1例腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良家庭成員ald基因突變的r-pcr鑒定

1例腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良家庭成員ald基因突變的r-pcr鑒定

腎上腺白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（ald）是一種遺傳因素。其發(fā)病機(jī)制是：人體極長(zhǎng)鏈脂肪酸（vlcfa）對(duì)亞硝酸鹽酶（vlcfa）的氧化影響，過(guò)度儲(chǔ)存，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)脫離髓鞘改變和腎上腺皮質(zhì)功能減退。該病屬X染色體連鎖隱性遺傳,男性患病率為1/25000～50000。根據(jù)起病時(shí)間和臨床表現(xiàn),可分成6種臨床類(lèi)型。血漿、紅細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞中VLCFA(主要是C26∶0和C24∶0兩者)異常升高是各臨床類(lèi)型的共同生化特征。引起ALD的致病基因被稱(chēng)為ALD基因,所編碼的蛋白質(zhì)稱(chēng)為ALD蛋白(ALDprotein,ALDP)。目前,國(guó)際上已在ALD患者中發(fā)現(xiàn)了300多種ALD基因突變。國(guó)內(nèi)有關(guān)ALD的報(bào)道涉及數(shù)10例患者,但作者尚未見(jiàn)有關(guān)中國(guó)ALD患者ALD基因突變研究的文獻(xiàn)報(bào)道。最近,我們分析了江西黎川地區(qū)的1例腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良患者及其家系成員的ALD基因,發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的ALD基因突變。材料和方法一、病理組織學(xué)檢測(cè)病例簡(jiǎn)介:患者男,15歲。以智力減退1年伴視物不清3月余為主訴入院。體檢:發(fā)育正常,心、肺、腹未見(jiàn)異常,神志清楚,對(duì)答切題,計(jì)算力、記憶力、反應(yīng)力下降,閉目行走困難,Romberg征輕度不穩(wěn),未引出病理征。腦電圖檢查示彌漫性高波幅慢波。顱腦MRI示:雙側(cè)側(cè)腦室三角區(qū)周?chē)绊?、枕區(qū)對(duì)稱(chēng)的大片狀、局限于腦白質(zhì)的蝶形脫髓鞘病變。在北京友誼醫(yī)院查血清極長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸濃度:C26∶0為0.72μg/ml[正常參考范圍:(0.509±0.169)μg/ml],C24∶0/C22∶0比值為2.2(正常參考范圍:0.893±0.125),C26∶0/C22∶0比值為0.09(正常參考范圍:0.025±0.0072)。臨床診斷:腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(青少年腦型)?；颊吒改附≡?有兩個(gè)姐姐、一個(gè)弟弟,均未查出有與患者類(lèi)似的臨床表現(xiàn)。二、方法1.引物和試劑RNA提取試劑盒(RNeasyMini試劑盒)和DNA提取試劑盒(QIAampDNABloodMini試劑盒)為Qiagen產(chǎn)品,cDNA合成試劑盒(ReverseTranscriptionSystem)為Promega產(chǎn)品,DNA片段凝膠回收試劑盒為Viogene產(chǎn)品,限制性?xún)?nèi)切酶Hin6I、Taq酶為MBI產(chǎn)品,引物委托上海Sangon生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,PE2400DNA擴(kuò)增儀、測(cè)序反應(yīng)試劑盒(Bigdye)、自動(dòng)DNA序列分析儀(ABI377)為Perkin-Elmer產(chǎn)品。2.pcr索引根據(jù)國(guó)外參考文獻(xiàn)合成4對(duì)引物,分片段(ALD1～4)擴(kuò)增整個(gè)ALD基因cDNA編碼區(qū),引物序列見(jiàn)表1。3.合成cdna外周血總RNA的提取按Qiagen產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,以RT-2引物(見(jiàn)表1)或Oligo(dT)15為引物合成cDNA,分別用于ALD1、ALD2和ALD3、ALD4片段的擴(kuò)增。4.ald1me總反應(yīng)體積25μl中含:cDNA模板1μl,引物各15pmol、4種dNTP各0.2mmol/L、Taq酶2U、MgCl21.5mmol/L。ALD1按下列條件擴(kuò)增:94℃預(yù)變性4min后,94℃,60s;56℃,60s;72℃,60s;共30個(gè)循環(huán)。最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)在72℃延伸9min。ALD2、ALD3、ALD4退火溫度分別為58℃、55℃、55℃,其他擴(kuò)增條件同ALD1。擴(kuò)增產(chǎn)物按常規(guī)在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,在紫外線下用手術(shù)刀片切下含預(yù)期區(qū)帶的凝膠塊,用DNA凝膠回收試劑盒從中回收。5.直接恢復(fù)段的序列回收的ALD1～4各片段以相應(yīng)引物,委托上海生工生物技術(shù)有限公司采用末端終止法進(jìn)行序列測(cè)定。6.擴(kuò)增片段聚合酶5-gcctctacagac基因組DNA按試劑盒說(shuō)明自外周血提取。根據(jù)Sarde等報(bào)道的ALD基因組序列,用OMIGA2.