第二章蛋白質(zhì)與非蛋白含氮化合物的代謝紊亂1

第九章血漿蛋白質(zhì)檢驗(yàn)三、血漿蛋白主要組分的生物化學(xué)檢驗(yàn)

二、血清蛋白質(zhì)電泳組分的臨床分析

第一節(jié)血漿蛋白質(zhì)一、血漿蛋白質(zhì)的功能和分類一、血漿蛋白質(zhì)的功能和分類

（一）血漿蛋白質(zhì)的功能1.營養(yǎng)、修補(bǔ)作用；2.維持血漿膠體滲透壓；3.作為血液pH緩沖系統(tǒng)的一部分；4.載體蛋白；5.抑制組織蛋白酶；6.催化作用7.參與凝血與纖維蛋白溶解8.免疫防御功能（二）血漿蛋白質(zhì)的分類

最簡單：分為清蛋白和球蛋白較實(shí)用：由電泳獲得血漿蛋白質(zhì)概貌功能分類：比較復(fù)雜，但方便研究1.電泳分類法

醋纖膜電泳或瓊脂糖電泳：

清蛋白

α1球蛋白

α2球蛋白

β球蛋白

γ球蛋白

分辨率高時(shí)：可有β1和β2α2中也可有兩條如果采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，在適當(dāng)條件下可以分出30多個(gè)區(qū)帶。

正常血清蛋白電泳圖譜示意圖及其掃描曲線

2.功能分類法

運(yùn)輸載體類補(bǔ)體蛋白類免疫球蛋白類凝血蛋白類蛋白酶抑制物類血清酶類蛋白激素類（三）影響血漿蛋白質(zhì)濃度的因素

1.急性時(shí)相反應(yīng)蛋白（APP）：對炎癥和組織損傷的非特異性反應(yīng)，血漿蛋白質(zhì)如α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、觸珠蛋白、銅藍(lán)蛋白、C4、C3、纖維蛋白原、C-反應(yīng)蛋白和血清淀粉樣蛋白A等濃度顯著升高或升高，而血漿前清蛋白、清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度則出現(xiàn)相應(yīng)下降。這些血漿蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白（APP）。這種現(xiàn)象稱為急性時(shí)相反應(yīng)（APR）。增加超過25%的蛋白質(zhì)稱為正向APP，下降25%以上的蛋白質(zhì)稱為負(fù)向APP.APR的機(jī)制是對炎癥的一般反應(yīng)。損傷部位釋放的細(xì)胞因子，包括白介素、腫瘤壞死因子α和β、干擾素以及血小板活化因子等，引發(fā)肝細(xì)胞中APP合成量的改變。正向APP是機(jī)體防御機(jī)制的一個(gè)部分，尤其是活化補(bǔ)體、蛋白酶抑制劑對酶活性的控制、觸珠蛋白對被破壞紅細(xì)胞中釋放Hb的保護(hù)作用等。作為營養(yǎng)蛋白的負(fù)向APP此時(shí)合成減少，可為合成正向APP提供更多的氨基酸原料。APR的時(shí)相C-反應(yīng)蛋白首先升高12小時(shí)內(nèi)α1-酸性糖蛋白也升高然后α1-抗胰蛋白酶、觸珠蛋白、C4和纖維蛋白原升高最后是C3和銅藍(lán)蛋白升高通常在2～5天內(nèi)這些APP達(dá)到最高值A(chǔ)PP的臨床應(yīng)用幫助監(jiān)測炎癥發(fā)生及過程和觀察治療反應(yīng)

尤其是那些升高最早和最多的蛋白質(zhì)。

疾病時(shí)血漿蛋白質(zhì)的濃度變化被體內(nèi)類固醇激素的狀態(tài)復(fù)雜化，包括類固醇激素治療、妊娠和口服避孕藥。

2.類固醇激素二、血清蛋白質(zhì)電泳組分的臨床分析

醋纖膜電泳正常百分含量清蛋白：57％～68％α1球蛋白：1.0％～5.7％α2球蛋白：4.9％～11.2％β球蛋白：7％～13％γ球蛋白：9.8％～18.2％

各電泳區(qū)帶的主要蛋白質(zhì)及其含量前清蛋白前清蛋白0.2～0.4g/L清蛋白清蛋白 35～55α1-球蛋白

α1-抗胰蛋白酶

α1-酸性糖蛋白甲胎蛋白高密度脂蛋白0.9～2.00.5～1.53×10～51.7～3.25α2-球蛋白觸珠蛋白

α2-巨球蛋白銅藍(lán)蛋白0.3～2.01.25～4.10.2～0.5β-球蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白低密度脂蛋白

