原核生物的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控

關(guān)于原核生物的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控第2頁,共60頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄

(

transcription

)——生物體以DNA為模板按5’

3’方向合成RNA的過程轉(zhuǎn)錄RNADNA

第3頁,共60頁，2024年2月25日，星期天參

與

轉(zhuǎn)

錄

的

物

質(zhì)：原料:4種NTP

(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA

酶:RNA聚合酶其他蛋白質(zhì)因子第4頁,共60頁，2024年2月25日，星期天A.原核生物的轉(zhuǎn)錄一、轉(zhuǎn)錄概述二、轉(zhuǎn)錄的基本過程三、大腸桿菌RNA聚合酶四、轉(zhuǎn)錄的機(jī)制第5頁,共60頁，2024年2月25日，星期天一、轉(zhuǎn)錄概述第6頁,共60頁，2024年2月25日，星期天起始點

(startpoint)：合成第一個RNA堿基的位置，用“+1”表示。啟動子(promoter)：位于轉(zhuǎn)錄起始點前，和RNA聚合酶結(jié)合的一段DNA序列。終止子

(terminator)：使RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。轉(zhuǎn)錄單位

(transcriptionunit)：從啟動子到終止子間的一段DNA序列?；拘g(shù)語：第7頁,共60頁，2024年2月25日，星期天上游序列：基因中起始點前面的序列，用

“-”

表示下游序列：在起始點后面的序列，用

“+”

表示初級轉(zhuǎn)錄本：剛轉(zhuǎn)錄完成的RNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄泡：RNA聚合酶與啟動子結(jié)合后形成的DNA解旋區(qū)。轉(zhuǎn)錄泡可和RNA聚合酶一起沿DNA鏈移動，RNA合成在轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)進(jìn)行?；拘g(shù)語：第8頁,共60頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄泡的結(jié)構(gòu)當(dāng)RNA聚合酶沿DNA模板移動時，它打開泡前的DNA雙螺旋（在解鏈點打開），并在復(fù)鏈點使DNA復(fù)原。轉(zhuǎn)錄泡的長度隨增長反應(yīng)階段而異，在12-20bp之間(17bp)，但其中的RNA-DNA雜合雙螺旋區(qū)域比這個長度要短(12bp)。第9頁,共60頁，2024年2月25日，星期天二、轉(zhuǎn)錄的基本過程1.識別啟動子RNA聚合酶識別啟動子，并在啟動子處結(jié)合形成一個“轉(zhuǎn)錄泡”，轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)的DNA雙鏈解開，為RNA合成提供模板。轉(zhuǎn)錄泡有義鏈模板鏈，反義鏈第10頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.轉(zhuǎn)錄起始a.轉(zhuǎn)錄起始無需引物。b.流產(chǎn)起始：轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈的過程是通過啟動子階段，此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū)域，新生RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開始，這一過程稱為流產(chǎn)起始。c.啟動子清除：一旦RNA聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟動子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄就進(jìn)入正常的延伸階段，這一過程稱為啟動子清除。d.通過啟動子的時間代表一個啟動子的強(qiáng)弱，時間越短表明該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率越高。第11頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3.鏈的延伸RNA聚合酶沿DNA模板鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程。大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒50-90個核苷酸。酶移動時局部解旋DNA；酶經(jīng)過之后，

DNA又重新形成雙螺旋。第12頁,共60頁，2024年2月25日，星期天4.鏈的終止和釋放當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都從模板上釋放出來，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。第13頁,共60頁，2024年2月25日，星期天三、大腸桿菌RNA聚合酶1.RNA聚合酶的功能a.RNA合成b.合成起始和終止位點的識別c.確定與DNA結(jié)合位點的結(jié)合與脫離的時間等第14頁,共60頁，2024年2月25日，星期天核心酶

coreenzyme全酶

holoenzyme

全酶至少含5個亞基：

2、、’、

，是轉(zhuǎn)錄起始所必需的。

2、和

’亞基組成核心酶，種間基本沒有變化；

因子存在廣泛的種間變異，用于識別不同的啟動子。2.RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)第15頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2)

