第6章-骨組織工程

生長因子的定義

生長因子(growthfactor，GF)是通過細胞間信號傳遞影響細胞活動的一類多肽因子。它對細胞具有促進或抑制其分裂增殖、遷移和基因表達的作用。將生長因子加入到細胞培養(yǎng)體系中，保證生長因子在體外環(huán)境下能夠有效發(fā)揮作用非常重要。這需要解決兩個難題，其一，促進生長因子維持活性；其二，保證生長因子的有效作用濃度。1生長因子的分類

根據(jù)生長因子產(chǎn)生細胞與接受生長因子作用的細胞相互之間的關(guān)系，可概括為以下三種模式：（1）內(nèi)分泌（endocrine），生長因子從細胞分泌出來后，通過血液運輸作用于遠隔靶細胞。如：血小板源生長因子（PDGF）源于血小板，作用于結(jié)締組織細胞。（2）旁分泌（paracrine），細胞分泌的生長因子作用于鄰近的其他類型細胞，對合成、分泌該生長因子的自身細胞不發(fā)生作用，因為它缺乏相應(yīng)受體。（3）自分泌（autocrine），生長因子作用于合成及分泌該生長因子的細胞本身。生長因子以后兩種作用方式為主。2根據(jù)作用分類分化調(diào)控因子增殖調(diào)控因子分化誘導因子：誘導低分化細胞（如干細胞）分化成熟，成為特化功能細胞分化阻抑及去分化因子：阻礙細胞分化和使細胞去分化，變成低分化細胞。增殖促進因子：促進細胞的分裂增殖，使細胞的增殖加快。增殖抑制因子：使細胞的分裂減慢，抑制細胞生長。生長因子的分類3根據(jù)產(chǎn)生生物學效應(yīng)的范圍大小分類廣譜生長因子：許多生長因子對多種細胞均有作用。如TGF-β對骨、上皮、肌肉等細胞均有作用。窄譜生長因子：少數(shù)生長因子只對某一特定類型的細胞產(chǎn)生作用。如BMP只對骨細胞起作用。生長因子的分類4二、生長因子的分類血小板源生長因子表皮生長因子轉(zhuǎn)化生長因子骨形成蛋白堿性成纖維細胞生長因子胰島素樣生長因子結(jié)締組織生長因子神經(jīng)膠質(zhì)生長因子血管內(nèi)皮生長因子根據(jù)能產(chǎn)生效應(yīng)的細胞分類5生長因子的作用方式生長因子的直接作用生長因子的間接作用生長因子的協(xié)同作用與拮抗作用生長因子與細胞周期6研究生長因子調(diào)控的方法動物體內(nèi)實驗、體外培養(yǎng)實驗體內(nèi)實驗觀察生長因子作用的指標：缺損愈合時間新生組織的干、濕重及比值組織總蛋白與DNA及RNA含量測定羥脯氨酸含量測定顯微鏡觀察7體外培養(yǎng)實驗觀察生長因子作用的指標：體內(nèi)實驗是多種組織細胞綜合作用的過程。相比之下，體外培養(yǎng)的細胞是單一種類細胞。研究單一生長因子或多種生長因子聯(lián)合對培養(yǎng)細胞的作用，能夠比較客觀地反映這些生長因子對該細胞的直接作用，觀察指標如下。生長曲線量效曲線細胞周期測定細胞產(chǎn)物測定細胞受體密度及其mRNA測定8幾種組織工程常用的生長因子表皮生長因子骨形成蛋白神經(jīng)生長因子轉(zhuǎn)移生長因子成纖維生長因子912/11/2023五、生長因子的控制釋放技術(shù)（一）生長因子控制釋放的必要性生長因子的存在可促進細胞在支架上的黏附、增殖和生長，為組織工程化組織或器官構(gòu)建提供一個良好的微環(huán)境，從而有利于創(chuàng)傷的修復和組織的再生。在組織工程中的應(yīng)用主要有兩種方式：