C4 β2-微球蛋白纖維蛋白原

C32.0～3.50.6～1.550.001～0.0022.0～4.00.7～1.5γ-球蛋白

IgA

IgG

IgMC-反應(yīng)蛋白0.7～4.07.0～160.4～2.30.008正常圖譜腎病綜合征肝硬化(β-γ橋)肝硬化(不典型β-γ橋)

高濃度的甲胎蛋白可表現(xiàn)為清蛋白與α1區(qū)帶間一條清晰的新帶。C-反應(yīng)蛋白異常增高可出現(xiàn)特殊界限的γ區(qū)帶。單核細(xì)胞白血病可出現(xiàn)由于溶菌酶異常增多的γ后區(qū)帶。其他異常區(qū)帶

漿細(xì)胞病與M蛋白正常血清蛋白電泳上顯示的寬γ區(qū)帶主要成分:免疫球蛋白。發(fā)生漿細(xì)胞?。╬lasmacelldyscrasia）時(shí)，異常漿細(xì)胞克隆增殖，產(chǎn)生大量單克隆免疫球蛋白或其輕鏈或重鏈片段，病人血清或尿液中可出現(xiàn)結(jié)構(gòu)單一的M蛋白，在蛋白電泳時(shí)呈現(xiàn)一個(gè)色澤深染的窄區(qū)帶，此區(qū)帶較多出現(xiàn)在γ或β區(qū)，偶見于α區(qū)。漿細(xì)胞病的電泳圖電泳條帶由上至下依次為Alb,α1,α2,β,γ區(qū)帶箭頭所指為可疑M區(qū)帶

血清蛋白電泳圖多發(fā)性骨髓瘤多發(fā)性骨髓瘤IgG型多發(fā)性骨髓瘤IgA型三、血漿蛋白主要組分的生物化學(xué)檢驗(yàn)1.前清蛋白2.清蛋白3.α1-抗胰蛋白酶4.α1-酸性糖蛋白5.觸珠蛋白6.α2-巨球蛋白7.銅藍(lán)蛋白8.轉(zhuǎn)鐵蛋白9.C-反應(yīng)蛋白10.β2-微球蛋白（一）前清蛋白（prealbumin，PA）＆分子量：54kD；T?：1.9d；＆

主要包括：視黃醇結(jié)合蛋白和甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白＆

PI=4.7；蛋白電泳時(shí)遷移至Alb的前方；＆肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，可作為組織修補(bǔ)材料和運(yùn)載蛋白。1.性質(zhì)：2.前清蛋白的臨床意義②營養(yǎng)不良的指標(biāo)③肝功能不全的指標(biāo)敏感①負(fù)性急性時(shí)相反應(yīng)蛋白（二）清蛋白（albumin，Alb）分子量66.2kD不含糖，高度溶于水的血漿蛋白質(zhì)在生理pH環(huán)境中為負(fù)離子。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成T?：19d血漿中含量最多的蛋白質(zhì)1.性質(zhì)：2.清蛋白的生理功能①維持血漿膠體滲透壓：血漿滲透壓的75%～80%由Alb維持②血漿中主要的載體蛋白，具有結(jié)合各種配體分子的能力③緩沖酸堿，維持酸堿平衡作用④營養(yǎng)作用3.清蛋白的臨床意義1）降低◆

Alb合成不足◆

Alb的分布異?！?/p>

Alb過度丟失◆

Alb分解代謝增加2）升高：少見蛋白質(zhì)攝入不足肝功減退（三）α1-抗胰蛋白酶（α1—antitrypsin，AAT）分子量52kD；pI為4.8含糖10%～12%在醋纖膜電泳中位于α1區(qū)帶（α1區(qū)帶的主要組分）主要由肝細(xì)胞合成，單核細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞也能合成1.性質(zhì)：

AAT是一種蛋白酶抑制劑，主要對抗多形核白細(xì)胞起吞噬作用時(shí)釋放的溶酶體蛋白水解酶。所以當(dāng)AAT缺乏時(shí)，可使蛋白水解酶過份地作用于肺泡壁的彈力纖維而導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生。2.AAT的生理功能

AAT發(fā)揮作用具有PH依賴性：中性或弱堿性時(shí)，顯示最大抑制；PH<4.5時(shí)活性表失。AAT具有多種遺傳表型，其中以PiMM型（正常的等位基因）最多見，占人群的90%以上根據(jù)等位基因出現(xiàn)頻率的不同，缺陷變體可進(jìn)一步分為常見和少見兩部分，最常見的缺陷變體為Z和S型,

