麻痹性貝毒的研究進(jìn)展

麻痹性貝毒的研究進(jìn)展

1貝類水產(chǎn)品限制率的確定近年來(lái)，隨著有害高峰的增加，監(jiān)測(cè)和分析航道和藻類毒素變得越來(lái)越重要。許多國(guó)家和相關(guān)國(guó)際組織制定了相應(yīng)的貝類產(chǎn)品分銷模式和測(cè)試方法。麻痹性貝類毒素(Paralyticshellfishpoison,PSP)是最常見(jiàn)、毒性最強(qiáng)的赤潮毒素,本文重點(diǎn)介紹PSP毒性機(jī)理、檢測(cè)方法及最近進(jìn)展。2甲?；惗舅丶皀-羥基類毒素麻痹性貝類毒素(PSP)是最常見(jiàn)、毒性最強(qiáng)的赤潮毒素。目前已分離出20多種該類毒素,可依據(jù)基因相似性將其分為氨基甲酸酯類毒素、脫氨甲?；惗舅?、N-磺酰氨甲酰基類毒素及N-羥基類毒素共4類,其中氨基甲酸酯類毒素中的石房蛤毒素(STX)占PSP的85%以上,固STX為PSP的主要研究對(duì)象。PSP是一種極易溶于水的白色吸水固體,不溶于石油醚、乙醛等大多數(shù)非極性溶劑,部分溶于甲醇和酒精。PSP在紫外線范圍內(nèi)不被吸收,是一種生物堿,易從酸性溶液中萃取。PSP通過(guò)選擇性阻斷Na+內(nèi)流,阻礙動(dòng)作電位的形成而起抑制作用。PSP毒素及各衍生物對(duì)膜的作用機(jī)理相似,均以劑量-依賴型方式阻斷鈉離子內(nèi)流,而對(duì)靜息膜電位或鉀通道無(wú)作用。3檢測(cè)psp的主要方法檢測(cè)PSP的方法按其性質(zhì)可分為生物、理化、免疫化學(xué)三大類。3.1小鼠生物測(cè)定法生物測(cè)定法都是將毒素注射到生物體內(nèi),通過(guò)生物體反應(yīng)的時(shí)間情況來(lái)測(cè)定毒素大小的一種方法,主要包括小鼠生物測(cè)定法、家蠅生物測(cè)定法、蝗蟲生物分析法、神經(jīng)細(xì)胞生物分析法等,其中小鼠生物測(cè)定法是PSP唯一國(guó)際大多數(shù)國(guó)家普遍接受的統(tǒng)一方法,也是生物測(cè)定法研究的重點(diǎn)。小鼠生物測(cè)定法被美國(guó)公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)推廣為PSP的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法,是一種PSP的半定性分析方法。是定義一個(gè)鼠單位(MU相當(dāng)于0118μg)作為給予20g小白鼠注射1ml貝類提取物使其在15min內(nèi)致死的最小劑量。其優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)容易掌握,不需要使用專門儀器;缺點(diǎn)是專一性差,靈敏度不高,操作繁瑣。3.2洗脫體系及流程理化分析法是將毒素分子通過(guò)堿性氧化成為熒光衍生物或有色生物后通過(guò)紫外或熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)。高效液相色譜法(HPLC)是最常用的理化分析法。HPLC法檢測(cè)不同PSP時(shí)采用不同的洗脫體系及洗脫方法,且衍生過(guò)程也不同。同小鼠生物檢測(cè)法相比HPLC具有檢測(cè)速度快、檢出限低、靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)。但是需要根據(jù)小鼠生物測(cè)定法進(jìn)行標(biāo)定且缺乏PSP分析的標(biāo)準(zhǔn)品是HPLC法的主要缺點(diǎn)。另外,影響HPLC法普遍推廣的另一個(gè)原因是PSP類似物的毒性種類都是唯一的且類似物間易相互轉(zhuǎn)化,判斷樣品中的原始或潛在總毒性較困難。