的,該過(guò)程引起的熵?fù)p失很小,反應(yīng)平衡常數(shù)(equilibriumconstant)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單分子之間的二聚化.因此,自由分子二聚化實(shí)驗(yàn)低估了氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用.即使二聚物在極性溶液(水)中不穩(wěn)定,也不能得到“氫鍵不是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要驅(qū)動(dòng)作用”的結(jié)論.通過(guò)消除分子平移、旋轉(zhuǎn)熵?fù)p失的影響,Doig和Williams研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論是在極性溶液(水)還是在非極性溶液(四氯化碳(tetrachloromethane))中,氫鍵對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用都比預(yù)想的要大許多,因此氨基化合物之間的氫鍵作用為折疊態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提供了強(qiáng)大的驅(qū)動(dòng)力.Shirley等研究了核糖核酸酶T1(ribonucleaseT1)突變體的氫鍵變化和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,給出了氫鍵對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的平均能量貢獻(xiàn)(約為-1.3kcal/mol),并指出氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用與疏水作用同樣重要.如果在水環(huán)境下殘基之間形成一個(gè)氫鍵帶來(lái)的焓改變量為?H=-1kcal/mol,那么,對(duì)于包含100個(gè)氫鍵的蛋白質(zhì)分子來(lái)說(shuō),能量降低約為-100kcal/mol.普通小蛋白質(zhì)分子折疊的能量勢(shì)壘(energybarrier)約為-20kcal/mol至-60kcal/mol,而自由能的漲落(fluctuation)甚至更小(約小于5kcal/mol),因此,氫鍵能量對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響將是巨大的.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氫鍵強(qiáng)度與周?chē)h(huán)境的相對(duì)介電常數(shù)εr也有關(guān)系.在一個(gè)大氣壓、溫度為25?C條件下,純水的相對(duì)介電常數(shù)(relativedielectricconstant)為εr=78.5;在蛋白質(zhì)內(nèi)部,相對(duì)介電常數(shù)為εr=4.考慮到氫鍵的Coulomb作用力,在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氫鍵作用具有較大的強(qiáng)度,使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定.這些相對(duì)較強(qiáng)的氫鍵往往被疏水殘基的側(cè)鏈包裹,周?chē)^少出現(xiàn)水分子,形成遠(yuǎn)離水分子的“干燥”區(qū)域.對(duì)氫鍵熱力學(xué)穩(wěn)定性的研究仍然面臨著許多挑戰(zhàn),特別是缺少合適的化合物分子模型,使氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的能量分析更加復(fù)雜,導(dǎo)致不同的結(jié)論.水分子之間氫鍵的斷開(kāi)導(dǎo)致系統(tǒng)焓的增加,同時(shí)也導(dǎo)致系統(tǒng)熵的增加,這兩部分能量變化具有相互抵消作用.熵和焓對(duì)自由能變化的影響有一部分相互抵消后,剩余部分使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)處于穩(wěn)定與不穩(wěn)定的邊緣,任何微小的自由能變化都會(huì)帶來(lái)很大影響.在極性溶液(水)環(huán)境中,水分子與殘基之間存在氫鍵作用,約束了水分子的空間平移和旋轉(zhuǎn)自由度,因此氫鍵穩(wěn)定性主要是水分子熵變化驅(qū)動(dòng)的.水分子不斷從四周碰撞蛋白質(zhì)分子,傾向于使熵?fù)p失降低到盡可能小的程度.在非極性溶液環(huán)境中,氫鍵對(duì)結(jié)構(gòu)的約束作用源于焓和熵兩部分,與氫鍵數(shù)量及電荷分布密切相關(guān).面對(duì)折疊態(tài)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部殘基–殘基氫鍵和去折疊態(tài)蛋白質(zhì)殘基–水分子氫鍵,如果比較兩者的穩(wěn)定性,至少需要理解下述復(fù)雜的過(guò)程:在水溶液中(高介電常數(shù))和蛋白質(zhì)內(nèi)部(低介電常數(shù))形成氫鍵時(shí)焓(enthalpy)的定量計(jì)算;殘基進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部并形成氫鍵引起的去溶劑化(desolvation)能量損失;殘基間氫鍵引起的側(cè)鏈和水分子構(gòu)型熵(configurationentropy)的變化;殘基間氫鍵強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)分子幾何構(gòu)型的依賴(lài)關(guān)系.