將生長因子直接復合到支架材料上或支架構(gòu)建完成后再進行復合；將細胞移植到支架材料上，由細胞來分泌生長因子。這些細胞可以是自然狀態(tài)下分泌生長因子的細胞，也可以是經(jīng)過基因改造的細胞。10五、生長因子的控制釋放技術(shù)①釋放編碼生長因子的DNA轉(zhuǎn)染宿主細胞；②基因轉(zhuǎn)染離體細胞并使之在宿主體內(nèi)表達相關(guān)因子③在修復部位直接添加生長因子；④應(yīng)用控釋技術(shù)使載體包含的生長因子在體內(nèi)緩慢釋放，在一段時間內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用。前兩項技術(shù)目前尚處在實驗室探索階段，而將各種生長因子施加于治療區(qū)域已獲得穩(wěn)定可靠的效果。1112/11/2023五、生長因子的控制釋放技術(shù)（一）生長因子控制釋放的必要性生長因子優(yōu)點諸多，但是也存在很多問題，主要是高擴散性和半衰期短，生物學活性難以長期保存。局部直接應(yīng)用生長因子可在較短的時間內(nèi)發(fā)揮作用，但在生理環(huán)境下很容易使之迅速失活，不產(chǎn)生預期的生理效應(yīng)。因此，如何采用藥物控制釋放技術(shù)，對生長因子進行保護，使之在有水環(huán)境下即能保持活性，又能持續(xù)釋放或控制釋放，是使生長因子得到有效應(yīng)用的關(guān)鍵。1212/11/2023五、生長因子的控制釋放技術(shù)（二）控制釋放技術(shù)的應(yīng)用

藥物的控制釋放零級釋藥緩釋使藥物在需要時間和時間間隔內(nèi)對需要劑量釋放至所需部位，防止藥物失活。13五、生長因子的控制釋放技術(shù)生長因子的控釋體系最常見的生長因子的控制釋放體系，有骨架型（基體型）和貯庫型（貯存型）兩種。

骨架型：生長因子以分子或微晶、微粒的形式均勻分散在各種載體材料中。藥物的釋放速率和釋放分布可通過基材的形狀、藥物在基材中的分布以及高分子材料的化學、物理和生物學特性控制貯庫型：生長因子被包裹在高分子聚合物膜內(nèi)。藥物微粒的大小可根據(jù)使用的目的調(diào)整，粒徑可從微米到納米。14五、生長因子的控制釋放技術(shù)生長因子的控釋模式和負載劑量模式：彌散型、酶反應(yīng)控制型、溶劑控制型

彌散型：根據(jù)蛋白的溶解性高低，在載體和水中的部分比例和因子的負載量決定釋放速度。

酶反應(yīng)控制型：將生長因子包裹在可酶解的載體包殼內(nèi)，載體材料降解的快慢決定了生長因子的釋放速度。

溶劑控制型：將生長因子融入可溶性材料基質(zhì)中，當水溶液浸入材料內(nèi)部，因子就隨之釋放。15五、生長因子的控制釋放技術(shù)生長因子的控釋模式和負載劑量模式：彌散型、酶反應(yīng)控制型、溶劑控制型

彌散型：根據(jù)蛋白的溶解性高低，在載體和水中的部分比例和因子的負載量決定釋放速度。例如調(diào)節(jié)珊瑚人工骨粒徑和蛋白吸附條件(pH3、7．4和11，添加0．1BSA或明膠)，可改變TGF-β1的釋放速度。16五、生長因子的控制釋放技術(shù)生長因子的控釋模式和負載劑量模式：彌散型、酶反應(yīng)控制型、溶劑控制型

酶反應(yīng)控制型：將生長因子包裹在可酶解的載體包殼內(nèi)，載體材料降解的快慢決定了生長因子的釋放速度。例如在小鼠皮下觀察膠原包裹TGF-β1的控釋效果，發(fā)現(xiàn)釋放速度由膠原載體的交聯(lián)度(即酶解速度)決定。

17五、生長因子的控制釋放技術(shù)生長因子的控釋模式和負載劑量模式：彌散型、酶反應(yīng)控制型、溶劑控制型溶劑控制型：將生長因子融入可溶性材料基質(zhì)中，當水溶液浸入材料內(nèi)部，因子就隨之釋放。生長因子的釋放方式，明顯影響著其作用效力。在綿羊骨鉆孔模型中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PLGA和PLA裝載的IGF-I在直線、脈沖和緩慢控釋下可產(chǎn)生截然不同的成骨結(jié)果。18五、生長因子的控制釋放技術(shù)生長因子的控釋模式和負載劑量負載劑量：自然狀態(tài)下，體內(nèi)僅需少量生長因子就可完成某些成骨過程，但在控釋體系中卻需要超劑量的投放才能滿足需求。19五、生長因子的控制釋放技術(shù)生長因子的控釋模式和負載劑量成骨因子的控釋效果存在著劑量依賴性。將PIGA微球包裹的不同劑量IGF-I植入綿羊骨干骺端鉆孔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)30ug與80ug時形成的新骨量具有明顯差異，但將劑量提高到100ug后成骨效果不再繼續(xù)增加，并保持在與80ug效應(yīng)相當?shù)乃?。實驗研究還證實，過量輸入BMP-2、IGF-I等會抑制新骨生長，甚至可能導致異位骨化和骨囊腫等腫瘤樣病變。此外有研究觀察發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用控釋載體完成相同的成骨過程，嚙齒類動物所需rhBMP-2的基本濃度為25ug／ml，犬類為50ug／ml,而靈長類動物和人類則分別為80ug／ml和100ug／ml。然而在自然狀態(tài)下，僅2ng／g的BMP-2生理濃度即足以確保骨修復的完成。2012/11/2023五、生長因子的控制釋放技術(shù)（三）生長因子控制釋放載體材料

天然的可降解材料

明膠、纖維素、蛋白質(zhì)、羥基磷灰石、珊瑚…….

