松樹苗期線蟲病抗性檢測技術規(guī)程

2松樹苗期線蟲病抗性檢測技術規(guī)程本文件規(guī)定了線蟲收集與分離、蟲源鑒定、線蟲培養(yǎng)與擴繁、苗木準備、人工接蟲、接蟲次數(shù)、感病指數(shù)、抗性評價、技術檔案管理的技術要求。本文件適用于松樹苗期松材線蟲病抗性的檢測和評價技術工作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB6000主要造林樹種苗木分級GB/T6001-1985育苗技術規(guī)程GB/T35342-2017松材線蟲分子檢測鑒定技術規(guī)程LY/T1000容器育苗技術3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1松材線蟲pinewoodnematode(Bursaphelenchusxylophilus)無脊椎動物，屬線蟲門(Nematoda)、側(cè)尾腺綱(Secernentea)、滑刃目(Aphelenchida)、滑刃總科(Aphelenchoidoidea)、滑刃科(Aphelenchoididae)、傘滑刃亞科(Bursaphelenchinae)、傘滑刃屬(Bursaphelenchus)的植物寄生線蟲。3.2松材線蟲病pinewiltdisease又稱松樹萎蔫病，是由松褐天牛(Monochamusalternatus)為主要媒介昆蟲、松材線蟲寄生于松樹引起的一種森林毀滅性病害。3.3人工接蟲artificialinsemination采用人工皮接法，采用解剖刀在松樹莖干上割開樹皮，深及木質(zhì)部，掀開樹皮塞入大小合適的棉球，并用封口膜將其包裹好，最后注入線蟲懸浮液。3.4感病指數(shù)susceptibilityindex按照病害輕重劃分為若干等級，調(diào)查時按病害程度分別將受測株歸入合適的等級中，然后統(tǒng)計出各級被害木的百分率。4線蟲收集與分離采用貝爾曼漏斗法，具體包括以下步驟：——準備寬10cm～20cm的玻璃漏斗，末端接15cm左右長的乳膠管，將套有乳膠管的玻璃漏斗放置在漏斗架上；3——乳膠管上安裝彈簧止水夾，往玻璃漏斗中緩慢注入適量無菌水，將乳膠管底部氣泡排出，觀察乳膠管是否漏水，若漏水需夾緊或更換止水夾；——將疫木劈成長約5cm、寬約0.5cm的碎木條，用兩層紗布或紙巾包裹后放入漏斗中，漏斗處貼上標簽，沿漏斗內(nèi)壁緩慢注入適量無菌水至浸沒樣品；——疫木浸泡12h后，松開止水夾，用干凈小培養(yǎng)皿或離心管收集線蟲懸浮液5ml～15ml。5蟲源鑒定5.1形態(tài)學鑒定形態(tài)學具體步驟如下：——將分離獲得的線蟲殺死，制作臨時玻片，在顯微鏡下觀察；——雌雄蟲呈蠕長形，蟲體細長；唇區(qū)高，縊縮顯著；口針細長，基部稍增厚，中食道球卵圓形；——雌成蟲單卵巢，前伸、直，有較寬陰門蓋，尾部末端寬圓呈指狀；——雄成蟲交合刺大，弓狀，成對，喙突顯著，遠端膨大如盤狀，尾部圓錐形，向腹彎曲似鳥抓，末端被一卵形交合傘包裹。5.2分子鑒定線蟲分子鑒定參照GB/T35342執(zhí)行。6線蟲培養(yǎng)與擴繁6.1線蟲培養(yǎng)線蟲采用PDA-灰葡萄孢平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體步驟如下：——在直徑9cm培養(yǎng)皿中加入30ml的PDA培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，水1000ml，接入灰葡萄孢，經(jīng)25℃恒溫培養(yǎng)7d；——待葡萄孢長滿平板，接入經(jīng)鑒定的雌、雄成蟲各10條，25℃恒溫暗培養(yǎng)使線蟲繁殖；6.2線蟲擴繁視線蟲繁殖情況7d~15d進行繼代擴繁培養(yǎng)。7苗木準備苗木準備具體步驟如下：——在培育好的I級容器苗木中挑選苗高相對一致，無病蟲害的健壯苗木30株；——容器苗的出圃規(guī)格、包裝與苗木運輸按執(zhí)行LY/T1000的規(guī)定；——苗木質(zhì)量檢驗按GB6000規(guī)定執(zhí)行；——采用隨機區(qū)組設計，小區(qū)株數(shù)10株，分3次重復定植在檢測大棚內(nèi)，各畦四邊分別設置保護行，扶下壓實（可降解容器帶營養(yǎng)袋種植，不可降解需剝袋種植），澆足定根水；——視不同區(qū)域不同季節(jié)常規(guī)管護15d~20d，至苗木生長穩(wěn)定。8人工接蟲人工接蟲具體步驟如下：——選擇氣溫30℃左右的晴朗天氣，苗木接蟲前統(tǒng)一澆透水；——在接種枝條的一側(cè)用鋒利刀剝開長約1cm割口，割口剝至形成層和木質(zhì)部，用移液槍將0.2ml線蟲懸浮液均勻注入切口，切口加浸濕的棉花保濕，視溫濕度情況補充棉花水份；——接種量為每株5000頭~10000頭。49接蟲次數(shù)1a生以下實生苗接蟲1次~2次，1a生以上實生苗和無性系苗接蟲2次~3次。10感病指數(shù)按照線蟲為害輕重劃分為0級、Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級共5個等級，統(tǒng)計0級~Ⅳ級為害木的百分率，計算各病級的總代表數(shù)值，人工接蟲苗木情況動態(tài)記錄表見附錄A。11抗性評價待接蟲穩(wěn)定表現(xiàn)后，統(tǒng)計成活率，測定苗高生長量。按成活率和相對苗高生長量加權(quán)計算各苗木的抗性。12技術檔案管理松樹苗期抗性檢測要求從線蟲