可表現(xiàn)為以下遺傳分型：PiZZ、PiSS、PiSZ、PiMZ、PiMS。以MM型的蛋白酶抑制能力作為100%，ZZ型的相對活力僅為15%、SS為60%、MZ為57%、MS為80%，SZ為35%。3.AAT的遺傳表型◆PiZZ型、PiSS型甚至PiMS型常伴有早年出現(xiàn)的肺氣腫◆低血漿AAT可發(fā)現(xiàn)于胎兒呼吸窘迫綜合征◆PiZZ表型會(huì)發(fā)生肝損害，導(dǎo)致肝硬化3.AAT的臨床意義

AAT屬APRP，在炎癥、感染、腫瘤、肝病時(shí)均顯著增加。1）AAT缺陷：

2）AAT增加：（四）α1-酸性糖蛋白(α1–AcidGlycoprotein,AAG)分子量約40kD；pI為2.7～4.0屬血漿中含糖量最高（達(dá)45%）、酸性最強(qiáng)的糖蛋白典型的APRP主要在肝臟產(chǎn)生,某些腫瘤組織也可產(chǎn)生可結(jié)合利多卡因和普萘洛爾等藥物1.性質(zhì)：2.AAG的臨床意義④雌激素使AAG降低。

①AAG目前主要作為急性時(shí)相反應(yīng)的指標(biāo)，

AAG增高是活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎最可靠的指標(biāo)之一。②糖皮質(zhì)激素增加，可引起AAG升高。③在營養(yǎng)不良、嚴(yán)重肝損害、腎病綜合征以及胃腸道疾病致蛋白嚴(yán)重丟失等情況下AAG降低。（五）結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，Hap）（觸珠蛋白）一種APRP和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（與紅細(xì)胞釋放的游離Hb結(jié)合，每分子Hp可結(jié)合兩分子Hb，結(jié)合不可逆）。電泳中位于α2區(qū)帶。個(gè)體間有多種遺傳表現(xiàn)。分子中有α、β亞基，形成α2β2

四聚體。1.性質(zhì)：2.結(jié)合珠蛋白的功能

運(yùn)輸血管內(nèi)游離Hb到網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞降解，防止Hb從腎臟丟失而為機(jī)體保留鐵，并能避免Hb對腎臟的損傷。3.結(jié)合珠蛋白的臨床評(píng)價(jià)Hp下降：①溶血性疾病。Hp參考范圍較寬，須連續(xù)觀察溶血是否處于進(jìn)行狀態(tài)。血管外溶血不會(huì)使Hp發(fā)生變化。②嚴(yán)重肝病患者，Hp合成減少。Hp升高：屬APRP，燒傷和腎病綜合征等情況下，血Hp常明顯升高。觸珠蛋白的幾種遺傳表型

表型亞單位的結(jié)構(gòu)組成Hp1-1(α1F)2β2α1Fα1Sβ2(α1S)2β2分子量約為80kD，α鏈含氨基酸殘基83個(gè)，β鏈含氨基酸殘基245個(gè)Hp2-1(α1Sα2β2)n(α1Fα2β2)n分子量為120kD-200kD的聚合體，由于n不同，可以在電泳中出現(xiàn)多條帶Hp2-2(α2β)nN=3-8分子量為160kD-400kD，由于n