人工的可降解材料

聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚幾內(nèi)酯……2112/11/2023五、生長因子的控制釋放技術(shù)（四）生長因子控制釋放體系

高分子微包囊水凝膠脂質(zhì)體納米控釋載體其他控釋體系22五、生長因子的控制釋放技術(shù)（四）生長因子控制釋放體系

高分子微包囊:通過成膜物質(zhì)將囊內(nèi)空間和囊外空間隔離開以形成特定的幾何結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。

23微膠囊的不同結(jié)構(gòu)圖24

空氣懸浮法、噴霧干燥法、噴霧凝凍法、物理法真空蒸發(fā)沉積法、靜電結(jié)合法、包結(jié)絡(luò)合法、多孔離心法、界面聚合法、原位聚合法化學法分子包囊法、輻射包囊法水相分離法、油相分離法、孔膜擠壓法、物化法熔化分散法、粉末床法、囊心交換法、銳孔-凝固浴法、復相乳液法(干燥浴法)微膠囊化的方法25凝聚法：芯材分散——壁材包覆囊材（明膠）和囊心物質(zhì)（生長因子）→混懸液或乳濁液（油/水）→加入壁材（阿拉伯膠）→凝聚→沉降→固化→微膠囊產(chǎn)品2612/11/2023五、生長因子的控制釋放技術(shù)（四）生長因子控制釋放體系水凝膠，常用的生長因子基體型釋放體系。常見的水凝膠有聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇、聚環(huán)氧乙烷或聚乙二醇等合成材料及一些天然水凝膠2712/11/2023五、生長因子的控制釋放技術(shù)（四）生長因子控制釋放體系脂質(zhì)體：是磷脂分散在水中形成的球狀的、包封一部分內(nèi)水相的封閉囊泡。一般粒徑為0.05-0.5um?？尚纬芍|(zhì)體膜材料的類脂類物質(zhì)有卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、膽固醇、豆磷脂等。

28在脂質(zhì)體表面，脂質(zhì)分子的親水基富集。利用脂質(zhì)雙分子膜的外層和內(nèi)層性質(zhì)不同，可用來控釋各種生理活性物質(zhì)固脂質(zhì)體可生物降解，易于制備，而且能負載許多脂質(zhì)和水溶性藥物，固脂質(zhì)體是有效的藥物載體2912/11/2023五、生長因子的控制釋放技術(shù)（四）生長因子控制釋放體系納米控釋載體

靶向納米微球3012/11/2023五、生長因子的控制釋放技術(shù)（四）生長因子控制釋放體系其他控釋體系膠束電紡絲超纖維體系基因載體控釋系統(tǒng)將生長因子的基因借助病毒或非病毒載體轉(zhuǎn)入細胞，能使細胞持續(xù)分泌生長因子，從而促進細胞增殖、分化和遷移等，稱為基因載體控釋系統(tǒng)。31五、生長因子的控制釋放技術(shù)（五）存在問題“突釋效應(yīng)”造成早期大量給藥生長因子的活性不能持久地保持多因子控釋和靶向控釋策略有待進一步優(yōu)化控釋結(jié)果的評價缺乏客觀標準32六創(chuàng)傷修復中多種因子的貫序作用創(chuàng)傷→啟動凝血→活化血小板→釋放血小板生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)移生長因子(TGF)→趨向作用，吸引大量細胞，如巨嗜細胞、成纖維細胞、表皮細胞、血管內(nèi)皮細胞等→每種細胞都分泌相應(yīng)自己的生長因子(TGF-β、

