大蒜對辣椒疫霉抑制作用的研究

大蒜對辣椒疫霉抑制作用的研究

青椒感染是限制青椒生產(chǎn)的主要疾病。該病菌主要在土壤和受侵染的病殘體中存活,且寄主范圍廣,防治困難。本文利用植物與病原物相克相生的原理,探討大蒜組織揮發(fā)物和浸提液對辣椒疫霉菌的抑菌活性,以期為利用大蒜與辣椒間作或輪作減輕辣椒疫病的危害提供理論指導(dǎo)。目前辣椒疫病的防治方法主要有選育抗病品種、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等,但對該病的防治效果均不理想。生產(chǎn)實踐表明,輪作和間作是減輕土傳病害的有效方法之一。生產(chǎn)上尤其以蔥屬作物與其他作物間作或輪作對土傳病害的防治效果好。利用蔥屬作物間作或輪作控制土傳病害可能與這些作物釋放的化感物質(zhì)有關(guān)。植物化感物質(zhì)主要通過自然揮發(fā)、雨霧淋溶、根系分泌、殘渣降解、種子和花粉傳播等途徑進入環(huán)境中,進而直接或間接作用于自身或周圍其他生物。其中作物殘體是非常重要的釋放途徑之一。研究表明,一些作物殘體在降解過程中能產(chǎn)生和釋放一些化合物減少土壤中土傳病原菌的量,增加土壤中有益微生物的活性,從而達(dá)到控制土傳病害的效果。大蒜含有大量含硫化合物,具有廣譜的抑菌活性,但其主要的抑菌活性成分對辣椒疫霉菌是否具有抑菌活性還未知。因此,通過測定大蒜不同組織揮發(fā)物和浸提液對辣椒疫霉菌各生育階段的抑菌活性,分析不同組織浸提液中含有的抑菌活性成分,對利用大蒜和辣椒間作控制辣椒疫病的發(fā)生和蔓延具有一定的指導(dǎo)意義。1材料和方法1.1材料表面1.1.1大蒜品種白皮蒜鱗莖(Alliumsativum),品種為呈貢蒜。1.1.2病毒樣本本研究使用的辣椒疫霉菌菌株(PhytophthoracapsiciLeonian)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子病理與藥理研究室提供。1.1.3試驗中含有漢代化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)供試化合物標(biāo)準(zhǔn)品詳見表1。1.2方法1.2.1培養(yǎng)基的制備將辣椒疫霉菌由斜面接種至直徑9cm的PDA平板上,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3d后用0.5cm打孔器取得菌碟轉(zhuǎn)接在新的PDA上,繼續(xù)黑暗培養(yǎng)4d備用。1.2.2pda平板膜蓋將蒜瓣、葉和根浸入70%酒精中2min后無菌水沖洗3次,切成3~5cm大小。各稱取0.1,0.3,0.5,1,2,3,5g,置于倒置的PDA平板皿蓋上。沿生長4d的菌落邊緣打取直徑為0.5cm菌碟,將菌碟轉(zhuǎn)接于皿底培養(yǎng)基上,然后倒扣于添加不同量大蒜組織的皿蓋上,以不加任何物質(zhì)的PDA平板作為對照,每處理設(shè)置3次重復(fù),于25℃溫箱中黑暗培養(yǎng),4d以后用十字交叉法測量菌落直徑。1.2.3氣調(diào)和冷刺激試驗用打孔器沿生長4d的菌落邊緣打取直徑為0.5cm菌碟,轉(zhuǎn)接在PDA平板中,于28℃恒溫培養(yǎng)箱中12h光暗交替培養(yǎng)5d后,用無菌水將平板上的孢子囊洗脫,制成每毫升含有104個孢子囊的懸浮液。將已產(chǎn)孢的辣椒疫霉菌平板加適量蒸餾水,4℃冰箱放置20min進行冷刺激,然后28℃放置15min釋放游動孢子,制成每毫升含有106個游動孢子的懸浮液。