因子的功能：使RNA聚合酶特異性地與啟動子結(jié)合。大腸桿菌中最常見的

因子是

70核心酶不能區(qū)分DNA的啟動子和其它序列，它與DNA非選擇性結(jié)合形成松散型復(fù)合體。

因子是通過將核心酶對非特異序列的親和力降低104倍，同時增加其對啟動子的親和力來幫助啟動子識別的。RNA鏈延伸至8-9nt時，

因子會從RNA聚合酶中釋放出來，它可以再與其他核心酶結(jié)合重新起始轉(zhuǎn)錄。第16頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3.RNA聚合酶在細(xì)胞內(nèi)的分布形式1)很少有游離的核心酶和全酶2)細(xì)胞內(nèi)

因子數(shù)量只有核心酶的30%，因此在任何時刻只有1/3的聚合酶能以全酶的形式存在。第17頁,共60頁，2024年2月25日，星期天四、轉(zhuǎn)錄的機(jī)制1.啟動子識別和轉(zhuǎn)錄起始1)在RNA聚合酶開始鏈延長前，它與DNA的相互作用經(jīng)歷了4個階段：a.RNA聚合酶與處于堿基配對狀態(tài)的啟動子序列結(jié)合形成閉合復(fù)合物。b.DNA的初始解旋導(dǎo)致DNA與聚合酶形成開放復(fù)合物，這一過程稱為緊密結(jié)合。c.進(jìn)行多次流產(chǎn)起始d.起始成功后，聚合酶釋放

因子，形成聚合酶-DNA-新生RNA的三聚復(fù)合物，RNA鏈開始延伸。第18頁,共60頁，2024年2月25日，星期天RNApol是如何發(fā)現(xiàn)正確的起點而啟動基因轉(zhuǎn)錄的呢？第19頁,共60頁，2024年2月25日，星期天1)啟動子的識別取決于共有序列保守性序列：每個啟動子都包括一個能被RNA聚合酶識別的特征DNA序列。共有序列：是根據(jù)保守性序列總結(jié)出的一種理想序列，它的每一個位置代表了很多實際序列中最經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的堿基。典型的啟動子有3個共有序列：-35序列、-10序列和起始點序列-35序列-10序列起始點TTGACATATAATAC－TG16-18bp5-8bp+1Pribnow框Sextama框第20頁,共60頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌啟動子有４個保守性特征：轉(zhuǎn)錄起始點：開始堿基90%是嘌呤，G比A更常見。-10序列：起始點上游一個6bp區(qū)，這個六聚體的中心靠近起始點上游的第10堿基對，它的共有序列是TATAAT。-10序列是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點，是聚合酶啟動DNA解旋的序列。因此，-10序列可通過影響開放復(fù)合物的形成速度而控制轉(zhuǎn)錄。-35序列：也是一個六聚體，其中心位于-35堿基對處，它的共有序列是TTGACA，是RNA聚合酶的識別位點。-35和-10序列之間的距離十分重要，在90%的啟動子中變動在16和18個堿基之間，兩序列間為17bp時轉(zhuǎn)錄效率最高。-35序列-10序列起始點TTGACATATAATAC－TG16-18bp5-8bp+1第21頁,共60頁，2024年2月25日，星期天啟動子的突變影響它所控制的基因的轉(zhuǎn)錄水平而不改變轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：

下降突變：TATAAT

AATAAT

上升突變：TATGTT

TATATT-35序列的作用是為RNA聚合酶的識別提供信號，而-10序列使復(fù)合物由閉合轉(zhuǎn)化為開放。所以我們可以認(rèn)為-35序列包括一個識別結(jié)構(gòu)域，而-10序列包括一個解鏈結(jié)構(gòu)域。起始點周圍的堿基序列對起始作用也有影響，起始轉(zhuǎn)錄區(qū)間（+1→+30）影響RNA聚合酶沿啟動子滑動的速度從而影響啟動子的強(qiáng)度。第22頁,共60頁，2024年2月25日，星期天4)