TGF-α、PEGF、TNF)→生長因子大量釋放，迅速擴散，蛋白酶降解→其他細胞趨化作用→在創(chuàng)傷面上分泌許多生長因子與細胞外基質(zhì)，細胞外基質(zhì)對生長因子即起儲存作用又起促進作用→新的生長因子促進細胞局部增生→產(chǎn)生成纖維細胞、表皮細胞、血管內(nèi)皮細胞→形成纖維結(jié)締組織、瘢痕→膠原酶降解過量膠原消除瘢痕→修復完成33六創(chuàng)傷修復中多種因子的貫序作用骨受損→啟動凝血→活化血小板→釋放血小板生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)移生長因子(TGF)→激活成骨細胞骨受損組織→釋放BMP→誘導骨原細胞→分化為成骨細胞骨組織本身受到破壞→釋放生長因子→激活成骨細胞成骨細胞趨化遷移至骨吸收部位自分泌、旁分泌2天后表達BMP7-12天(1-2周)后表達PDGF、TGF、FGF反饋成骨細胞促進分裂、增殖，合成骨基質(zhì)34

第七章骨組織工程35主要內(nèi)容人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能骨的生長與發(fā)育骨組織工程的細胞骨形成的生長因子成骨細胞的細胞社會學特性組織工程化人工骨的臨床應(yīng)用36人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能37人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能骨的正常結(jié)構(gòu)與其他結(jié)締組織基本相似，也由細胞、纖維和基質(zhì)三部分組成。按其發(fā)生和組織成分來看，屬于結(jié)締組織。骨組織最大特點是細胞間質(zhì)具有大量的鈣鹽沉積，成為人體中最硬的組織之一，從而發(fā)揮其支架作用。3839人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能骨的成分（1）有機物：主要是骨膠蛋白，使骨具有一定的韌性。（2）無機鹽：主要是骨鹽（主要是堿性磷酸鈣），使得骨堅硬不屈、傲然挺立，是影響骨的硬度的因素。40骨膠纖維：占有機質(zhì)90%,由Ⅰ型膠原蛋白組成基質(zhì)鈣結(jié)合蛋白—參與骨的鈣化并調(diào)節(jié)骨的吸收骨粘連蛋白骨橋蛋白與細胞和骨基質(zhì)的粘合有關(guān)，也調(diào)節(jié)骨的鈣化有機質(zhì)（類骨質(zhì)）無機質(zhì)：(骨鹽)主要為羥基磷灰石結(jié)晶，細針狀結(jié)晶41人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能將骨浸泡于稀鹽酸中,經(jīng)一段時間后,骨變得柔軟。這是因為骨成分中的無機物溶解于鹽酸中,剩下的是骨膠原；將一段骨放到酒精燈上煅燒至灰白色,輕敲這段骨便粉碎.這是因為骨中的有機物燃燒掉后,剩下的是脆而硬的無機物。42人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能有機和無機兩種成分有著恒定的比例，一般而言，前者占成人骨干重的34％，后者占65％。使骨有一定的硬度和彈性。43人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能人的一生不同時期骨中不同成分的含量及其物理特性人的一生中骨的成分是不斷變化，兒童少年之所以能夠長高，與骨的生長有密切關(guān)系；老年人之所以容易發(fā)生骨折，與骨的成分有關(guān)系。44人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能骨的結(jié)構(gòu)1．骨膜：營養(yǎng)、新生、感覺（成骨細胞：能使骨增生和骨折后再生）2．骨質(zhì)分骨松質(zhì)和骨密質(zhì)3．骨髓（1）紅骨髓：具有造血功能。（2）黃骨髓：失去造血功能。45骨（模式圖）骨組織骨髓骨外膜—骨膜

—骨髓腔骨內(nèi)膜——46纖維層：最外面，薄而致密，排列不規(guī)則的致密結(jié)締組織，其中含有一些成纖維細胞。結(jié)締組織中含有較粗大的膠原纖維束，彼此交織成網(wǎng)狀，有血管和神經(jīng)從中穿行。由致密結(jié)締組織組成骨外膜骨內(nèi)膜：一薄層含細胞的結(jié)締組織，除襯附在骨髓腔面以外，也襯附在哈弗管內(nèi)及包在松質(zhì)骨的骨小梁表面，骨內(nèi)膜中的細胞也具有成骨和造血功能。新生層（成骨層）：內(nèi)：由多功能的扁平梭形細胞組成，含較多的彈力纖維，形成一薄層彈力纖維網(wǎng)骨膜

人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能47骨原細胞——骨外膜——骨祖細胞————骨組織——————骨髓腔48骨質(zhì)密質(zhì)骨松質(zhì)骨：又稱皮質(zhì)骨，為內(nèi)含許多相互連通的小管道及血管神經(jīng)的規(guī)律排列的骨板。見于長骨的骨干和扁平骨的表層。：由大量針狀或片狀的骨小梁相互連接而成的多孔網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔中充滿骨髓。人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能骨質(zhì)49—骨外膜