不同，可在電泳中出現(xiàn)多條帶（六）α2-巨球蛋白（α2-macroglobulin,α2-MG）

血漿中分子量最大的糖蛋白，相對分子質(zhì)量約為720kD，由肝細(xì)胞、單核細(xì)胞和星形細(xì)胞合成，半衰期約5d,1.性質(zhì)：2.α2-巨球蛋白的功能α2MG分子內(nèi)部有內(nèi)環(huán)硫酯鍵，能與多種離子和分子結(jié)合，特別是能與蛋白水解酶結(jié)合，結(jié)合的復(fù)合物引起α2MG的分子構(gòu)象的改變，從而抑制了pro水解酶的活性，導(dǎo)致酶不易作用于大分子底物。（酶未失活）若底物為分子量小的蛋白質(zhì)，則能被α2MG-蛋白酶復(fù)合物所催化而水解。因此，α2-MG可選擇性地保護(hù)某些蛋白酶的活性。α2-MG增高：低清蛋白血癥，尤其是腎病綜合征時(shí)，顯著增高。α2-MG降低：嚴(yán)重的急性胰腺炎和進(jìn)展型前列腺癌治療前。3.α2-巨球蛋白的臨床意義（七）銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin,Cp，CER）含銅的α2球蛋白，肝臟合成每分子結(jié)合6～8個(gè)銅原子，因含銅而呈藍(lán)色95%的血清銅存在于Cp中，其余5%呈可擴(kuò)散狀態(tài)血循環(huán)中的Cp可認(rèn)為是銅的無毒性代謝庫1.性質(zhì)：2.銅藍(lán)蛋白的功能特征①血漿銅的轉(zhuǎn)運(yùn)②具有氧化酶活性：對鐵（可催化Fe2+氧化為Fe3+）、多胺和多酚類底物有催化其氧化的能力。③具有抗氧化作用，可防止組織中脂質(zhì)過氧化物和自由基的生成，特別在炎癥時(shí)具有重要意義。3.銅藍(lán)蛋白的臨床評(píng)價(jià)Cp濃度減少有關(guān)的疾病：包括Wilson病、營養(yǎng)性銅缺乏和Menkes?。ㄟz傳性銅吸收不良）。屬于急性時(shí)相反應(yīng)蛋白：在妊娠、感染、創(chuàng)傷和腫瘤時(shí)血漿濃度增加。但在營養(yǎng)不良、嚴(yán)重肝病及腎病綜合征時(shí)往往下降。

4.Wilson病的診斷標(biāo)準(zhǔn)定義：Wilson病是一種常染色體隱性遺傳病，即患者血漿Cp含量明顯減少，血漿游離銅增加，銅沉積在肝可引起肝硬化，沉積在腦基底節(jié)的豆?fàn)詈藙t導(dǎo)致豆?fàn)詈俗冃?，因而該病又稱為肝豆?fàn)詈俗冃?。Wilson病診斷標(biāo)準(zhǔn)：Cp下降，血清總銅濃度降低、游離銅增加和尿銅排泄增加，肝中銅的含量升高。（八）轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TRF）分子量約79.5kD；pI5.5～5.9；半壽期為7d為單鏈糖蛋白，含糖量約6%電泳位置在β區(qū)帶主要由肝細(xì)胞合成能可逆地結(jié)合多價(jià)陽離子，每分子TRF可結(jié)合2個(gè)Fe3+血漿中TRF的濃度受食物鐵供應(yīng)的影響1.性質(zhì)：

TRF是血漿中主要的含鐵蛋白，負(fù)責(zé)運(yùn)載由消化道吸收的鐵和紅細(xì)胞降解釋放的鐵。TRF-Fe3+復(fù)合物被攝入細(xì)胞，從而將大部分Fe3+運(yùn)輸?shù)焦撬?，用于Hb合成，小部分則運(yùn)輸?shù)礁鹘M織細(xì)胞，用于形成鐵蛋白，以及合成肌紅蛋白、細(xì)胞色素等。2.TRF的功能3.轉(zhuǎn)鐵蛋白的臨床意義用于貧血的鑒別診斷和對治療的監(jiān)測作為營養(yǎng)狀態(tài)的一項(xiàng)指標(biāo)TRF是負(fù)性APP，而妊娠和應(yīng)用雌激素時(shí)則增高（九）C-反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP）是一種可以結(jié)合肺炎球菌細(xì)胞壁C-多糖的蛋白質(zhì)（1941年發(fā)現(xiàn)），命名為C-反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP）。肝細(xì)胞所合成的APRP，含5個(gè)相同的亞單位，非共價(jià)地結(jié)合為盤形多聚體相對分子質(zhì)量為115～140kD電泳分布在慢γ區(qū)帶，有時(shí)可延伸到β區(qū)帶

1.性質(zhì)：＆

在鈣離子存在下，CRP可結(jié)合卵磷脂和核酸及多種細(xì)胞、真菌、原蟲等體內(nèi)的多糖物質(zhì)。＆

結(jié)合后的復(fù)合體具有對補(bǔ)體系統(tǒng)的激活作用，引發(fā)對侵入細(xì)胞的免疫調(diào)理作用和吞噬作用，而表現(xiàn)炎癥反應(yīng)。＆CRP也可識(shí)別和結(jié)合由損傷組織釋放的內(nèi)源性毒性物質(zhì)，然后將其進(jìn)行去毒或從血液中清除，同時(shí)CRP則自身降解。2.C-反應(yīng)蛋白的功能3.C-反應(yīng)蛋白的臨床意義