轉(zhuǎn)錄起始的效率不同啟動子的起始效率有差異。不同啟動子與全酶的結(jié)合緊密程度不同，結(jié)合的緊密程度與啟動子起始轉(zhuǎn)錄的效率有關(guān)。轉(zhuǎn)錄起始受調(diào)節(jié)蛋白控制。啟動子上游序列可能增強(qiáng)啟動子的活性。負(fù)超螺旋狀態(tài)有利于轉(zhuǎn)錄起始，是因為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)需較少的自由能，就可使起始復(fù)合物中的雙鏈解開。第23頁,共60頁，2024年2月25日，星期天5)特定類型基因的轉(zhuǎn)錄由不同的

因子控制在細(xì)胞中不止一種

因子RNA聚合酶起始一些基因的轉(zhuǎn)錄需要特殊的

因子不同大腸桿菌

因子識別不同的啟動子在噬菌體中通過

因子的改變控制不同時期基因的表達(dá)。第24頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.RNA鏈的延伸a.全酶結(jié)合在啟動子后，開始不斷的流產(chǎn)起始，直至移出啟動子區(qū)域，才進(jìn)行鏈的延伸。b.當(dāng)RNA聚合酶全酶剛結(jié)合上DNA時，它覆蓋75-80bp，從-55延伸至+20，在起始階段它保持著這個位置。c.進(jìn)入鏈延伸階段后，

因子被釋放，RNA聚合酶不再覆蓋-55到-35的DNA，只剩下約60bp被RNA聚合酶所覆蓋。第25頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3.

鏈的終止RNA鏈停止增長，并與DNA模板鏈分離。終止子：促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列，在RNA水平上通過轉(zhuǎn)錄出的終止子序列形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)而起作用。可分為兩類：不依賴于

因子的終止子（內(nèi)在終止子）依賴于

因子的終止子第26頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（1）不依賴于

因子的終止子核心酶可以在沒有任何其它輔助因子的情況下，在某些終點終止，這些位點稱為不依賴于

因子的終止子

。特征：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中包含發(fā)卡狀的二級結(jié)構(gòu)（7-20bp）和3’末端連續(xù)4個或更多的U殘基，發(fā)卡莖部結(jié)構(gòu)中富含G-C。第27頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2)依賴于

因子（rho）的終止子需要Rho的存在才能終止反應(yīng)。特征：在終止點前有一段富含C但缺乏G的區(qū)段。這段堿基越長，終止效率越高。第28頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

因子：46KD的蛋白，功能形式是六聚體，是RNA聚合酶的一個輔助因子，只在鏈終止時起作用。

因子具有ATPase的活性，結(jié)合在終止點上游的RNA新生鏈的某個位置，然后可能沿RNA鏈向RNA聚合酶移動，如果趕上暫停在終止點的RNA聚合酶，合成就終止。如果沒有

因子因子存在，聚合酶暫停在終止子后，又繼續(xù)RNA合成。第29頁,共60頁，2024年2月25日，星期天B.原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控一、基因表達(dá)的調(diào)控水平二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子三、操縱子的一般類型四、乳糖操縱子五、色氨酸操縱子第30頁,共60頁，2024年2月25日，星期天一、基因表達(dá)的調(diào)控水平1.DNA水平：基因丟失、擴(kuò)增、重排、甲基化等2.轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)是最為經(jīng)濟(jì)的一種方式。3.轉(zhuǎn)錄后加工水平：RNA初級轉(zhuǎn)錄本本身可以是調(diào)節(jié)的目標(biāo)。例如，它的穩(wěn)定性與它能否被翻譯有關(guān)。4.翻譯水平：和轉(zhuǎn)錄水平一樣，翻譯水平的調(diào)控也包括起始和終止的調(diào)控。機(jī)體可以在基因表達(dá)過程的任何階段進(jìn)行調(diào)控，一般以轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控為主。第31頁,共60頁，2024年2月25日，星期天二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子操縱子是原核生物基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的基本形式。一個操縱子包括一個上游的調(diào)控區(qū)和一個以上的結(jié)構(gòu)基因組成。調(diào)控區(qū)包含啟動子和操縱基因兩部分。該區(qū)控制連鎖在一起的多個基因的轉(zhuǎn)錄。1.操縱子第32頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)物的任何基因。細(xì)菌的結(jié)構(gòu)基因常以基因簇的形式存在?；虼刂谢虻木幋a產(chǎn)物功能上是相關(guān)的。例如，編碼同一代謝途徑中酶的基因常存在于同一基因簇?；虼刂谢蚰苁軉我粏幼拥墓餐刂?，結(jié)果是整簇基因或者都表達(dá)或者都不表達(dá)。二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子第33頁,共60頁，2024年2月25日，星期天例如：lac基因簇（乳糖操縱子中的三個結(jié)構(gòu)基因）