——外環(huán)骨板—血管內(nèi)環(huán)骨板———骨內(nèi)膜——哈弗骨板—中央管—

中央管———————————穿通管————間骨板骨干（模式圖）—神經(jīng)骨單位50骨密質(zhì)環(huán)骨板

內(nèi)環(huán)骨板(external

circumferentiallamella)外環(huán)骨板

(internal

circumferentiallamella)骨單位：

10—20層骨板呈同心圓排列，中軸有一中央管。

間骨板(circumferentiallamella)

人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能51外環(huán)骨板內(nèi)環(huán)骨板52①內(nèi)環(huán)骨板②骨單位53外環(huán)骨板層表面的骨板環(huán)繞骨干排列，稱為外環(huán)骨板層，由數(shù)層骨板構(gòu)成，其外與骨外膜緊密相連。其中有與骨干相垂直的孔道，橫向穿行于骨干，稱為伏克曼管，通過伏克曼管，營養(yǎng)血管進入骨內(nèi)，和縱向走行的哈弗管內(nèi)的血管相通。5455①骨陷窩②哈弗斯管③福克曼氏管④間骨板⑤粘合線56①骨陷窩②哈弗斯管③骨小管④粘合線57骨由外向內(nèi)：骨膜---外環(huán)骨板層---哈佛系統(tǒng)---內(nèi)環(huán)骨板層---骨松質(zhì)---骨髓人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能58骨組織細胞骨細胞成骨細胞骨原細胞破骨細胞

人體骨骼的基本組成結(jié)構(gòu)及功能59骨組織的細胞骨原細胞：是骨組織中的干細胞，位于骨組織和表面。細胞膠小，呈不規(guī)則的梭形，胞質(zhì)少，呈嗜堿性，細胞器少。能分化為成骨細胞。成骨細胞：位于成骨活躍的骨組織表面，常成行排列于骨片表面，細胞呈矮柱狀或呈扁平狀，細胞核橢圓形，細胞質(zhì)嗜堿性。可轉(zhuǎn)化為骨細胞。60成骨細胞———成骨細胞—————骨組織61骨組織的細胞骨細胞：單個分散于骨板之間或骨板之內(nèi)。細胞較小，呈扁卵圓形，有許多細長突起，胞質(zhì)弱嗜酸性堿性，細胞器相對地少。骨細胞體在骨基質(zhì)所占據(jù)的空間稱骨陷窩；骨細胞的突起以縫隙連接相連，骨管彼此連通，骨陷窩和骨小管內(nèi)含組織液，可營養(yǎng)骨細胞和輸送代謝產(chǎn)物。分泌骨膠纖維和基質(zhì)。對基質(zhì)的更新和維持維持血鈣的恒定有重要作用。62————骨細胞————————骨陷窩骨細胞和骨陷窩6364骨細胞電鏡結(jié)構(gòu)模式圖65基質(zhì)小泡膜上有堿性磷酸酶、焦磷酸酶、ATP酶、酸性磷脂泡內(nèi)含鈣、小骨鹽結(jié)晶、鈣結(jié)合蛋白類骨質(zhì)基質(zhì)小泡鈣化成骨細胞類骨質(zhì)包埋后骨細胞66

破骨細胞：位于新生骨片的邊緣，細胞很大，直徑100um，呈不規(guī)則形，有多個細胞核，細胞質(zhì)強嗜酸性。貼近骨基質(zhì)一側(cè)有許多不規(guī)則的微絨毛稱皺褶，在皺褶周邊有一環(huán)形胞質(zhì)區(qū)稱亮區(qū)，內(nèi)含許多微絲。在皺褶緣基部有溶酶體、吞飲泡。功能：有溶解和吸收骨基質(zhì)的作用；分泌有機酸產(chǎn)生氧自由基增強溶液骨作用。骨組織的細胞67破骨細胞——骨組織

———破骨細胞

————細胞核

————皺褶緣68破骨細胞的皺褶緣69骨的生長與發(fā)育70骨組織的形成骨組織的分解和吸收骨的發(fā)生膜內(nèi)成骨軟骨內(nèi)成骨骨的生長和改建骨的修復骨移植中移植骨的歸宿和新骨的生成移植骨的轉(zhuǎn)歸骨移植后新骨形成的成因影響骨生長發(fā)育的因素711.骨組織形成骨組織發(fā)生處血管增生，間充質(zhì)細胞骨祖細胞成骨細胞纖維、基質(zhì)(類骨質(zhì))鈣鹽骨基質(zhì)(自埋)骨細胞骨組織72骨組織形成———骨細胞骨原細胞間充質(zhì)———成骨細胞732.骨組織的分解吸收破骨細胞分解吸收骨組織74骨組織分解吸收——破骨細胞——骨組織75骨組織形成骨生長、改建（交替進行）+骨組織分解吸收76骨的發(fā)生方式1.膜內(nèi)成骨2.軟骨內(nèi)成骨間充質(zhì)胚胎性結(jié)締組織膜骨(頂骨)間充質(zhì)軟骨骨(長骨)771，膜內(nèi)成骨1）骨發(fā)生處血管增生間充質(zhì)細胞骨祖細胞成骨細胞纖維、基質(zhì)(類骨質(zhì))自埋骨細胞鈣鹽骨基質(zhì)骨組織改建胚性結(jié)締組織膜初級骨松質(zhì)骨化中心78膜內(nèi)成骨（頂骨為例）——血管———間充質(zhì)細胞——胚性結(jié)締組織膜79膜內(nèi)成骨———骨細胞骨原細胞間充質(zhì)———成骨細胞80