將游動孢子懸浮液渦旋震蕩10min使其鞭毛脫落,制成休止孢懸浮液。1.2.4篩選母液的制備將新鮮大蒜蒜瓣、葉和根洗凈并表面消毒,分別稱取20g,用研缽研成勻漿,加入40mL無菌水浸提4h后過濾,12000r/min離心15min,上清液過0.22μm細(xì)菌濾膜,制成濃度為0.5g/mL的母液后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｄ敢河玫润w積二氯甲烷萃取3次,將二氯甲烷相旋蒸至干,加入1mL二氯甲烷定容,過0.45μm有機濾膜,待GC-MS檢測。1.2.5pda培養(yǎng)基濃度平板分別取大蒜浸提液母液0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2mL加入PDA培養(yǎng)基中,制成終濃度為0.67,1.67,3.3,6.7,16.7,33,67mg/mL的系列濃度平板。在平板中央接入0.5cm直徑的病原菌菌餅,以不加任何物質(zhì)的PDA平板作為對照,每處理3次重復(fù),25℃黑暗培養(yǎng)4d后用十字交叉法測量菌落直徑。1.2.6空囊率、休止孢萌發(fā)率測定用無菌水將浸提液母液梯度稀釋10,20,100,200,1000,5000倍,制成質(zhì)量濃度為50,25,5,2,0.5,0.025mg/mL的浸提液。取孢子囊懸浮液、游動孢子懸浮液、休止孢懸浮液各20μL分別與不同濃度的浸提液各20μL在凹玻片上混勻,20℃暗保濕培養(yǎng)。20min后觀察空孢子囊的數(shù)量,計算100個孢子囊的空囊率。5,20,40min后觀察休止孢的數(shù)量,以能抑制游動孢子游動的殺菌劑嘧菌酯作為對照,計算游動孢子休止率。3h后觀察休止孢萌發(fā)的數(shù)量,計算100個休止孢的萌發(fā)率。每處理4次重復(fù)。1.2.7gc/ms分析條件ThemoQuestTRACE2000氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,PLB-5色譜柱,規(guī)格30m×0.25mm×0.25μm。氣相色譜條件:初始柱溫70℃,保持1min,以10℃/min升溫至270℃,保持5min;進樣口溫度250℃,進樣體積1μL;載氣為氦氣,柱流速1mL/min。質(zhì)譜條件:離子源溫度250℃,EI電離能70eV,溶劑延遲3min;檢測器電壓500V,電流350μA;全掃描(59.60~480.40amu)。1.2.8帶藥平板的制備采用菌絲生長抑制法。用甲醇將各化合物標(biāo)準(zhǔn)品制成濃度為1×104和1×105mg/L母液,按照體積比1∶100的比例分別加入已冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基中,充分混勻后分別倒入滅菌的培養(yǎng)皿(直徑9cm),制成終濃度為100mg/L和1000mg/L的帶藥平板;以加入等體積甲醇的PDA平板為對照。沿生長4d的菌落邊緣打取直徑為0.5cm菌碟,將菌碟轉(zhuǎn)接在皿底培養(yǎng)基上,于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。每處理3次重復(fù),4d后利用十字交叉法測量菌絲直徑。1.2.9抑制率的計算利用十字交叉法測量出每種濃度下菌株的菌落生長直徑,求出各平均值帶入公式計算。抑制率=(對照菌落平均直徑-處理菌落平均直徑)/對照菌落平均直徑×100%。采用Excel2007和SPSS軟件進行方差分析或其他分析。