利用鐵離子螯合雞肽制備肽鐵螯合物的工藝優(yōu)化

利用鐵離子螯合雞肽制備肽鐵螯合物的工藝優(yōu)化

鐵是人體所必需的養(yǎng)分。人體中鐵元素的缺乏會(huì)影響血液和碳水化合物的合成并導(dǎo)致準(zhǔn)血糖癥（ida）。ida是最常見的養(yǎng)分不足。世界上約10.30%的人缺乏鐵，其中大多數(shù)是女性、兒童和老年人，這在發(fā)展中國(guó)家的比例很高。目前利用補(bǔ)鐵劑強(qiáng)化食品是防治IDA的主要手段。FeSO4等非血紅素鐵價(jià)格低廉,但易與食物中植酸、多酚等成分形成難溶性化合物,吸收率較低并易產(chǎn)生內(nèi)源性自由基導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化。血紅素鐵比非血紅素鐵的利用率高,但最高也只達(dá)25%左右并有異味。氨基酸螯合鐵在動(dòng)物體內(nèi)的利用率是同水平FeSO4的近2倍,研究表明氨基酸螯合鹽可能以短肽的形式整體被小腸吸收,直接進(jìn)入機(jī)體組織?；钚噪尿翔F是以蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的活性肽為原料,與鐵離子絡(luò)合形成的螯合物。與氨基酸相比,肽的吸收效率更高且不易飽和,例如二肽和三肽的吸收速度高于同一組份的氨基酸,其原因在于小腸粘膜上存在專門的短肽載體,從而能夠以完整形式吸收。以活性肽為原料開發(fā)吸收利用率更高、生理作用更強(qiáng)的新型補(bǔ)鐵劑,正成為目前國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)。烏雞(GallusgallusdomesticusBrisson),又名烏骨雞,具有補(bǔ)氣養(yǎng)血的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)作用。我們前期通過(guò)復(fù)合酶解等手段制備烏雞低聚肽,其中分子質(zhì)量分布在140~500Da之間的短肽高達(dá)75.70%,多為易被人體直接吸收的二肽、三肽,體外檢測(cè)表明具有較高的抗氧化活性。以此為基礎(chǔ),利用烏雞肽螯合鐵將可以協(xié)同生物活性肽的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和促進(jìn)礦物質(zhì)吸收功能,多方面強(qiáng)化烏雞補(bǔ)鐵的功效。因此,本文采用來(lái)源于中國(guó)特有雞種烏雞的低聚肽作為原料,以FeCl2作為鐵源研究了制備烏雞肽鐵螯合物的最優(yōu)工藝,并通過(guò)紅外光譜分析確定了螯合結(jié)構(gòu),為新型活性肽補(bǔ)鐵劑的開發(fā)以及烏雞資源的利用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1儀器和檢測(cè)方法烏雞低聚肽干粉(批號(hào)WS0812-081204),由北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供;FeCl2、鄰二氮菲、HCl、NaOH、抗壞血酸、無(wú)水乙醇均為分析純。電子天平(FA2004N);恒溫箱(LRH-99-250),上海一恒科技有限公司;離心機(jī)(CD4-2),北京醫(yī)用離心機(jī)廠;pH計(jì)(SJ-3F型),上海精密儀器有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JAC-Ⅳ型),濟(jì)寧市奧波超聲波電氣有限公司;紫外可見分光光度計(jì)(752型),上海美譜達(dá)儀器有限公司;循環(huán)水多用真空泵(SHZ-3),鄭州朋來(lái)儀器有限公司;Nicolet6700傅里葉變換紅外光譜儀,美國(guó)PerkinElmer公司。1.2方法1.2.1烏江醇鐵ii的制備烏雞低聚肽→溶解(密閉)→加入抗氧化劑→調(diào)整pH值→加入FeCl2→恒溫螯合→濃縮→醇沉→抽濾、洗滌→干燥得成品1.2.2鐵離子含量的測(cè)定采用硫酸亞鐵銨(Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O)配制10μg/mL鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液,吸取鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,分別加入10%抗壞血酸溶液2.0mL,鄰菲羅啉溶液3.0mL,蒸餾水定容至50mL。