DNA甲基化和臨床應(yīng)用教學(xué)課件

DNA甲基化和臨床應(yīng)用DNA甲基化和臨床應(yīng)用第1頁(yè)目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)33DNA甲基化和臨床應(yīng)用第2頁(yè)為何熊貓是黑白？——基因決定命運(yùn)DNA甲基化和臨床應(yīng)用第3頁(yè)同卵雙生孿生子含有完全相同基因組。但她們長(zhǎng)大成人后在性格、健康方面往往存在很大差異。DNA甲基化和臨床應(yīng)用第4頁(yè)先從表觀遺傳學(xué)談起相同基因型不一樣表型?基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)DNA甲基化和臨床應(yīng)用第5頁(yè)現(xiàn)代表觀遺傳學(xué)概念:基因DNA序列不發(fā)生改變情況下,基因表示水平與功效發(fā)生改變,并產(chǎn)生可遺傳表型。表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象（基因表示調(diào)控方法）:DNA甲基化---表觀遺傳學(xué)關(guān)鍵（最初始調(diào)控方法）組蛋白修飾MicroRNAGenomicimprintingDNA甲基化和臨床應(yīng)用第6頁(yè)不一樣層次表示調(diào)控DNA甲基化和臨床應(yīng)用第7頁(yè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶:DNMT胞嘧啶:Cytosine5’-甲基胞嘧啶:5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸:SAMS-腺苷-高半胱氨酸:SAHDNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶作用下,在基因組CpG二核苷酸胞嘧啶5‘碳位以共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。DNA甲基化概念DNA甲基化和臨床應(yīng)用第8頁(yè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)哺乳動(dòng)物體內(nèi)有三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶:——DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1---連續(xù)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶;與甲基化相關(guān),缺乏引發(fā)基因組低甲基化,染色體缺失、重排、突變畸形。DNMT3A、DNMT3B---從頭甲基轉(zhuǎn)移酶;與去甲基化相關(guān),在胚胎干細(xì)胞和早期胚胎中高度表示,缺乏引發(fā)胚胎死亡,在腫瘤組織中廣泛高表示。DNA甲基化和臨床應(yīng)用第9頁(yè)通常開(kāi)啟子和第一個(gè)外顯子區(qū),CpG序列密度非常高,超出均值5倍以上,成為鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶富集區(qū)。結(jié)構(gòu)基因組中70%～90%獨(dú)立CpG都被甲基化,未甲基化CpG成簇地聚集形成CpG島約有60％以上基因開(kāi)啟子含有CpG島。—是結(jié)構(gòu)基因開(kāi)啟子關(guān)鍵序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。CpG島（CpGisland）估計(jì)軟件http://pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.htmlhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/DNA甲基化和臨床應(yīng)用第10頁(yè)目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)33DNA甲基化和臨床應(yīng)用第11頁(yè)DNA甲基化生物學(xué)作用在發(fā)育和分化中調(diào)控基因表示轉(zhuǎn)錄抑制特征性表型基因表示（膚色、毛發(fā)）X染色體失活（X-inactivation）基因印記堿基突變腫瘤代謝DNA甲基化和臨床應(yīng)用第12頁(yè)DNA甲基化作為一個(gè)可遺傳表觀遺傳修飾,在體細(xì)胞增殖過(guò)程中經(jīng)過(guò)依靠于DNA復(fù)制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1穩(wěn)定地傳輸給子細(xì)胞。但在胚胎發(fā)育不一樣時(shí)期,基因組范圍內(nèi)DNA甲基化水平會(huì)發(fā)生猛烈改變,改變最猛烈階段為配子形成期與早期胚胎發(fā)育階段,甲基化模式在配子形成時(shí)已經(jīng)建立。