BCA法測蛋白課件

實驗二BCA法測定蛋白質濃度(BCAproteinconcentrationdetermination

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耿磊

生物化學教研室〔301室〕郵箱：

1內容本卷須知前言實驗目的實驗原理

思考實驗步驟2前言前言一、蛋白質的理化性質？〔一〕、蛋白質的膠體性質〔二〕、蛋白質的兩性電離和等電點〔三〕、蛋白質的變性、沉淀和凝聚〔四〕、蛋白質的紫外吸收〔五〕、蛋白質的呈色反響3〔一〕、蛋白質的膠體性質前言蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。蛋白質膠體穩(wěn)定的因素：顆粒外表電荷、水化膜4〔二〕、蛋白質的兩性電離和等電點蛋白質的兩性電離

蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。前言5〔三〕、蛋白質的變性、沉淀和凝聚*蛋白質的變性(denaturation)在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。*蛋白質沉淀〔precipitation〕在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。*蛋白質的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較鞏固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。前言6由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。前言〔四〕、蛋白質的紫外吸收

7〔五〕、蛋白質的呈色反響前言蛋白質分子中的肽鍵及氨基酸殘基的各種特殊基團，在一定條件下可以和某些化學試劑呈現一定的顏色反響，顏色的深淺與其濃度成正比。

⒈茚三酮反響(ninhydrinreaction)⒉雙縮脲反響(biuretreaction)3.Folin-酚試劑反響

8前言二、蛋白質的測定方法

？〔一〕紫外線吸收法〔二〕雙縮脲法〔三〕Folin-酚試劑法〔四)考馬斯亮藍結合法〔五〕改進微量凱式定氮法〔六〕BCA法9前言

(一〕紫外吸收法由于蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質具有吸收紫外線的性質，吸收頂峰在280nm波長處。在此波長范圍內，蛋白質溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關系，可用作定量測定。優(yōu)點：是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。缺點：準確度較差，嘌呤、嘧啶、核酸等容易干擾測定。10前言

〔二〕雙縮脲法H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2→H2N-CO-NH-CO-NH2＋NH3雙縮脲

雙縮脲反響：雙縮脲在堿性條件下與銅離子結合生成紫紅色化合物，顏色深淺與蛋白質濃度成正比。

優(yōu)點：操作簡便、迅速、受蛋白質性質影響較小。缺點：靈敏度較差，本法測定蛋白質范圍1-20mg；特異性不高11前言蛋白質含有兩個以上的肽鍵(—CO—NH—)，因此有雙縮脲反響，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡合物。Folin酚反響是在雙縮脲反響的根底上，引進Folin試劑(磷鉬酸—磷鎢酸試劑)，蛋白質—銅絡合物能復原磷鉬酸—磷鎢酸試劑，生成藍色物質。在一定條件下，藍色強度與蛋白質的量成正比例。優(yōu)點：是操作簡便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏10－20倍，較雙縮脲法靈敏100倍。缺點：其缺乏之處是此反響受多種因素干擾。

〔三〕Folin-酚試劑法12考馬斯亮藍G-250染料在酸性條件下能與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰值從465nm變成595nm，溶液的顏色由棕紅色變?yōu)樗{色，在595nm測定的吸光度值與蛋白質濃度成正比，故可用于蛋白質定量測定。優(yōu)點：簡單、迅速、干擾物質少、靈敏度高〔比Lowry法靈敏4倍〕。缺點：用于不同蛋白質測定時有較大的偏差；大量去垢劑會使顯色反響受到干擾；標準曲線有輕微的非線性；比色杯染色嚴重，影響重復性。前言

〔四)考馬斯亮藍結合法

13蛋白質是機體內主要的含氮物質，而且氮元素的含量相當恒定，一般為16%，其他非蛋白質的含氮化合物所占得氮量甚微。因此，測定生物樣品的含氮量，即可推算蛋白質含量。優(yōu)點：準確度高，可測定不同形態(tài)樣品。缺點：靈敏度低，適用于0.2～1.0mg氮，誤差為±2％費時。前言

〔五〕改進微量凱式定氮法14〔六〕BCA法堿性條件下，蛋白將Cu2+復原為Cu+,Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線比照，即可計算待測蛋白的濃度。優(yōu)點：操作簡便、快速、靈敏度高，準確，試劑穩(wěn)定性好，經濟實用，抗干擾能力強。前言

15BCA蛋白質檢測流程：前言16前言17前言181.學習 掌握BCA法測定蛋白質濃度的原理。2.掌握721型分光光度計的使用。3.了解蛋白質測定的多種方法，并比較其優(yōu)缺點。實驗目的實驗目的19實驗原理BCA(bicinchoninicacid,二辛可酸〕堿性條件下，蛋白將Cu++復原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線比照，即可計算待測蛋白的濃度。

BCA分子式：實驗原理20原理圖：實驗原理21實驗步驟實驗步驟〔一〕實驗材料1、器材721型分光光度計、恒溫水浴箱、移液管、試管2、試劑(1)試劑A:含1%BCA二鈉鹽、2%無水碳酸鈉、0.16%酒石酸鈉、0.4%氫氧化鈉、0.95%碳酸氫鈉，將上述液體混合后調pH至11.25?！?〕試劑B：4%硫酸銅?！?〕BCA工作液：試劑A100mL+試劑B2L，混合。〔4〕蛋白質標準液：準確稱取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為1.5mg/mL的蛋白質標準液。(5)待測樣品。22實驗步驟〔二〕操作

231、將上述各管混勻后于37°C保溫30分鐘，用562nm波長比色測定吸光度值。2、以蛋白質含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制標準曲線。3、用測定管光吸收值在標準曲線上查找相應的蛋白質含量，再計算出待測血清中蛋白質濃度〔g/L)。實驗步驟24本卷須知1、紫外分光光度計的正確使用。2、試劑的準確量取，按操作表的順序依次添加試劑。3、待測樣品濃度在50～2000微克／毫升濃度范圍內有較好的線性關系。4、注意平安，保護好儀器。注意事項251、試比較BCA法與雙縮脲、Lowry法的異同。2、BCA法常用于科研，其有哪些特點。思考261〕預熱儀器。2〕選定波長。3〕固定靈敏度檔。一般測量固定在“1”檔。4〕調節(jié)“0”點。5〕調節(jié)T=100％。6〕測定。7〕關機。紫外分光光度計的