目前,關(guān)于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部氫鍵的熱力學(xué)穩(wěn)定性問(wèn)題仍然在持續(xù)不斷進(jìn)行.6靜電力對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的影響6.1鹽橋靜電作用靜電力(electrostaticinteraction)在蛋白質(zhì)折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中扮演著重要的角色,例如,在極端的酸堿度(pH)環(huán)境下,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊.然而,對(duì)靜電力的精確描述仍然十分困難,靜電作用如何影響蛋白質(zhì)折疊過(guò)程也是不易理解的.這其中的部分原因來(lái)自靜電力對(duì)溶液環(huán)境以及結(jié)構(gòu)幾何屬性的依賴(lài)等.構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中包含帶正電(如Lys,Arg)和帶負(fù)電(如Asp,Glu)的氨基酸,還包含具有極性但是不發(fā)生電離的氨基酸(如AsnGln,Ser,Thr,Tyr);同時(shí),由于肽鍵(peptidebond)具有共振結(jié)構(gòu)(resonancestructure),蛋白質(zhì)主鏈上肽鍵兩側(cè)的C==O和N—H基團(tuán)也具有殘余電荷(O原子-0.28電子電荷,N原子0.28電子電荷),使肽鍵稱(chēng)為一個(gè)永久電偶極子.當(dāng)具有相反電荷的殘基或帶電基團(tuán)相互接觸時(shí)(如距離小于5?A),彼此之間會(huì)產(chǎn)生靜電作用,這種非共價(jià)鍵作用稱(chēng)為鹽橋(saltbridge).鹽橋靜電作用對(duì)結(jié)構(gòu)自由能的貢獻(xiàn)可以從三方面考慮:帶電殘基之間相互作用,電荷與永久電偶極子之間相互作用,電荷去溶劑化引起的能量改變.鹽橋?qū)Φ鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用十分復(fù)雜,因而使靜電自由能受多種因素影響(如溶液pH值、蛋白質(zhì)幾何形狀等).對(duì)于水溶液中的球形蛋白質(zhì)(globularprotein)來(lái)說(shuō),周?chē)浅錆M(mǎn)極性分子的溶液環(huán)境,蛋白質(zhì)內(nèi)部是遠(yuǎn)離溶液的疏水環(huán)境.一方面,帶電殘基傾向于蛋白質(zhì)外部的極性環(huán)境,但折疊過(guò)程中部分帶電殘基進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部,電荷在內(nèi)部的聚集產(chǎn)生去溶劑化和規(guī)則分布效果.去溶劑化引起焓增加,規(guī)則分布引起熵減少,導(dǎo)致自由能增加和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,這部分能量變化稱(chēng)為去溶劑化消耗(desolvationcost).另一方面,帶電殘基與結(jié)構(gòu)內(nèi)部的其他帶電殘基(或永久電偶極子)形成鹽橋的靜電吸引作用,能夠使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定.因此,靜電作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定還是更加不穩(wěn)定,取決于占主導(dǎo)地位的是去溶劑化消耗還是電荷靜電吸引作用.蛋白質(zhì)內(nèi)部鹽橋吸引作用帶來(lái)自由能降低,如果這部分自由能降低無(wú)法抵消去溶劑化引起的自由能增加,那么蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加不穩(wěn)定.帶電殘基的去溶劑化和電荷吸引是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的兩個(gè)對(duì)立面,兩者都依賴(lài)于多種因素,如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變引起的帶電殘基重新分布,溶液pH值對(duì)殘基電荷的影響,蛋白質(zhì)內(nèi)部介電常數(shù)的估計(jì)等.這些因素的任何微小變化都會(huì)改變雙方的地位,使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性發(fā)生逆轉(zhuǎn).因此,靜電作用的自由能處于臨界狀態(tài),介乎穩(wěn)定和不穩(wěn)定之間.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性依賴(lài)于折疊態(tài)結(jié)構(gòu)自由能GF與去折疊態(tài)結(jié)構(gòu)自由能GU之間的差異?GU=GU-GF,?GU是打開(kāi)折疊態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所需的自由能.如果?GU>0,那么折疊態(tài)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定.與此類(lèi)似,鹽橋靜電作用對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響可以表示為式中?GUsb表示打開(kāi)具有鹽橋靜電作用的折疊態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所需自由能,?GUnon-sb表示打開(kāi)缺少鹽橋靜電作用的折疊態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所需自由能,??GU表示鹽橋靜電作用對(duì)打開(kāi)折疊態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所需自由能的貢獻(xiàn).