2結(jié)果與分析2.1大蒜提取物和提取物對辣流菌的抗菌活性2.1.1大蒜葉和根浸提液試驗結(jié)果表明(表3),大蒜蒜瓣浸提液對辣椒疫霉菌菌絲生長具有很強的抑菌活性,濃度16.7mg/mL時的抑制率為67.09%;大蒜葉和根浸提液低濃度促進辣椒疫霉菌菌絲的生長,高濃度抑制其生長。葉浸提液質(zhì)量濃度為33mg/mL時抑制率才達(dá)到26.46%,而根浸提液濃度67mg/mL時抑制率才達(dá)到35.74%。2.1.3大蒜浸提液對辣椒疫霉菌生長和休止孢萌發(fā)的抑菌活性大蒜蒜瓣浸提液對辣椒疫霉菌游動孢子釋放具有很強的抑菌活性,葉浸提液活性次之,根浸提液抑菌活性較弱(表4)。浸提液質(zhì)量濃度50mg/mL時,蒜瓣、葉和根對辣椒疫霉菌游動孢子釋放的抑制率分別為99.14%,82.69%和40.21%。而大蒜浸提液對辣椒疫霉菌游動孢子游動的抑菌活性也表現(xiàn)出同樣的規(guī)律(表5),但其抑菌活性較對照殺菌劑嘧菌酯弱。蒜瓣浸提液質(zhì)量濃度5mg/mL時能在5min內(nèi)完全抑制游動孢子的游動,根和葉浸提液質(zhì)量濃度50mg/mL時也能在5min內(nèi)完全抑制其游動。大蒜浸提液對辣椒疫霉菌休止孢萌發(fā)的抑菌活性有一定的差異(表6),蒜瓣浸提液隨濃度增加抑菌活性增強,質(zhì)量濃度2mg/mL時即完全抑制休止孢的萌發(fā),而根浸提液則表現(xiàn)出低濃度促進萌發(fā),高濃度抑制萌發(fā)的作用。根和葉浸提液質(zhì)量濃度50mg/mL時的抑制率分別為23.33%和65.14%。2.2浸提液中含硫化合物試驗結(jié)果表明(圖1),蒜瓣、葉和根浸提液色譜峰峰型較一致,但各色譜峰豐度差異較大,根浸提液中各色譜峰峰面積明顯低于蒜瓣和葉浸提液。通過NIST譜庫檢測到的匹配率85%以上的化合物如表7所示。3種浸提液中均含有多種含硫化合物,包括二烯丙基一硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)和二烯丙基三硫化物(DATS),以及二甲基二硫醚、3-乙烯基-1,2-二硫雜-4-環(huán)己烯和3-乙烯基-1,2-二硫雜-5-環(huán)己烯等。二甲基三硫化物(DMTS)僅存在于葉浸提液中,而苯甲酸乙酯(ELB)僅存在于根浸提液中。葉浸提液中苯乙烯(STY)峰面積顯著大于蒜瓣浸提液,而二烯丙基三硫化物(DATS)峰面積顯著偏小。2.3化物及非含硫化合物苯甲酸乙酯抑菌效果結(jié)果表明(表8,圖2),大蒜中的含硫化合物二甲基三硫化物(DMTS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS),以及非含硫化合物苯甲酸乙酯(ELB)均具有較強的抑菌活性,1000mg/L時100%抑制辣椒疫霉菌菌絲的生長;100mg/L時抑制率分別為24.65%,0.85%,47.30%和-14.37%,其中二烯丙基三硫化物(DATS)抑菌活性最強,二烯丙基一硫化物(DAS)和苯乙烯(STY)則表現(xiàn)為促進菌絲生長的作用。3大蒜乙醇提取物生產(chǎn)實踐表明,利用蔥屬作物輪作或間作是減輕土傳病害的有效方法之一。研究也表明,大蔥提取物對植物土傳病害例如黃瓜、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)、番茄立枯病菌、番茄黃萎病菌和茄根腐疫病菌具有不同程度的抑菌活性。大蒜提取物對半知菌類真菌早疫病菌(Alternariasolani)、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、灰霉菌(Botrytiscinerea),子囊菌門真菌小核菌(Sclerotiumsp.)