DNA甲基化與胚胎發(fā)育DNA甲基化和臨床應(yīng)用第13頁(yè)DNA甲基化在動(dòng)物胚胎和生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中重編程DNA甲基化和臨床應(yīng)用第14頁(yè)CPGisland功效:經(jīng)過(guò)甲基化與去甲基化,調(diào)控下游基因表示——基因表示調(diào)控開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)錄抑制DNA甲基化和臨床應(yīng)用第15頁(yè)影響基因表示直接抑制基因表示或甲基化CpG雙核苷酸序列可被甲基結(jié)合蛋白家族識(shí)別,以后者可經(jīng)過(guò)吸引補(bǔ)充組蛋白去乙酞化酶和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶等組蛋白修飾蛋白質(zhì)來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)活性,以間接方法影響基因表示。DNA甲基化和臨床應(yīng)用第16頁(yè)IAP:intracisternalAparticle去甲基化:灰鼠基因（agouti）僅微量表示甲基化:基因超量表示特征性表型基因表示DNA甲基化和臨床應(yīng)用第17頁(yè)X染色體失活X染色體失活（X-inactivation）:生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,雌性哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中兩條X染色體其中一條失去活性現(xiàn)象。研究發(fā)覺(jué)失活染色體上DNA序列都呈高度甲基化,造成絕大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄處于關(guān)閉狀態(tài)。避免因擁有兩條X染色體而產(chǎn)生雙倍基因產(chǎn)物,保持和雄性動(dòng)物X染色體數(shù)量及功效上一致性。DNA甲基化和臨床應(yīng)用第18頁(yè)基因組印記？組織或細(xì)胞中,基因表示含有親本選擇性,即只有一個(gè)親本等位基因表示,而另一親本等位基因不表示或極少表示現(xiàn)象,對(duì)應(yīng)基因則稱為印記基因。父系不表示稱父系印記母系不表示稱母系印記基因印記DNA甲基化和臨床應(yīng)用第19頁(yè)差異甲基化區(qū)域差異甲基化區(qū)域(differentiallymethylatedregion,DMR),是指染色體上甲基化狀態(tài)含有親本特異性區(qū)域,即起源于不一樣親本DNA序列甲基化狀態(tài)不一樣區(qū)域差異甲基化關(guān)鍵發(fā)生在基因開(kāi)啟子區(qū),少數(shù)在外顯子,現(xiàn)已發(fā)覺(jué)印記基因大多數(shù)含有DMR或受DMR調(diào)控。DNA甲基化和臨床應(yīng)用第20頁(yè)堿基CT突變堿基突變

甲基化突變DNA甲基化和臨床應(yīng)用第21頁(yè)腫瘤細(xì)胞發(fā)生時(shí)常出現(xiàn)DNA甲基化模式改變,關(guān)鍵包含甲基化轉(zhuǎn)移酶表示水平提升、基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平異常升高,從而造成基因組不穩(wěn)定,如染色質(zhì)構(gòu)象異常、轉(zhuǎn)座子激活、原癌基因激活表示以及抑癌基因被抑制表示等。DNA甲基化與腫瘤DNA甲基化和臨床應(yīng)用第22頁(yè)目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)33DNA甲基化和臨床應(yīng)用第23頁(yè)A．基因組甲基化水平(MethylationContent)分析高效液相色譜高效毛細(xì)管電泳法B．候選基因(CandidateGene)甲基化分析甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法重亞硫酸鹽測(cè)序法甲基化特異性PCR甲基化熒光法(MethyLight)焦磷酸測(cè)序結(jié)合重亞硫酸鹽限制性內(nèi)切酶法甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)DNA甲基化和臨床應(yīng)用第24頁(yè)C.基因組范圍DNA甲基化模式與甲基化譜分析限制性標(biāo)識(shí)基因組掃描甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增甲基化CpG島擴(kuò)增差異甲基化雜交由連接子介導(dǎo)PCR出HpaII小片斷富集分析甲基化DNA免疫沉淀法DNA甲基化和臨床應(yīng)用第25頁(yè)高效液相色譜法DNA甲基化和臨床應(yīng)用第26頁(yè)直接測(cè)序法DNA甲基化和臨床應(yīng)用第27頁(yè)焦磷酸測(cè)序法

經(jīng)過(guò)檢測(cè)CpG對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上C/T滲透百分比對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)甲基化程度進(jìn)行定量分析,是現(xiàn)在最可靠甲基化定量分析方法。DNA甲基化和臨床應(yīng)用第28頁(yè)全基因組甲基化圖譜全基因組甲基化測(cè)序（WGBS）DNA甲基化和臨床應(yīng)用第29頁(yè)芯片平臺(tái)Illumina850K芯片可檢測(cè)人全基因組約853,307個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)。850K芯片不僅保持了對(duì)CpG島,基因開(kāi)啟子區(qū)全方面覆蓋,還尤其加強(qiáng)了增強(qiáng)子區(qū)以及基因編碼區(qū)探針覆蓋。廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞研究、腫瘤和其她復(fù)雜疾病研究,是現(xiàn)在最適合表觀基因組全關(guān)聯(lián)分析研究全基因組DNA甲基化芯片。Illumina850K芯片技術(shù)步驟DNA甲基化和臨床應(yīng)用第30頁(yè)DNA甲基化和臨床應(yīng)用第31頁(yè)目錄甲基化的作用2臨床相關(guān)應(yīng)用4引言及概念31甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)33DNA甲基化和臨床應(yīng)用第32頁(yè)正常生物DNA甲基化DNA甲基化始發(fā)于胚胎早期,伴隨組織細(xì)胞分化發(fā)育,基因組DNA經(jīng)歷了去甲基化、區(qū)域性重新甲基化以及組織特異基因選擇性去甲基化過(guò)程。最終,這種DNA甲基化模式就相對(duì)穩(wěn)定下來(lái)。DNA甲基化和臨床應(yīng)用第33頁(yè)腫瘤組織DNA甲基化腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)改變,其特點(diǎn)是總體甲基化水平降低與局部甲基化水平升高。腫瘤細(xì)胞特征:癌基因低甲基化→被激活抑癌基因高甲基化→被緘默DNA甲基化和臨床應(yīng)用第34頁(yè)DNA甲基化和臨床應(yīng)用第35頁(yè)應(yīng)用前景1--腫瘤早期診療抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早期就發(fā)生而且一直進(jìn)行,造成惡性腫瘤表型表示優(yōu)點(diǎn):DNA甲基化檢測(cè)含有早期、無(wú)創(chuàng)、快捷、靈敏度高等特點(diǎn)。（血液、粘膜上皮標(biāo)本）缺點(diǎn):特異性不足DNA甲基化和臨床應(yīng)用第36頁(yè)表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)識(shí)開(kāi)發(fā)3月,張鹍教授團(tuán)體在NatureGenetics（NG）雜志公布了令人振奮研究結(jié)果,利用更靈敏算法配合組織甲基化模式開(kāi)發(fā)無(wú)創(chuàng)診療技術(shù),能夠檢測(cè)并定位腫瘤。經(jīng)過(guò)比較腫瘤和正常細(xì)胞DNA甲基化數(shù)據(jù)找到腫瘤特異甲基化Marker。DNA甲基化和臨床應(yīng)用第37頁(yè)燃石醫(yī)學(xué)自主研發(fā)了無(wú)創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)(MERMAID?),利用多層級(jí)甲基化探針設(shè)計(jì)策略,可實(shí)現(xiàn)在檢測(cè)成本可控情況下同時(shí)檢測(cè)超出10萬(wàn)個(gè)臨床診療相關(guān)甲基化CpG位點(diǎn),并經(jīng)過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法建立分類模型,實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)樣本自動(dòng)分型。cfDNA無(wú)創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)(MERMAID?)用于肺部占位病變（含肺癌）早篩可實(shí)現(xiàn)99.6%敏感性和100%特異性,用于肺部結(jié)節(jié)良惡性判定可實(shí)84.8%敏感性和87.5%特異性。cfDNA甲基化液體活檢技術(shù)DNA甲基化和臨床應(yīng)用第38頁(yè)應(yīng)用前景2--腫瘤復(fù)發(fā)獨(dú)立估計(jì)因子口腔鱗狀細(xì)胞癌時(shí)存在RECK基因甲基化患者復(fù)發(fā)率顯著增高甲基化影響生存期膀胱癌中APC、GSTP1和TIG1基因發(fā)生異常甲基化時(shí),患者存活時(shí)間顯著縮短LONGNK,etal.HypermethylationoftheRECKgenepredictspoorprognosisinoralsquamouscellcarcinomas[J].OralOncol,,44(11):1052-1058.ELLINGERJ,etal.HypermethylationofCell-FreeSerumDNAIndicatesWorseOutcomeinPatientsWithBladderCancer.JUrol,,179(1):346-352.DNA甲基化和臨床應(yīng)用第39頁(yè)應(yīng)用前景3--腫瘤去甲基化診療DNA甲基化程度依靠于DNMT活性。正常甲基化模式建立需要DNMT1和DNMT3共同作用,DNMT1是DNMT3開(kāi)啟CpG核苷酸從頭甲基化確保,而DNMT3則使甲基化水平穩(wěn)定在正常需要水平（去甲基化）——抑制DNMT活性藥品是診療腫瘤新期望DNA甲基化和臨床應(yīng)用第40頁(yè)優(yōu)點(diǎn):新型抗腫瘤藥品缺點(diǎn):無(wú)基因特異性,不能選擇性地活化緘默目基因,從而會(huì)引發(fā)整體低甲基化;藥品活化作用可逆,療效依靠于藥品連續(xù)存在;大劑量應(yīng)用時(shí)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞有毒副作用—是否會(huì)誘發(fā)第二腫瘤？應(yīng)用前景3--腫瘤去甲基化診療DNA甲基化和臨床應(yīng)用第41