——————成骨細胞膜內(nèi)成骨——————破骨細胞81頂骨的生長與改建————外表面以成骨為主———內(nèi)表面以分解吸收為主曲度82膜內(nèi)成骨三、四個月胎兒之頂骨，石蠟切片，H·E染色1.骨膜：在標本兩側(cè)，為致密結(jié)締組織。2.新生骨片：大小不等、形態(tài)不一、著色較紅，可見其表面有成行排列的成骨細胞。骨片之間有疏松結(jié)締組織和血管。3.成骨細胞83膜內(nèi)成骨①成骨細胞②骨陷窩及骨細胞③骨原細胞842，軟骨內(nèi)成骨（長骨的發(fā)生）透明軟骨—軟骨膜

——軟骨組織間充質(zhì)（骨祖細胞）（1）.軟骨雛形形成85（2）.骨領(lǐng)形成—骨領(lǐng)

—骨膜（骨外膜）初級骨松質(zhì)（骨領(lǐng)）（骨細胞）軟骨雛形中段外周（骨祖細胞-成骨細胞）86（3）.軟骨內(nèi)骨化初級骨化中心形成Ι，軟骨退化軟骨中段軟骨細胞肥大死亡基質(zhì)鈣化軟骨退化①87軟骨退化———軟骨基質(zhì)鈣化———骨領(lǐng)———軟骨細胞（肥大、死亡）——骨膜88Ⅱ，初級骨化中心及初級骨髓腔形成血管破骨細胞間充質(zhì)退化軟骨區(qū)初級骨髓腔成骨細胞軟骨殘基表面造骨骨祖細胞過渡型骨小梁分解、吸收鈣化軟骨基質(zhì)（先出現(xiàn)處為初級骨化中心）89血管、破骨細胞、間充質(zhì)進入血管————破骨細胞間充質(zhì)90初級骨髓腔的形成初級骨髓腔—————破骨細胞91初級骨髓腔—————軟骨殘基——————破骨細胞———————成骨細胞——過渡型骨小梁92②骨髓腔形成：破骨細胞溶解物吸收過渡性骨小梁，將初級骨髓腔融合成為較大的腔即骨髓腔，并隨著初級骨化中心成骨過程而擴大93③次級骨化中心形成骨干兩端

次級骨化中心-骨組織填充-骨骺中央-四周骨化骺板：骨骺與骨干之間保留的軟骨層關(guān)節(jié)軟骨：骨骺表面保留的軟骨層94——次級骨化中心骨骺——骨骺————關(guān)節(jié)軟骨———骺板骺線95④骨的加長和增粗Ι，加長：骺板不斷生長---經(jīng)過四個不同階段(區(qū)）--成骨組織96加長：成骨活動四區(qū)軟骨儲備區(qū)軟骨增生區(qū)軟骨鈣化區(qū)成骨區(qū)軟骨骨髓腔97成骨活動四區(qū)98軟骨儲備區(qū)軟骨細胞小，散在基質(zhì)弱嗜堿性99軟骨增生區(qū)軟骨細胞柱——————100軟骨鈣化區(qū)101成骨區(qū)102Ⅱ，增粗：骨外膜骨祖細胞-成骨細胞-骨組織骨干內(nèi)部：破骨細胞吸收骨小梁-骨髓腔擴大103骨的修復骨折：局部血管斷裂，形成血塊，骨折附近的骨基質(zhì)破壞，骨細胞死亡骨修復：血塊被肉芽組織機化，肉芽組織轉(zhuǎn)變成致密纖維結(jié)締組織。纖維軟骨痂，軟骨內(nèi)成骨。膜內(nèi)成骨。原始骨痂轉(zhuǎn)變成永久骨痂。104骨的修復與重建