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)外顯子1部分序列的引物對(duì),901F∶5′-GCCTCTACTTCTCCCAGCAGAC-C-3′;1E85R∶5′-ACTGTCCCCACCGCTCACG-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)470bp。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性4min后,94℃,45s;60℃,30s;72℃,45s;共30個(gè)循環(huán)。在最后1個(gè)循環(huán)中,72℃延伸時(shí)間為10min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Hin6I消化后,上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后溴乙啶染色15min,紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。結(jié)果一、ald基因的pcr檢測(cè):cALD基因cDNA的開(kāi)放讀框長(zhǎng)2235bp,本研究將其分成4個(gè)相互重疊的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,各片段的預(yù)期大小為(按ALD1至ALD4順序):722、700、723、646bp。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析證實(shí)各擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符(結(jié)果未顯示)。將各PCR產(chǎn)物純化后,直接進(jìn)行序列測(cè)定。從圖1可以看出,與同時(shí)進(jìn)行分析的1名正常對(duì)照相比,患者ALD基因第280密碼子(位于外顯子1)發(fā)生CGC→CTC改變(反義鏈為GCG→GAG),使原來(lái)的精氨酸被亮氨酸替換(見(jiàn)圖1)。正常對(duì)照的ALD基因序列與文獻(xiàn)報(bào)道和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列一致。二、內(nèi)鏡cctc基因突變用引物901F和1E85R擴(kuò)增ALD基因的基因組DNA部分序列,片段長(zhǎng)度為470bp,覆蓋第280位密碼子。該片段內(nèi)含2個(gè)Hin6I酶切位點(diǎn)(G↓CGC),患者第280位密碼子發(fā)生CGC→CTC突變后將導(dǎo)致其中1個(gè)酶切位點(diǎn)消失,酶切片段長(zhǎng)度發(fā)生改變:患者應(yīng)為303bp、167bp,正常人應(yīng)為303bp、147bp、20bp,雜合子應(yīng)為303bp、167bp、147bp、20bp。圖2為酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果,可以看出:正常對(duì)照、患者大姐、患者弟弟均有303bp、147bp片段(20bp片段不易見(jiàn)到),為正常基因型;患者有303bp、167bp片段,X染色體上存在錯(cuò)義突變,患者母親和二姐有303bp、167bp、147bp片段,為雜合子(攜帶者)。三、患者住院檔案見(jiàn)圖3。ald基因s180l突變ALD基因定位于Xp28,全長(zhǎng)約21kb,含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子,其mRNA長(zhǎng)3.7kb,所編碼的ALD蛋白含745個(gè)氨基酸殘基。ALD蛋白位于過(guò)氧化物酶體膜上,分成一個(gè)跨膜區(qū)(含6個(gè)跨膜片段)和1個(gè)ATP結(jié)合區(qū),屬于ATP結(jié)合盒(ATP-bindingcassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員。國(guó)外對(duì)該病的基因診斷始于1994年,至今已發(fā)現(xiàn)300余種ALD基因突變,其中54%為錯(cuò)義突變,26%為移碼突變,10%為氨基酸插入或缺失,約10%為無(wú)義突變,突變遍及10個(gè)外顯子。位于外顯子5的1801delAG突變是一個(gè)熱點(diǎn),發(fā)生率約為12%。ALD基因突變可導(dǎo)致ALD蛋白穩(wěn)定性下降、功能缺陷或肽鏈大段缺損,最終影響VLCFA在過(guò)氧化物酶體內(nèi)的β氧化?；蛲蛔冾?lèi)型與各類(lèi)臨床表現(xiàn)之間相關(guān)性不明顯,提示可能尚有其他未知的遺傳或環(huán)境因素影響該病的臨床表現(xiàn)。本研究是國(guó)內(nèi)首次對(duì)中國(guó)腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良家系進(jìn)行的基因診斷。我們采用RT-PCR技術(shù),分4個(gè)片段擴(kuò)增患者ALD基因cDNA全部編碼序列。對(duì)PCR產(chǎn)物的直接序列測(cè)定表明患者ALD基因序列僅在第280位密碼子處與正常人不同:患者的第280位密碼子為CTC,編碼亮氨酸;而正常人的為CGC,編碼精氨酸。依據(jù)突變位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的對(duì)基因組DNA片段的Hin6I酶切分析,進(jìn)一步確證患者ALD基因存在R280L錯(cuò)義突變。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及有關(guān)電子數(shù)據(jù)庫(kù),可見(jiàn)美國(guó)Steinberg等曾在同一密碼子處發(fā)現(xiàn)R280C突變(因特網(wǎng)資料,未見(jiàn)正式發(fā)表),未見(jiàn)有關(guān)于ALD基因R280L突變報(bào)道。發(fā)生突變的氨基酸殘基位于ALDP的跨膜區(qū),在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中屬于保守氨基酸。該突變?nèi)绾斡绊慉