艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法

艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第1頁艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第2頁HIV病毒模式圖HIV病毒顆粒由基因組RNA、外膜蛋白Env、衣殼蛋白Gag、逆轉(zhuǎn)錄酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN組成艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第3頁HIV生活周期吸附－穿入－脫殼－生物合成－組裝成熟和釋放艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第4頁HIV基因組模式圖艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第5頁我國及國際兩種不一樣抗HIV治療方案效果比較治療方案我國治療病毒抑制效果國際治療病毒抑制效果平均治療時間(月)載量<LDL例數(shù)總例數(shù)病毒抑制率(%)AZT+ddI+NVP7.5197027.1%a45%d4T+ddI+NVP3.910613876.8%b85%注：上標(biāo)字母相同表示組間無顯著差異，上標(biāo)字母不一樣表示組間差異顯著艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第6頁項目周期:五年,年7月-年6月。第一期兩年，年7月-年6月．全球基金將依據(jù)第一期執(zhí)行情況確定后三年投入。項目實施地域：廣西、貴州、湖南、江西、四川、新疆、云南７個省（自治區(qū)），35個地(州、市），76個項目縣（市、區(qū)）。178云南63江西95湖南105貴州7635累計115新疆104四川135廣西縣（市、區(qū)）地(州、市)項目省艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第7頁

總經(jīng)費預(yù)算：五年總經(jīng)費為9807萬美元,其中全球基金支持約6374萬美元,中國政府配套約3433萬美元.配套百分比逐年增加，由第一年20%，增加到第五年50%。

兩年經(jīng)費預(yù)算：二年預(yù)算約為3100萬美元,其中全球基金支持約2400萬美元,中國政府配套約700萬美元.

。

全球基金支持經(jīng)費配套經(jīng)費項目總經(jīng)費廣西3,605,6091,060,6364,666,245貴州2,365,191697,4453,062,636湖南2,487,791724,4503,212,241江西1,735,176506,2112,241,387四川2,623,645771,1363,394,781新疆3,137,663922,7394,060,402云南4,470,6641,310,9545,781,618中央3,511,1781,002,3204,513,498累計23,936,9176,995,89130,932,808艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第8頁目標(biāo)六：建立服務(wù)網(wǎng)絡(luò)，確保針對艾滋病病人/感染者開展治療、關(guān)心和支持等活動開展，包含母嬰阻斷?；顒樱涸陧椖渴〗⒑瓦\轉(zhuǎn)耐藥監(jiān)測試驗室,開展耐藥監(jiān)測工作,幫助擴展和改進國家耐藥監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)各省省級建立試驗室定為哨點項目縣按方案采集血樣艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第9頁需要了解主題:

什么是耐藥性?

藥品作用靶點與機制?

與病毒哪些基因相關(guān)?

耐藥性是怎么產(chǎn)生?

那些原因促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?

耐藥性分類與耐藥機制。怎樣檢測耐藥株?

檢測中注意事項。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第10頁什么是HIV耐藥性?

HIV耐藥性是指病毒經(jīng)過本身遺傳變異，產(chǎn)生對藥品抑制作用，使藥品敏感性降低或不敏感現(xiàn)象。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第11頁什么是HIV耐藥性?藥品濃度病毒抑制率(%)野生型病毒耐藥株1000IC50,WTIC50,MT50耐藥倍數(shù)IC50=50%抑制濃度艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第12頁藥品作用靶點與機制?艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第13頁藥品作用靶點與機制：全國艾滋病定點醫(yī)院檢測技術(shù)研討班艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第14頁AntiretroviralDrugs

NRTIs NNRTIs PIsZidovudine Nevirapine* SaquinavirDidanosine Delavirdine RitonavirStavudine Efavirenz* IndinavirLamivudine* Nelfinavir*Zalcitabine AmprenavirAbacavir Lopinavir/r

Combivir AtazanavirTrizivir FosamprenavirDidanosineECStavudineSR FTC NucleotideRTITenofovirEntryInhibitorsT20 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第15頁藥品作用靶點與機制：藥品作用機制核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑被靶細(xì)胞細(xì)胞酶磷酸化后，以三磷酸形式與天然三磷酸競爭，從而參加病毒DNA合成，因為該抑制劑經(jīng)過化學(xué)修飾，將造成病毒DNA鏈合成終止。非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是一組結(jié)構(gòu)多樣化化合物，經(jīng)過非競爭性方式結(jié)合于或者靠近于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性位點，從而抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性。蛋白酶抑制劑肽類似物，經(jīng)過接合于病毒蛋白酶活性位點來抑制酶活性，使之不能將病毒合成多聚前體蛋白水解為病毒各種結(jié)構(gòu)蛋白和酶組成個別。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第16頁耐藥性是怎么產(chǎn)生?