在37℃下反應(yīng)60min,以不加鐵離子的試劑空白溶液作參比,510nm處測(cè)定吸光度。以鐵的濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取烏雞多肽鐵0.05g,HCl輔助溶解,配制成0.1%烏雞多肽鐵溶液。準(zhǔn)確稱取1mL樣品溶液于50mL容量瓶中,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定其吸光度。鐵離子含量(mg/kg)=Cm×V1/V0(mg/kg)=Cm×V1/V0式中:C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品試液相應(yīng)的鐵含量,μg;m為樣品的質(zhì)量,g;V1為測(cè)定時(shí)所取樣品試液的體積,mL;V0為樣品處理后的定容體積,mL。鐵螯合率的測(cè)定:螯合率/%=m1m0×100/%=m1m0×100式中:m1為螯合物中鐵的量,mg;m0為加入反應(yīng)體系中鐵的總量,mg。多肽鐵螯合物得率的測(cè)定:螯合物得率/%=W1W0×100/%=W1W0×100式中,W1為多肽鐵螯合物的總量,mg;W0為烏雞肽與鐵鹽的總質(zhì)量,mg。1.2.3溫度和時(shí)間對(duì)金屬離子的螯合反應(yīng)的影響影響烏雞肽螯合鐵的合成工藝的主要因素有烏雞肽濃度、配位比、反應(yīng)pH值、反應(yīng)的溫度和時(shí)間等。一般情況下,金屬離子的螯合反應(yīng)是室溫下的快速反應(yīng),溫度和時(shí)間對(duì)它的影響都不大。本實(shí)驗(yàn)采用在室溫下,即25℃下反應(yīng)30min。加入抗血酸的目的是作為抗氧化劑能夠抑制Fe2+的氧化。本文主要討論烏雞肽濃度、肽鹽比以及反應(yīng)pH對(duì)螯合效果的影響。1.2.4紅外光譜測(cè)定將固體烏雞肽鐵鰲合鹽樣品5mg,放入瑪瑙研缽中,放入干燥的光譜純KBr500mg,混合研磨均勻(在紅外燈下進(jìn)行),裝入壓片模具,壓片得到透明的KBr樣品片,利用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行定性分析,得到光譜圖。按同樣方法對(duì)烏雞肽樣品進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。儀器設(shè)備與參數(shù)設(shè)置:SpectrumGX型傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)PerkinElmer公司),DTGS檢測(cè)器,光譜范圍為4000~400cm-1;分辨率4cm-1,掃描信號(hào)累加次數(shù)為32次,掃描時(shí)扣除了水和CO2的干擾。2結(jié)果與分析2.1生產(chǎn)烏江二甲苯ii硫合物的條件選擇2.1.1反應(yīng)物濃度對(duì)烏蘇烷反應(yīng)的影響烏雞肽濃度是影響螯合反應(yīng)的一個(gè)重要因素,從反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的角度來(lái)看,較高的反應(yīng)物濃度可使反應(yīng)向生成物方向進(jìn)行得更徹底,產(chǎn)率得以提高,但是當(dāng)反應(yīng)物濃度增加到一定量時(shí)產(chǎn)率不再提高,過(guò)高的反應(yīng)物濃度會(huì)造成烏雞肽的浪費(fèi)。圖1顯示,烏雞肽在濃度為4%的時(shí)候螯合率與螯合物得率最高,選取烏雞肽濃度4%作為適宜濃度。2.1.2肽鹽比對(duì)多肽得率的影響烏雞肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比是影響螯合反應(yīng)的另一個(gè)重要因素,質(zhì)量比太小,不能形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu),螯合物不穩(wěn)定;質(zhì)量比太大,會(huì)造成多肽的浪費(fèi)。