單克隆抗體的純化

單克隆抗體的純化一、腹水型單抗的純化在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預(yù)處理，目的是為了進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質(zhì)、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。1、 二氧化硅吸附法新鮮采集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min15分鐘，除去細胞成分（或凍存過程中形成的固體物質(zhì)）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCl，0.8mmol/LMg2+，0.3mmol/LCa2+）稀釋；然后以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時搖動；2000g離心20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清的腹水。2、 過濾離心法用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g15分鐘高速離心（4°C）除去細胞殘渣及小顆粒物質(zhì)。3、 混合法即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。二、單抗的粗提1、硫酸銨沉淀法（1） 飽和硫酸銨溶液的配制500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結(jié)晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/LNaOH調(diào)PH至7.8。（2） 鹽析吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續(xù)緩慢攪拌30分鐘；10000r/min離心15分鐘；棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鐘，同法離心；重復(fù)前一步1-2次；沉淀物溶于1.5mlPBS（0.01mol/LPH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。（3） 脫鹽常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過SephadexG-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鐘1ml。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2%NaHCO3，1mmol/LEDTA溶液中煮10分鐘，用蒸餾水清洗透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鐘，冷至室溫即可使用（并可于0.2mol/LEDTA溶液中，4°C保存?zhèn)溆茫?。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4C）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解后，再加20%NaOH50ml）檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。（4） 蛋白質(zhì)含量的測定（Pr）（mg/ml）=（1.45XOD280-0.74XOD260）X稀釋倍數(shù)；或（Pr）=OD280X稀釋倍數(shù)/1.3（5） 分裝凍存?zhèn)溆?、 辛酸-硫酸銨沉淀法該法簡單易行，適合于提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預(yù)處理過的腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸緩沖液，用1mol/LHCl調(diào)PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內(nèi)加完，4°C靜置2小時，取出15000g離心30分鐘，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾（125um）,加入1/10體積的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH調(diào)PH至7.2；在4°。下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鐘，靜置1小時；10000g離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量PBS（含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/LEDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4C過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鐘，除去不溶性沉渣，測定蛋白質(zhì)含量后，分裝，凍存?zhèn)溆谩?、 優(yōu)球蛋白沉淀法該法適用于IgG3和IgM型單抗的提取，所獲制品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高于90%,對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預(yù)處理過的腹水，先后加入NaCl和CaCl2,使各自的濃度分別達0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產(chǎn)生；經(jīng)濾紙過濾后，濾液對100倍體積的去離子水透析，4°C8-15小時（若是IgG3單抗，也可室溫2小時），其間換水1-2次；取出后22000g離心30分鐘，棄上清；將沉淀溶于PH8.01mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl溶液中，重復(fù)上述的透析與離心；將沉淀的優(yōu)球蛋白