、白粉病菌(Erysiphepisi)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)孢子萌發(fā)或菌絲生長均具有抑制活性,對這些病原菌引起的病害也有較好的防治效果。賴榮泉等的研究結(jié)果表明,大蒜乙醇提取物對煙草青枯病有明顯的控制效果,且能抑制煙草花葉病毒的增殖。彭磊等(2011)的研究結(jié)果則表明,應(yīng)用大蒜原液防治芒果花期主要害蟲有較好效果。卵菌病害是非常重要的一類植物病害,尤其腐霉菌和疫霉菌引起的土傳病害發(fā)生危害更為嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明,大蒜不同部位產(chǎn)生和釋放的抑菌物質(zhì)有差異。蒜瓣的揮發(fā)物和浸提液的抑菌活性均高于葉和根的抑菌活性,可能與蒜瓣中抑菌活性最強的二烯丙基三硫化物(DATS)含量(峰面積大小)明顯高于葉和根有關(guān)。蒜瓣浸提液對辣椒疫霉菌各生育階段都有很強的抑菌活性,由此在辣椒疫病發(fā)生和蔓延過程中,通過抑制孢子囊釋放游動孢子,抑制游動孢子的游動活力,最終抑制休止孢的萌發(fā)來使辣椒疫霉菌在土壤中失去傳播和侵染能力。因此,利用大蒜和辣椒間作或輪作能有效降低辣椒疫病的發(fā)生。前人研究表明,蔥屬作物具有的廣譜抑菌殺菌能力主要源自其含有的活性含硫有機化合物,大蒜浸提液中含有大量的大蒜素及其降解的含硫化合物。當(dāng)大蒜受損細(xì)胞破裂時,蒜氨酸和蒜氨酸酶發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生丙酮酸、氨以及大蒜素等。大蒜素很不穩(wěn)定,繼續(xù)發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生阿霍烯、硫醚、二噻烯、皂苷等多種具活性含硫化合物,且在不同處理條件下,其分解代謝產(chǎn)物不同。這些硫化物通過對巰基的氧化,使與微生物生長繁殖有關(guān)的含硫巰基的酶失活,或?qū)蜓趸幕衔锶缂“彼?、谷氨酸產(chǎn)生競爭性抑制,或非競爭性的抑制某些酶的活性,從而對多種致病菌起到抑制或殺滅作用[27,28,29,30,31,32,33]。本研究利用GCMS檢測到大蒜不同組織浸提液中含有二烯丙基一硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)、二甲基三硫化物(DMTS)、3-乙烯基-1,2-二硫雜-4-環(huán)己烯、3-乙烯基-1,2-二硫雜-5-環(huán)己烯和二甲基二硫醚共7種含硫化合物,其中DAS、DADS、DATS和DMTS與BIANCHINI和VAINIO報道的大蒜中揮發(fā)性硫化物一致,3-乙烯基-1,2-二硫雜-4-環(huán)己烯與EJAZ等報道的大蒜鱗莖中的化合物一致,而另外兩種含硫化合物未見報道。且在這兩篇文獻中均報道了大蒜中的另外一種含硫化合物———大蒜素(Allicin),KHAN等利用HPLC檢測到大蒜根系分泌物中也含有大蒜素,本試驗利用GC-MS在大蒜組織浸提液中未檢出該化合物,但檢測出的主要含硫化合物都是該化合物的降解代謝產(chǎn)物。本試驗進一步測定了購買的化合物單體對辣椒疫霉菌的抑菌活性。DADS,DATS和DMTS3種化合物對辣椒疫霉菌菌絲生長均具有抑菌活性,其中DATS抑菌活性最強。4大蒜、辣椒間作或培養(yǎng)大蒜等三為酰氯丙基-四基三國內(nèi)立法對辣椒疫霉菌生長的影響大蒜不同組織揮發(fā)物和浸提液對辣椒疫霉菌均有顯著地抑制作用,其中蒜瓣抑菌活性最強,葉次之,根最弱;