病毒本身原因—內(nèi)因藥品選擇壓力—外因艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第17頁耐藥性是怎么產(chǎn)生?

病毒本身原因—內(nèi)因—HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）不含有DNA聚合酶校正功效，所以，在復(fù)制過程中，病毒核酸表現(xiàn)出高度錯誤傾向性。

—在病毒高速復(fù)制過程中，高頻率突變在很短時間內(nèi)隨時發(fā)生。

每個復(fù)制周期產(chǎn)生一個突變點；

天天產(chǎn)生109

–1010

個新病毒；病毒基因組中平均每個堿基天天突變一次艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第18頁耐藥性是怎么產(chǎn)生?藥品選擇壓力—外因—在藥品選擇壓力下，耐藥變異株完全取代藥品敏感株最快能發(fā)生在14至28天內(nèi)。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第19頁“Wild”typevirus

(drugsusceptible)“Mutant”virus

(drugresistant)DrugPressureTIMEViralDynamicsandDrugResistanceViralLoad&ReplicationRate艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第20頁ViralLoad&ReplicationRateTIMELowReplicationRate&ViralLoadLess“fit”virusPressure:DrugAPressure:DrugBPressure:DrugC,....(Combined)UseofActiveAntiretroviralAgents艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第21頁耐藥性是怎么產(chǎn)生?—耐藥株是在病毒自發(fā)性、高頻率基因突變中產(chǎn)生，在藥品選擇性壓力下優(yōu)勢復(fù)制結(jié)果。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第22頁那些原因促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?病毒載量耐藥株出現(xiàn)時間300,0000.130,00013,00010300100301,0001.艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第23頁那些原因促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?病毒學(xué)失敗率(%)020406080100>9590-9580-9070-80<70服藥依從性

(%)82.171.466.754.621.72.艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第24頁那些原因促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?服藥依從性

(%)2.艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第25頁那些原因促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?藥品配伍不妥—藥代顯著不一樣藥品配伍3.024483612時間(小時)藥品濃度潛在病毒復(fù)制區(qū)IC90IC50最終一次用藥

第一天第二天單藥治療S.Tayloretal.11thCROIAbs131艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第26頁那些原因促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?—細(xì)胞周期依賴性藥品AZT,D4T(活化期細(xì)胞)DDI(靜止相細(xì)胞)蛋白酶抑制劑(活化期細(xì)胞)—非細(xì)胞周期依賴性藥品3TC,FTC,AbacavirTenofovirNNRTIs3.藥品配伍不妥—缺乏對某一時相細(xì)胞內(nèi)病毒抑制或抑制不足艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第27頁那些原因促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?—胃腸道吸收不好：嘔吐，腹瀉；—隨意間歇服藥；—與中藥或其它藥品同時服用。4.其它原因艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第28頁什么是好治療方案?—能快速抑制病毒；—不易產(chǎn)生耐藥性；—可長久維持；艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第29頁耐藥性分類1、原發(fā)性耐藥(Primaryresistance):病人在接收抗病毒治療前產(chǎn)生了藥品作用靶點變異，或者感染了耐藥毒株，均降低抗病毒藥品敏感性。在已經(jīng)開展HAART國家普遍存在，感染了耐藥毒株病人很輕易引發(fā)藥品治療失敗。2、繼發(fā)性耐藥(Secondaryresistance):病人已經(jīng)接收了抗病毒治療并產(chǎn)生治療失敗，在藥品選擇壓力下產(chǎn)生耐藥。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第30頁耐藥機制：

核苷和核苷類似物1、破壞核苷類似物結(jié)合病毒DNA能力

M184V突變:RT酶第184位密碼子氨基酸由蛋氨酸(M)變成為纈氨酸(V)