第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的APRP，APR的一個(gè)極靈敏指標(biāo)CRP是非特異性指標(biāo)，主要用于結(jié)合臨床監(jiān)測疾?。孩俸Y查微生物感染；②評(píng)估炎癥性疾病的活動(dòng)度；③監(jiān)測系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病和外科手術(shù)后并發(fā)的感染④監(jiān)測腎移植后的排斥反應(yīng)等?！舴肿恿浚?.18萬，存在于所有有核細(xì)胞的表面，特別是淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并由此釋入血循環(huán)，半衰期約2h?！裟芡耆高^腎小球?yàn)V過膜，腎小管幾乎全部重吸收并分解。1.性質(zhì)：（十）β2微球蛋白(β2—Microglobulin，β2-MG)◆監(jiān)測腎臟功能2.β2-MG的臨床意義：◆急性白血病和淋巴瘤時(shí)，血中β2-MG上升

第二節(jié)蛋白質(zhì)的檢測一、血清蛋白質(zhì)的分析測定

1.總蛋白測定方法學(xué)概述

凱氏定氮法：參考方法

雙縮脲法：是臨床測定血清總蛋白首選的常規(guī)方法

酚試劑法紫外吸收法染料結(jié)合法：氨基黑、麗春紅、考馬斯亮藍(lán)、鄰苯三酚紅鉬（一）血清總蛋白測定（二）血清總蛋白雙縮脲法測定原理

血清中蛋白質(zhì)的兩個(gè)相鄰肽鍵（-CO-NH-）在堿性溶液中能與二價(jià)銅離子作用產(chǎn)生穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物。生成的紫色絡(luò)合物顏色的深淺與血清蛋白質(zhì)含量成正比，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。（三）總蛋白測定方法學(xué)評(píng)價(jià)

凱氏定氮法優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性好，回收率達(dá)101.54%

；精密度高，CV%為0.85%缺點(diǎn)：操作流程長，程序復(fù)雜。各種蛋白質(zhì)含氮量在疾病狀態(tài)差異較大等。

該法主要用作血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品定值及參考性工作，血清總蛋白常規(guī)測定中很少使用。雙縮脲法優(yōu)點(diǎn)：顯色穩(wěn)定性好，干擾物質(zhì)少，試劑單一，方法簡便缺點(diǎn)：靈敏度較低優(yōu)點(diǎn)：呈色靈敏度較高，達(dá)到雙縮脲法的100倍左右，有利于檢出較微量的蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)較長，試劑配制復(fù)雜，且專一性較差，大部分具有還原性的物質(zhì)均有不同程度的干擾作用。且酪氨酸色氨酸各蛋白質(zhì)比例不同。

酚試劑法優(yōu)點(diǎn)：簡便而常用，因未加任何試劑和處理，可保留制劑的生物活性，多用于純化的蛋白質(zhì)樣品。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確性不如雙縮脲法，因而不能作為常規(guī)方法廣泛使用。紫外吸收法①芳香族氨基酸280nm吸收峰：但因?yàn)楦鞣N蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的含量與比例不同而有較大差異；且尿酸和膽紅素在280nm附近也有干擾，故該法的準(zhǔn)確性和特異性有限；②肽鍵220～225nm強(qiáng)吸收峰：但太高而需要大量稀釋。

氨基黑、麗春紅常作為血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳或瓊脂糖凝膠電泳的染料。氨基黑對不同蛋白質(zhì)的結(jié)合力不一致(清球相差20%)，因此,在臨界濃度時(shí)可能會(huì)對臨床判斷帶來誤診。麗春紅對清球蛋白質(zhì)的結(jié)合力較一致,且色質(zhì)鮮艷,但靈敏度較低,適合染色后掃描定量。染料結(jié)合法測定方法學(xué)評(píng)價(jià)

考馬斯亮藍(lán)常用于需更高呈色靈敏度的蛋白電泳中，也可用于測定尿液、腦脊液等的蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速、靈敏。缺點(diǎn)：不同蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合力不一致，且比色杯對燃料有吸附作用,不適宜自動(dòng)化分析。

鄰苯三酚紅鉬可用于測定尿液、腦脊液等蛋白質(zhì)，該法克服了考馬斯亮藍(lán)法易吸附于比色杯的缺點(diǎn)，具有簡便、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可用于自動(dòng)化分析儀。染料結(jié)合法----國內(nèi)最常用方法是溴甲酚綠（bromcresolgreen，BCG）法，還有溴甲酚紫（bromcresolpurple,BCP）法。BCP法比BCG法受其他血漿蛋白的干擾少，但靈敏度較低，且與非人源性清蛋白結(jié)合力相當(dāng)弱，不適合于測定動(dòng)物樣本中的清蛋白，故BCP法臨床應(yīng)用較少。電泳法免疫法(免疫