3.3免疫化學(xué)檢測(cè)20世紀(jì)60年代起科研人員開(kāi)始研究應(yīng)用免疫檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)PSP;80年代末建立的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和放射性免疫因交叉反應(yīng)低,不能檢測(cè)所有的毒素而未能得到推廣。90年代初成功的建立了酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。免疫化學(xué)技術(shù)應(yīng)用于PSP檢測(cè)主要以單克隆抗體(MAb)為基礎(chǔ)。國(guó)外學(xué)者嘗試制備PSPMAb抗體及定量測(cè)定PSP,取得令人滿意的結(jié)果。PSP為小分子物質(zhì),不具有免疫原性,需要將其連接到大分子載體上,使其成為完全抗原,再用來(lái)免疫動(dòng)物。一般采用小劑量長(zhǎng)周期免疫方案制備單克隆抗體。免疫化學(xué)檢測(cè)法檢出限低且干擾少,對(duì)樣品前處理要求較低、簡(jiǎn)便、快速、特異、經(jīng)濟(jì),因此具有極高的推廣價(jià)值。但免疫技術(shù)檢測(cè)貝毒存在產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)、系列標(biāo)準(zhǔn)毒素的缺乏等問(wèn)題,這些問(wèn)題限制著該技術(shù)的深入應(yīng)用。而且抗體往往只是針對(duì)某一種毒素所建立,對(duì)于其他貝毒常常表現(xiàn)出較低的交叉反應(yīng),不能檢測(cè)所有的貝毒等。3.4檢測(cè)方法是最新3.4.1傳感器的選擇最近發(fā)展起來(lái)的鈉通道阻斷效應(yīng)組織生物傳感器對(duì)PSP有極端的響應(yīng)靈敏度和響應(yīng)速度,這種傳感器是將一個(gè)鈉電極整合到—個(gè)含8%NaCl溶液的腔內(nèi),電極頭上覆蓋有三層膜,即兩層醋酸纖維素膜之間夾一層蛙的膀脹膜。傳感器一次檢測(cè)只需5min左右,可檢測(cè)低于86fg/ml的PSP。而且,在有0.003%NaN3的情況下,這種傳感器可持續(xù)使用約250個(gè)小時(shí)。日本和韓國(guó)均有關(guān)于采用組織傳感器法測(cè)定PSP的報(bào)道組織傳感器方法也有其弊端,比如敏感膜篩選困難,壽命低等。3.4.2麻醉性貝毒電壓敏感熒光染料檢測(cè)利用電壓敏感熒光染料測(cè)定貝體中的麻痹性貝毒是一種非常有潛力的貝毒快速篩查方法。這種方法以膀胱癌移行細(xì)胞T24為實(shí)驗(yàn)材料,采用電壓敏感熒光染料bis-oxonol,根據(jù)PSP毒素GTX2,3對(duì)藜蘆定誘導(dǎo)細(xì)胞去極化的抑制作用,建立了一種麻痹性貝毒電壓敏感熒光染料檢測(cè)法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在2～100ng·mL-1范圍內(nèi),PSP毒素GTX2,3可顯著改變培養(yǎng)體系的熒光強(qiáng)度,GTX濃度與熒光強(qiáng)度之間存在很好的線性關(guān)系。市售貝類PSP毒素檢測(cè)結(jié)果表明,此方法測(cè)定結(jié)果與小鼠法基本一致,但靈敏度更高,說(shuō)明根據(jù)GTX濃度與熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中PSP毒素的快速檢測(cè)。4半定量綜合毒性檢測(cè)由于貝類毒素的復(fù)雜性,使得以往常用的傳統(tǒng)檢測(cè)法難以解決貝毒檢測(cè)中出現(xiàn)的新問(wèn)題。生物傳感器是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的,該方法與僅能給出半定量綜合毒性但耗時(shí)長(zhǎng)的小鼠法和只能給出定量結(jié)果但不能給出綜合毒性理化檢測(cè)方法比較有不可替代的優(yōu)勢(shì),由于其具有