。拉米夫定(Lamivudine)Q151Mmutation:在HIV-1中出現(xiàn)低于

5%；HIV-2中出現(xiàn)頻率較高。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第31頁耐藥機制：2、切除病毒DNA鏈末端核苷類似物Thymidineanaloguesmutations:突變引發(fā)ATP或者焦磷酸介導(dǎo)切除DNA鏈3‘末端核苷類似物。核苷和核苷類似物艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第32頁耐藥機制：非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)

突變降低了抑制劑對酶結(jié)協(xié)力。不一樣于核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，其單一突變就能造成高度耐藥。如K103N、Y181C。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第33頁耐藥機制：K103N突變機制艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第34頁耐藥機制：蛋白酶抑制劑

HIV蛋白酶由兩個一樣蛋白質(zhì)鏈組成。這兩個蛋白質(zhì)鏈在一起就如同核桃兩半，而蛋白酶活性位點就在兩個半殼中間。

艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第35頁突變點表示方法：

基因突變通常以字母－數(shù)字－字母書寫方式來表示，第一個字母代表野生型病毒株特定密碼子處氨基酸，第二個字母代表在特定密碼子處替換了氨基酸，中間數(shù)字表示突變點位置。比如：逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）K103N突變表示逆轉(zhuǎn)錄酶第103位密碼子氨基酸由天冬酰胺（K）變成為賴氨酸（N）。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第36頁怎樣檢測耐藥株：

當(dāng)前耐藥性檢測有兩種方法，即表型檢測及基因型檢測。表型檢測經(jīng)過用藥期間病毒培養(yǎng)進行，而基因型檢測則經(jīng)過分子生物學(xué)方法檢測與耐藥性相關(guān)病毒基因突變?；蛐蜋z測費用較低，技術(shù)也相對輕易，可在樣品搜集后1～2周得到結(jié)果，但分析基因型耐藥檢測時，需要掌握大量相關(guān)知識，如突變與抗病毒藥品及其它藥品交叉耐藥等，才能對結(jié)果進行正確分析。表型檢測能夠直接檢測病毒耐藥性，但操作復(fù)雜、耗時，技術(shù)要求高，且非常昂貴，所以當(dāng)前國際上廣泛應(yīng)用于臨床是基因型耐藥檢測。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第37頁怎樣檢測耐藥株：TranslationintolinearstringofaminoacidsFoldingintofunctionalproteinHIVRNA表型檢測基因型檢測基因型和表型檢測艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第38頁檢測中注意事項:—在病人仍在治療失敗方案上搜集樣品，可保證耐藥株占總病毒量20%以上；—病毒載量<1000時,可出現(xiàn)假陰性。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第39頁我國HIV耐藥性本底抽樣調(diào)查結(jié)果 1)對于RT基因區(qū)共完成對21個省區(qū)共143個樣本測序，僅有2例發(fā)覺含有輕微耐藥（占總樣本數(shù)1.4%）

2)對于蛋白酶基因區(qū)此次調(diào)查共完成20個省區(qū)168個樣本分析，僅發(fā)覺有2例樣本（占總樣本數(shù)1.21%）含有輕微耐藥。 結(jié)論：當(dāng)前我國HIV耐藥性處于較低狀態(tài)，對于幾乎全部藥品敏感，我國抗HIV藥品使用假如有計劃開展，應(yīng)該會有很好效果，但應(yīng)加強治療依從性促進工作和耐藥毒株監(jiān)測工作。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第40頁HIV基因型耐藥性檢測

（序列測定法）艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第41頁檢測流程病人血漿標(biāo)本HIVRNA病毒cDNAHIVRT和PR基因片段序列測定結(jié)果解釋RNA提取逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增特定解釋系統(tǒng)艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第42頁標(biāo)本新鮮EDTA抗凝血漿，或-80℃保留，防止重復(fù)凍融艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第43頁病毒RNA提?。≦iagen企業(yè)試劑盒）裂解標(biāo)本，滅活RNA酶加到離心柱中，RNA與硅膠膜結(jié)合洗兩次，去除雜質(zhì)用無RNA酶緩沖液洗脫RNA搜集RNA備用優(yōu)點：操作簡便、快速、得率高艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第44頁逆轉(zhuǎn)錄RNAcDNA

反應(yīng)體系：

10XBuffer1ldNTP0.5l

外側(cè)反向引物1lRNaseinhibitor0.25lM-MuLVRT0.25lDEPC水2lRNA模板5l42℃水浴1小時，95℃5分鐘滅活RT艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第45頁巢式PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因第一輪擴增反應(yīng)體系：