由圖2可以看出,隨著肽鹽比的增加,螯合率,螯合物得率均呈增加趨勢(shì),并且4∶1時(shí)增幅趨于平緩。推測(cè)在肽鹽比為4∶1時(shí)多肽已經(jīng)足夠螯合全部的Fe2+。選取肽鹽比4∶1作為適宜參數(shù)。2.1.3ph值對(duì)多肽鐵螯合物的影響反應(yīng)pH值是影響多肽微量元素螯合反應(yīng)的主要因素之一,在pH值較低的酸性條件下,H+將與金屬離子競(jìng)相爭(zhēng)奪供電子基團(tuán),從而不利于多肽鐵螯合物的形成;在pH值較高的堿性條件下,OH-與供電子基團(tuán)爭(zhēng)奪金屬離子,形成氫氧化物沉淀,也不利于螯合物的形成。從鐵離子含量趨勢(shì)可以看出隨著pH值的上升鐵離子含量慢慢逐漸降低,而得率則隨著pH值的上升大幅增加,至溶液呈中性時(shí)上升趨勢(shì)趨于平緩。綜合這2個(gè)因素,選擇pH=6適宜反應(yīng)pH。2.1.4雞肽文化對(duì)螯合物得率的影響選擇烏雞肽濃度、肽鹽比和反應(yīng)pH三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),如表1所示。如表2,通過(guò)對(duì)螯合率的極差分析結(jié)果可以看到,在影響螯合率的3個(gè)因素中,按主次順序排列為B>A>C,即肽鹽比對(duì)螯合率的影響最為重要,烏雞肽濃度次之,反應(yīng)pH最小。最優(yōu)組合為A2B1C1,即在烏雞肽濃度4%,肽鹽比為5∶1,反應(yīng)pH為4時(shí)螯合率最高。通過(guò)對(duì)螯合物得率的極差分析結(jié)果可以看到,在影響螯合物得率的3個(gè)因素中,按主次順序排列為A>C>B,即烏雞肽濃度對(duì)螯合物得率的影響最為重要,反應(yīng)pH值次之,肽鹽比最小。最優(yōu)組合為為A2B1C2,即在烏雞肽濃度4%,肽鹽比為5∶1,反應(yīng)pH為5時(shí)烏雞肽鐵螯合物得率最高。由于在螯合反應(yīng)調(diào)pH值前溶液本身pH較接近4,從節(jié)省時(shí)間與工藝成本上考慮,選取烏雞肽濃度4%,肽鹽比為5∶1,反應(yīng)pH為4為最適宜螯合條件。在此條件下螯合率為(84.76±0.12)%,螯合物得率(40.27±0.15)%。與方法相同的同類工藝相比,螯合率與螯合物得率相對(duì)較高,說(shuō)明烏雞肽在原料上對(duì)Fe3+的螯合更具選擇性。2.2雞肽鐵螯合物的ir圖譜由圖4可知,烏雞肽與其亞鐵螯合物吸收峰相比,在強(qiáng)弱和位置上有明顯的變化。烏雞肽鐵(Ⅱ)螯合物在3030cm-1IR的銨峰消失,而在1046cm-1處出現(xiàn)了吸收峰,說(shuō)明Fe2+與氨基有較強(qiáng)結(jié)合。在烏雞肽IR圖譜中3385cm-1處有寬吸收峰(OH與NH伸縮振動(dòng)頻率重疊),同時(shí)處在924cm-1處有吸收峰,說(shuō)明含有游離-COOH。烏雞肽鐵(Ⅱ)螯合物IR圖譜中螯合后3385cm-1處的寬吸收峰變窄,且955~915cm-1沒(méi)有吸收峰,說(shuō)明烏雞肽鐵(Ⅱ)螯合物圖譜中沒(méi)有—COOH結(jié)構(gòu)。1740cm-1附近未出現(xiàn)吸收峰,說(shuō)明烏雞肽鐵螯合物中不存在游離的羧基,推測(cè)羧基也以共價(jià)鍵的方式與鐵離子結(jié)合。此外,烏雞肽鐵(Ⅱ)螯合物IR光譜在2357cm-1處有強(qiáng)吸收峰是C≡N的特征吸收峰,其IR光譜在1046cm-1處產(chǎn)生了C—N鍵強(qiáng)吸收峰,小峰減少,說(shuō)明N—H的數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。由于氮原子的共用電子對(duì)鐵原子的貢獻(xiàn),導(dǎo)致了CN鍵偶極性的增加。3小鼠體內(nèi)小鼠中cl24hpa質(zhì)量比對(duì)烏蘇烷反應(yīng)的影響本研究通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)確定了制備烏雞肽鐵(II)螯合物的最優(yōu)工藝條