-半乳糖苷分解酶

-半乳糖苷透性酶硫代半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶Plac原核生物操縱子中的全部結(jié)構(gòu)基因從同一個啟動子開始轉(zhuǎn)錄成一個多順反子的mRNA分子。第34頁,共60頁，2024年2月25日，星期天二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子3.操縱基因：是原核生物的操縱子中調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點，為控制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。4.調(diào)節(jié)基因：僅指參與其他基因表達(dá)調(diào)控的RNA和蛋白質(zhì)的編碼基因。調(diào)節(jié)基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白通過與DNA上的操縱基因結(jié)合而控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵。第35頁,共60頁，2024年2月25日，星期天5.反式作用因子與順式作用元件基因表達(dá)的產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或RNA）從合成的場所擴(kuò)散到目標(biāo)場所而發(fā)揮作用的過程稱為反式作用（trans-acting），此基因表達(dá)產(chǎn)物被稱為反式作用因子（trans-actingfactor）

。反式作用因子通常為蛋白質(zhì)或RNA，其特征為可以從合成地擴(kuò)散到目標(biāo)場所發(fā)揮作用。二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子第36頁,共60頁，2024年2月25日，星期天順式作用元件（cis-actingfactor）是指對結(jié)構(gòu)基因表達(dá)有調(diào)節(jié)活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處在一個DNA分子上的基因。順式作用元件通常不編碼蛋白質(zhì)，多位于基因旁側(cè)或內(nèi)含子中。順式作用（cis-acting）的概念用于任一不轉(zhuǎn)變?yōu)槿魏纹渌问降腄NA序列，它只在原位發(fā)揮DNA序列的作用，僅影響與其物理上相連的DNA序列的活性?；蚧钚缘恼{(diào)控主要通過反式作用因子（通常是蛋白質(zhì)）和順式作用元件（通常在DNA上）相互作用而實現(xiàn)。第37頁,共60頁，2024年2月25日，星期天位于轉(zhuǎn)錄開始和結(jié)束位置上的DNA序列如啟動子、終止子都是典型的順式作用元件，能受同一類反式作用因子RNA聚合酶的識別。操縱基因（O）是位于操縱子前端部分的順式作用元件，它能和調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)蛋白是調(diào)節(jié)基因的表達(dá)產(chǎn)物，是參與操縱子調(diào)節(jié)的反式作用因子。第38頁,共60頁，2024年2月25日，星期天6.負(fù)調(diào)控與正調(diào)控負(fù)調(diào)控：基因的表達(dá)處于啟動狀態(tài)，但是調(diào)節(jié)蛋白與操縱基因的結(jié)合關(guān)閉了基因的表達(dá)。第39頁,共60頁，2024年2月25日，星期天正調(diào)控：基因的表達(dá)處于關(guān)閉狀態(tài)，調(diào)節(jié)蛋白與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因才能表達(dá)。第40頁,共60頁，2024年2月25日，星期天7.誘導(dǎo)作用和阻抑作用細(xì)菌應(yīng)答某種特定物質(zhì)出現(xiàn)而合成特定酶的過程，稱為誘導(dǎo)作用（induction）。大腸桿菌乳糖操縱子是這種機(jī)制最好的范例。如果某種小分子物質(zhì)能夠開啟操縱子的轉(zhuǎn)錄，這種小分子物質(zhì)就叫做誘導(dǎo)物（inducer）。誘導(dǎo)物在誘導(dǎo)物－抑制子復(fù)合體中使抑制子失去抑制作用。二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子第41頁,共60頁，2024年2月25日，星期天三、操縱子的一般類型1.誘導(dǎo)型操縱子調(diào)節(jié)基因（R）組成型表達(dá)抑制子與抑制子作用的的小分子物質(zhì)是誘導(dǎo)物，通常是即將被分解的糖或代謝物。只有當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，抑制子被失活，操縱子才表達(dá)，表達(dá)的產(chǎn)物(酶)分解該誘導(dǎo)物。利用類似自然誘導(dǎo)物的物質(zhì)可以誘導(dǎo)基因表達(dá)，但不能被酶分解，這類誘導(dǎo)物稱為義務(wù)誘導(dǎo)物（安慰誘導(dǎo)物），如IPTG（異丙基-