10XBuffer5lMgCl23ldNTP1l

外側(cè)正向引物1l

外側(cè)反向引物1lTaq酶0.5l

水29.5lcDNA模板10l

94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循環(huán)艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第46頁巢式PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因第二輪擴增反應(yīng)體系：

10XBuffer5lMgCl23ldNTP1l

內(nèi)側(cè)正向引物1l

內(nèi)側(cè)反向引物1lTaq酶0.5l

水29.5l

第一輪擴增產(chǎn)物10l

94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循環(huán)艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第47頁擴增產(chǎn)物判定：瓊脂糖凝膠電泳艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第48頁擴增產(chǎn)物純化QIAquickGelextraction試劑盒核酸序列測定雙脫氧鏈末端終止法艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第49頁:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTRT:AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第50頁利用網(wǎng)絡(luò)工具確定耐藥性突變并進行耐藥性解釋

Web站點：

HIVDrugResistanceAlgorithm2

HIVDrugResistanceAlgorithm3

HIVDrugresistancedatabase

HIVDrugResistanceAlgorithm1艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第51頁高度耐藥：大于60分中度耐藥：30－59分低度耐藥：15－29分潛在低度耐藥：10－14分敏感：0－9分耐藥性突變計分艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第52頁HIV-1耐藥性檢測臨床指征：（1）抗病毒治療病毒學(xué)失敗需要改變抗病毒治療方案時應(yīng)進行耐藥性檢測以幫助選擇有效抗病毒藥品。（2）抗病毒治療病毒載量下降不理想時可進行HIV-1耐藥性檢測。（3）抗病毒治療失敗需要進行耐藥性檢測時，應(yīng)該在病人仍在服藥時或停藥后馬上（4周內(nèi)）進行檢測。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第53頁HIV-1耐藥性檢測臨床指征：（4）急性HIV－1感染病人進行抗病毒治療，最好進行耐藥性檢測，對于選擇適當(dāng)抗病毒藥品、取得最正確抗病毒效果很有益處。（5）對于未經(jīng)抗病毒治療慢性HIV感染者不一定要做耐藥性檢測，但當(dāng)有跡象顯示感染是耐藥性HIV毒株時（比如感染來自于正在服用抗病毒藥品病人），就應(yīng)該進行耐藥性檢測。（6）不推薦對病毒載量<1000cp/ml病人做病毒載量檢測，因為病毒水平太低極難擴增出目標(biāo)基因片段

艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第54頁耐藥性檢測結(jié)果解釋

HIV-1耐藥性不是全或無現(xiàn)象，基因型和表型耐藥性檢測結(jié)果分析和解釋都有困難

全部抗病毒治療都是聯(lián)適用藥，他們之間是相互協(xié)同，即對一個藥品敏感性降低并不干擾同一治療方案中其它藥品抗病毒活性。

藥品即使有耐藥性也可能有益處，因為有耐藥性突變病毒比敏感毒株復(fù)制適應(yīng)性要差得多。

血清中藥品水平，尤其是蛋白酶類藥品是高度改變，假如能夠提升血清中蛋白酶類藥品濃度，低水平蛋白酶耐藥性有時能夠被克服。艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第55頁NucleosideResistanceMutationsZidovudine 41,67,70,210,215,219(TAMs)Didanosine 65,74,75,184Zalcitabine 65,69,74,184Stavudine 41,67,70,75,210,215,219(TAMs)Lamivudine 184Abacavir 41,65,67,70,74,115,184,210,215,219MultinucleosideResistanceMultipleTAMs 41,67,70,210,215,21969insertioncomplex 41,62,67,69,70,210,215,219151complex 62,75,77,116,151艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第56頁NNRTIResistanceMutationsNevirapine 100,103,106,108,181,188,190,230Delavirdine 103,181,230,236Efavirenz 100,103,108,188L,190,225,230艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法第57頁ProteaseResistanceMutationsIndinavir 10,20,24,46,63,64,82,84,90Nelfinavir 30,35,36,46,71,84,88,90Ritonavir 8,10,20,33,36,54,63,71,82,84,90Saquinavir 10,24,30,46,48,54,63,64,71,73,77, 81,84,88,90Amprenavir 10,32,46,47,