（一）血腫機化期骨斷裂后，髓腔內(nèi)，骨膜下和周圍軟組織內(nèi)出血，形成血腫，血腫于傷后6－8小時即開始凝結(jié)成含有網(wǎng)狀纖維的血凝塊。骨折端由于損傷和局部血液供應(yīng)斷絕，有幾毫米長的骨質(zhì)發(fā)生壞死。斷端間、髓腔內(nèi)的血腫凝成血塊。它和損傷壞死的軟組織引起局部無菌性炎癥反應(yīng)。新生的毛細管和吞噬細胞、成纖維細胞等從四周侵入，逐步進行消除機化，形成肉芽組織。轉(zhuǎn)化為纖維組織。這一過程約需2～3周方能初步完成。105骨的修復與重建

（二）原始骨痂形成期由骨內(nèi)、外膜的骨樣組織逐漸鈣化而成新生骨，即膜內(nèi)化骨。兩者緊貼在斷端骨皮質(zhì)的內(nèi)、外兩面，逐漸向骨折處匯合，形成兩個梭形短管，將兩斷裂的骨皮質(zhì)及其間由血腫機化而成的纖維組織夾在中間，分別稱為內(nèi)骨痂和外骨痂。106骨的修復與重建

（三）骨痂改造塑型期原始骨痂為排列不規(guī)則的骨小梁所組成，尚欠牢固，應(yīng)防止外傷，以免發(fā)生再骨折。隨著肢體的活動和負重，在應(yīng)力軸線上的骨痂，不斷地得到加強和改造；在應(yīng)力軸線上以外的骨痂，逐步被清除；使原始骨痂逐漸被改造成為永久骨痂，后者具有正常的骨結(jié)構(gòu)。骨髓腔亦再溝通，恢復骨之原形。小孩為1～2年，成人為2～4年。107骨移植中移植骨的歸宿和新骨的生成骨移植：用手術(shù)方法將各種骨組織移植到患者體內(nèi)的骨缺損區(qū)、須加強或融合的部位，目的是起到固定、促進骨形成和替代的作用。自體骨移植、同種骨移植、異種骨移植、人工骨移植。帶血管蒂骨移植。移植骨的轉(zhuǎn)歸骨移植后新骨形成的成因108移植骨的轉(zhuǎn)歸移植骨：壞死而被重吸收，通過“爬行替代”形成新骨；人工骨：被吸收后由新骨替代；帶血管蒂骨移植：類似正常骨折的愈合過程。109骨移植后新骨形成的成因