如果??GU>0,那么鹽橋靜電作用使蛋白質(zhì)折疊態(tài)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定;反之,則靜電作用使結(jié)構(gòu)更加不穩(wěn)定.6.2靜電作用的主要影響因素6.2.1氨基酸bach的測(cè)量靜電作用的自由能改變與溶液pH值密切相關(guān),根本原因在于pH值對(duì)帶電殘基電荷的影響可電離(ionable)殘基的帶電狀態(tài)由酸度系數(shù)(aciddissociationconstant)Ka或其對(duì)數(shù)pKa表示.在氨基酸的離解(dissociation)過(guò)程氨基酸HA發(fā)生去質(zhì)子化(deprotonated),成為酸(acid)A-.酸度系數(shù)Ka是離解化學(xué)反應(yīng)的平衡常數(shù)Ka定量描述了溶液中酸性物質(zhì)的強(qiáng)度.由于Ka的數(shù)值范圍很大,通常使用對(duì)數(shù)表示酸度系數(shù)pKa的值越大,氨基酸離解的程度越弱.弱酸在水中的pKa值通常處于[-2,12],pKa<-2表示強(qiáng)酸.當(dāng)氨基酸去質(zhì)子化(丟失一個(gè)H+)之后,帶有負(fù)電荷;同時(shí),被質(zhì)子化的氨基酸得到一個(gè)H+,帶有正電荷.氨基酸的帶電狀態(tài)通過(guò)HendersonHasselbach方程描述當(dāng)pH值比pKa小2時(shí),HendersonHasselbach方程可以寫(xiě)為[A-]/[HA]=0.01,表示氨基酸99%被質(zhì)子化(具有正電荷);當(dāng)pH值比pKa大2時(shí),方程可以寫(xiě)為[A-]/[HA]=100,表示氨基酸99%被去質(zhì)子化(具有負(fù)電荷).帶電氨基酸殘基的pKa值代表該氨基酸的電離程度,即所帶電荷的強(qiáng)度.理論和實(shí)驗(yàn)研究表明,與孤立狀態(tài)的氨基酸相比,處于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基所帶電荷會(huì)發(fā)生改變,稱(chēng)為pKa漂移(pKashift)這種變化源于殘基與結(jié)構(gòu)中其他帶電基團(tuán)的相互作用,也包括與極性溶液環(huán)境的相互作用.利用Poisson–Boltzmann差分方法計(jì)算靜電自由能發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與環(huán)境pH值之間存在依賴(lài)關(guān)系.因此,溶液環(huán)境的pH值決定了氨基酸帶電狀態(tài),也對(duì)蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中靜電作用的自由能改變(即結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性)具有重要影響.6.2.2帶殘基的靜電常數(shù)如果將蛋白質(zhì)內(nèi)部看作具有較低介電常數(shù)的均勻連續(xù)體,將外部水環(huán)境看作具有較高介電常數(shù)的均勻連續(xù)體,同時(shí)設(shè)游離帶電離子滿(mǎn)足Boltzmann分布,可以建立Poisson–Boltzmann模型計(jì)算靜電作用的能量式中,?是靜電作用勢(shì)能,ε是介電常數(shù),qi是第i種帶電離子的電荷,ni是第i種帶電離子的濃度,kB是Boltzmann常數(shù),T是絕對(duì)溫度.在得到?之后,可以計(jì)算出帶電殘基能量Gele式中,qi是第i個(gè)殘基的殘余電荷,?i是第i個(gè)殘基所處位置的靜電勢(shì)能.在Poisson–Boltzmann模型中,殘基靜電能與介電常數(shù)ε成反比例,因此,將帶電殘基從極性(高ε值)水環(huán)境中移至非極性(低ε值)需要消耗能量,即去溶劑化消耗.ε的變化程度直接影響能量消耗的多少.為了計(jì)算折疊過(guò)程中帶電殘基位置變化引起的靜電自由能改變,需要給出蛋白質(zhì)內(nèi)部的介電常數(shù)ε.電荷周?chē)h(huán)境的介電常數(shù)可以表示為ε=εrε0,這里ε0=8.854187817×10-12F/m是真空中介電常數(shù),εr是相對(duì)介電常數(shù).通常認(rèn)為,水溶液中εr≈80,蛋白質(zhì)內(nèi)部εr≈4,但是研究表明,將蛋白質(zhì)內(nèi)部的相對(duì)介電常數(shù)設(shè)為εr=20能夠得到更好的結(jié)果,蛋白質(zhì)的pKa計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加吻合.一個(gè)可能的解釋是,由于Poisson–Boltzmann模型忽略了結(jié)構(gòu)改變引起的pKa漂移現(xiàn)象,給計(jì)算結(jié)果帶來(lái)誤差,而較高的介電常數(shù)可以抵消這部分誤差.電荷產(chǎn)生的靜電場(chǎng)會(huì)使電場(chǎng)中其他電荷重新排布(圖7),如果考慮蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和溶液中每個(gè)原子的極化現(xiàn)象,可以精確計(jì)算靜電作用的自由能.另一種較為簡(jiǎn)單方法是通過(guò)介電常數(shù)表示電荷產(chǎn)生的屏蔽作用(shielding).在靜電力計(jì)算中,通常把蛋白質(zhì)看作一個(gè)均勻介質(zhì),利用單一的介電常數(shù)ε表示其極化程度.然而,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)是非均勻的,不同區(qū)域具有不同的極化程度.在蛋白質(zhì)與水環(huán)境的接觸表面附近,電荷引起的極化程度較高,對(duì)應(yīng)較大介電常數(shù);在遠(yuǎn)離水分子的蛋白質(zhì)內(nèi)部,極化程度較低,對(duì)應(yīng)較小的介電常數(shù).同時(shí),考慮到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在折疊過(guò)程中不斷發(fā)生變化,帶電基團(tuán)在空間的重新