-D-硫代半乳糖苷）。第42頁,共60頁，2024年2月25日，星期天mRNARPOABCDNARI產(chǎn)物RPOABCDNARmRNA＋I(xiàn)ABC不表達(dá)RI:

無活性的抑制子表達(dá)R:有活性的抑制子無I例如：誘導(dǎo)物存在時：誘導(dǎo)物缺乏時：第43頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.阻遏型操縱子調(diào)節(jié)基因組成型表達(dá)能被輔阻遏物激活的抑制子。和抑制子相互作用的小分子物質(zhì)是輔阻遏物，通常是合成代謝的末端產(chǎn)物，例如氨基酸。只有當(dāng)缺乏輔阻遏物時，操縱子才表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物是合成該輔阻遏物所必需的。三、操縱子的一般類型第44頁,共60頁，2024年2月25日，星期天例如：mRNARPOABCDNAR產(chǎn)物RPOABCDNACo-RmRNAABC不表達(dá)表達(dá)+Co缺乏輔阻遏物時：輔阻遏物存在時：Co-R:

有活性的抑制子R:無活性的抑制子第45頁,共60頁，2024年2月25日，星期天四、乳糖操縱子1.結(jié)構(gòu)基因：a.乳糖操縱子包括-6000bpofDNA。b.乳糖操縱子（lactoseoperon，lac）的三個結(jié)構(gòu)基因成簇排列，編碼參與β-半乳糖苷（如乳糖）分解代謝所需的三種蛋白質(zhì)：lacZ編碼β-半乳糖苷酶，lacY編碼β-半乳糖苷透性酶，lacA編碼β-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；?。第46頁,共60頁，2024年2月25日，星期天lacI基因（調(diào)節(jié)基因）正好與結(jié)構(gòu)基因相鄰，但它不與結(jié)構(gòu)基因?qū)儆谕晦D(zhuǎn)錄單位，它有自己獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位，含有自己的啟動子和終止子。lacI編碼可擴(kuò)散的產(chǎn)物，理論上它不必位于結(jié)構(gòu)基因附近。將lacI基因轉(zhuǎn)移到其他任何地方都能很好地發(fā)揮作用，因此lacI的表達(dá)產(chǎn)物屬于反式作用因子。Lac阻抑蛋白的單體結(jié)構(gòu)：包含幾個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域第47頁,共60頁，2024年2月25日，星期天lacI基因的表達(dá)產(chǎn)物稱為乳糖操縱子阻抑蛋白（lacrepressor）。LacI阻抑蛋白通過與操縱基因結(jié)合使Lac操縱子處于不活躍狀態(tài)。因此，乳糖操縱子的調(diào)控屬于負(fù)調(diào)控。第48頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3.誘導(dǎo)物的添加影響了阻抑蛋白與操縱基因的結(jié)合能力，使阻抑蛋白從操縱基因上釋放出來，從而啟動轉(zhuǎn)錄。第49頁,共60頁，2024年2月25日，星期天乳糖第50頁,共60頁，2024年2月25日，星期天五、色氨酸操縱子色氨酸操縱子的基本特征：5個結(jié)構(gòu)基因，trpE,D,C,B,A。

控制區(qū)包括：啟動子，操縱基因，前導(dǎo)序列和弱化子

。

調(diào)節(jié)基因trpR與操縱基因trpO不連在一起。色氨酸是一個輔阻遏物，與trpR產(chǎn)物構(gòu)成有活性的抑制復(fù)合體。

表達(dá)通過阻遏和弱化兩種方式控制。第51頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.阻遏方式Trp操縱基因序列長21bp，是trp阻抑蛋白的作用位點。五、色氨酸操縱子第52頁,共60頁，2024年2月25日，星期天(1)trpE基因前有162個堿