成骨細胞學說：新骨來自移植骨中的成骨細胞爬行替代學說：移植骨壞死被吸收骨誘導學說：釋放BMP，誘導成骨骨移植后新骨形成須具備三個條件：有可以生骨的細胞、足夠的營養(yǎng)供應(yīng)、適當誘發(fā)產(chǎn)生新骨的刺激。110影響骨生長發(fā)育的因素激素的影響骨生長因子的影響維生素的影響物理因素的影響111骨組織工程112成骨細胞是骨組織工程的關(guān)鍵細胞，成骨細胞合成和分泌I型膠原，并在I型膠原上形成鈣、磷結(jié)晶，完成骨基質(zhì)的礦化過程，自身最厚包埋在骨陷窩中，轉(zhuǎn)變成骨細胞。成骨細胞增殖能力強。有很強的成骨能力，植入體內(nèi)能較快形成新骨代替支架材料。對成骨細胞的分離培養(yǎng)、擴增和功能的調(diào)控是骨組織工程研究關(guān)鍵。骨組織工程細胞113骨組織工程細胞1.成骨細胞的組織來源2.不同來源成骨細胞的培養(yǎng)方法3.成骨細胞的生物學特性114成骨細胞的組織來源骨髓、骨膜、顱頂骨、髂骨等松質(zhì)骨?，F(xiàn)在已從大鼠、小鼠、兔、雞、牛及人的胚胎、幼年及成年個體中培養(yǎng)相應(yīng)的成骨細胞。115不同來源成骨細胞的培養(yǎng)方法骨髓基質(zhì)干細胞的培養(yǎng)采用穿刺抽吸骨髓或去除骨端沖洗出骨髓，離心后去細胞進行培養(yǎng)。骨膜和松質(zhì)骨來源的成骨細胞：組織塊培養(yǎng)法、酶消化培養(yǎng)法。注意去除成纖維細胞的污染。116三種細胞各有優(yōu)點三種細胞各有優(yōu)點：骨髓：取材方便，對供體損傷小，可反復抽吸；骨髓基質(zhì)干細胞為條件成骨細胞，需要適當?shù)恼T導因子，成骨量少，原代培養(yǎng)時獲得的有效細胞數(shù)量少，須較長時間體外培養(yǎng)；骨膜和松質(zhì)骨來源的成骨細胞具有原代細胞數(shù)目多，易定向分化為成骨細胞，成骨能力強，但是取材時對供體有傷害，來源受限，增殖能力不如骨髓基質(zhì)干細胞。117成骨細胞的生物學特性成骨細胞的主要功能：合成、分泌骨基質(zhì)并促進基質(zhì)礦化形成骨組織。體外培養(yǎng)的成骨細胞表現(xiàn)為增殖態(tài)和功能態(tài)2種相對狀態(tài)。118（一）成骨細胞與細胞外基質(zhì)的關(guān)系（二）成骨細胞與血管內(nèi)皮細胞的關(guān)系（三）成骨細胞與破骨細胞的關(guān)系（四）成骨細胞與骨細胞的關(guān)系成骨細胞的生物學特性119（一）成骨細胞與細胞外基質(zhì)的關(guān)系ECM具有連接、支持細胞、組織的作用。ECM成分復雜多樣，一方面，細胞與ECM的粘附是細胞遷移、增殖、分化的基礎(chǔ)。另一方面，細胞與ECM的粘附還與胚胎發(fā)育、傷口修復、腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)。許多胞內(nèi)信號傳遞，都與細胞-ECM的粘附密切相關(guān)。120細胞與ECM通過膜上的特異性受體-整合素介導聯(lián)系。整合素介導的成骨細胞與ECM的粘附對成骨細胞的功能活動起重要的調(diào)節(jié)作用。成骨細胞的ECM主要有無機成分（磷酸鈣，增強骨組織的力學強度）和有機成分（I型膠原等）。構(gòu)建支架材料時，要求：理想的力學強度，結(jié)構(gòu)和功能接近自然骨，為成骨細胞的活動提供理想環(huán)境，并通過I型膠原等組分對成骨細胞的增殖、分化進行調(diào)控。121（二）成骨細胞與血管內(nèi)皮細胞的關(guān)系骨脈管系統(tǒng)在骨發(fā)育、改建和修復過程中作用重要。成骨和血管化不可分割，成骨細胞總是和血管床的內(nèi)皮細胞緊密相鄰，二者在功能上互相影響。血管內(nèi)皮細胞可合成和分泌一系列可溶性調(diào)節(jié)介質(zhì)，包括生長因子和細胞因子，這些因子具有控制骨細胞聚集、增殖、分化等作用。內(nèi)皮細胞是由間充質(zhì)來源，和骨髓緊密接觸，與骨髓具有共同的抗原，因而被認為有可能直接分化為成骨細胞和造血干細胞而參與骨發(fā)育。成骨細胞能分泌促血管形成因子，作用于內(nèi)皮細胞，促進血管形成。122構(gòu)建組織工程化人工骨時，如何實現(xiàn)人工骨的體內(nèi)血管化是關(guān)鍵技術(shù)之一。人工骨的快速血管化可為成骨細胞功能活動提供充足的營養(yǎng)成分，決定成骨量的多少；只有完成了人工骨的血管化，人工骨才能演變?yōu)樽泽w骨，在體內(nèi)發(fā)揮持久的生理功能。123構(gòu)建組織工程化人工骨在支架內(nèi)部預值這種內(nèi)皮細胞的人造血管，植入體內(nèi)時與自體血管吻合；在支架材料上進行血管內(nèi)皮細胞的三維培養(yǎng)，使血管內(nèi)皮細胞長入材料內(nèi)部，植入體內(nèi)時這些內(nèi)皮細胞作為種子誘導整個材料發(fā)生毛細血管化。124（三）成骨細胞與破骨細胞的關(guān)系成骨和破骨對立統(tǒng)一。成骨細胞的成骨可以不斷形成新骨，破骨細胞的破骨活動對新骨不斷改造，動態(tài)平衡。成骨細胞是關(guān)鍵，破骨細胞的啟動因子來源于成骨細胞，細胞因子、激素通過成骨細胞調(diào)節(jié)破骨細胞的活力，從而調(diào)節(jié)骨吸收活動；破骨細胞也分泌一些細胞因子影響成骨細胞的功能活動。植入早期，成骨正調(diào)控，破骨負調(diào)控；后期，對成骨進行負調(diào)控，破骨正調(diào)控，使人工骨上沉積的新骨不致過量，盡早完成人工骨改建。125（四）成骨細胞與骨細胞的關(guān)系成骨細胞轉(zhuǎn)換為骨細胞126（一）與骨形成有關(guān)的其他生長因子1.血管內(nèi)皮細胞生長因子2.腫瘤壞死因子3.白細胞介素-1(二)生長因子的作用機制